分子生物學(xué)研究技術(shù)簡(jiǎn)介

分子生物學(xué)理論的產(chǎn)生與發(fā)展有賴于其技術(shù)體系的建立與進(jìn)步，有關(guān)分子生物學(xué)研究方法與手段方面的內(nèi)容，在專(zhuān)門(mén)的書(shū)籍中都有詳細(xì)的論述。出于對(duì)本書(shū)內(nèi)容的系統(tǒng)性和完整性方面的考慮，只簡(jiǎn)要地介紹分子生物學(xué)研究中最常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)與手段，其中有些內(nèi)容放在了相關(guān)的章節(jié)中(如質(zhì)粒DNA的提取純化、核酸的超速離心、凝膠電泳和分子雜交等在第2章)介紹。目前一頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)13.1DNA分子克隆的基本原理DNA重組技術(shù)興起于20世紀(jì)70年代初期。1972年Berg等將λ噬菌體基因和大腸桿菌乳糖操縱子插入到SV40DNA中，首次構(gòu)建了DNA重組體(recom-binant)。次年，Cohen和Boyer將細(xì)菌質(zhì)粒通過(guò)體外重組后導(dǎo)入大腸桿菌，得到了基因的分子克隆(molecularcloning)，由此誕生了基因工程。目前二頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)基因工程是對(duì)攜帶有遺傳信息的核酸分子進(jìn)行設(shè)計(jì)、重組和加工的分子工程，包括基因的重組、克隆和表達(dá)。這個(gè)術(shù)語(yǔ)既可用來(lái)表示對(duì)特定基因的操作，也可泛指它所涉及的相關(guān)技術(shù)體系，其核心是構(gòu)建重組體DNA，因此基因工程和重組體DNA技術(shù)有時(shí)是同義詞。目前三頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)重組體DNA技術(shù)是指在體外將不同來(lái)源的DNA分子進(jìn)行重新組合，并使它們?cè)谶m當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中實(shí)現(xiàn)增殖表達(dá)的遺傳操作。而基因工程技術(shù)是指在分子水平上進(jìn)行操作，在細(xì)胞水平上實(shí)現(xiàn)表達(dá)，其過(guò)程主要包括獲得目的基因片段，連入合適載體，轉(zhuǎn)入受體系統(tǒng)，篩選重組子和表達(dá)外源基因五個(gè)步驟。目前四頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)其特點(diǎn)是：第一，不受親緣關(guān)系的限制，打破了物種界限，把不同種類(lèi)生物的遺傳物質(zhì)組合在一起，人為地將高等生物的基因(如人胰島素基因)引入細(xì)菌，使其產(chǎn)生人胰島素。第二，可以定向地改變生物的遺傳特性，通過(guò)有目的的取得某種基因，并將該基因引進(jìn)原本沒(méi)有這種基因的生物體，改變后者的遺傳特性；第三、增加目的基因的劑量。目前五頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)由于生物體內(nèi)某些蛋白質(zhì)或其他組分的含量稀少且難以純化，使對(duì)這些物質(zhì)的詳盡分子結(jié)構(gòu)分析極其困難或幾乎不可能，更談不上對(duì)它們的生物利用。利用分子生物學(xué)技術(shù)可以解決這一生物學(xué)上的難題。目前六頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)13.2用于基因克隆的工具酶

在基因克隆中常用的主要工具酶見(jiàn)圖13-1。圖中顯示，這類(lèi)酶大體分為：①將DNA切開(kāi)的酶;②將四種堿基聚合的酶；③將DNA片段連接起來(lái)的酶；④DNA片段末端修飾的酶。這些酶的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用使基因操作成為可能。目前七頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前八頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前九頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前十頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)13.2.1DNA限制性內(nèi)切核酸酶1970年Smith等從流感嗜血桿菌中分離出特異切割DNA的限制性內(nèi)切核酸酶，簡(jiǎn)稱(chēng)為限制酶。1971年Danna和Nathans用此限制酶切割SV40DNA。繪制出第一個(gè)DNA限制酶切圖譜。此后數(shù)年從NNN菌中分離出了許多修飾性甲基化酶和限制性內(nèi)切核酸酶。目前十一頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)1973年Smith和Nathans提出修飾一限制酶的命名法：取分離菌屬名的第一個(gè)字母，種名的前兩個(gè)字母，如有株名也取一個(gè)字母，當(dāng)一個(gè)分離菌中不只一種酶時(shí)，以羅馬數(shù)字表示分離出來(lái)的先后次序。修飾性甲基化酶標(biāo)以M，限制酶標(biāo)以R。例如，最初分離到的限制酶是第2個(gè)分離的酶，應(yīng)稱(chēng)為R·HindII，但R通常省略不寫(xiě)；相應(yīng)的甲基化酶則為M·HindII。又如從大腸桿菌中分離到的甲基化酶為M·EcoRI，限制酶為EcoR工(圖13-2)。目前十二頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前十三頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)限制修飾系統(tǒng)主要有三類(lèi)：I、Ⅱ、Ⅲ型。(1)I型限制修飾系統(tǒng)是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)，為多亞基雙功能酶，對(duì)DNA的甲基化和切割由同一個(gè)酶完成。其甲基化及內(nèi)切酶活性緊密偶聯(lián)，兩類(lèi)反應(yīng)均需ATP和S-腺苷酰甲硫氨酸(SAM)。目前十四頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)

(2)Ⅱ型限制修飾系統(tǒng)修飾和限制活性由分開(kāi)的兩個(gè)酶完成。這類(lèi)甲基化酶由一條多肽鏈組成，限制酶由兩條相同的多肽鏈組成。其識(shí)別序列一般為4～6bp3的回文序列。目前十五頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)

由不同微生物分離得到的限制酶，如果識(shí)別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)相同，則稱(chēng)同裂酶(isoschizomers)；如僅僅是黏性末端突出的單鏈相同，稱(chēng)為同尾酶(isoeaudarners)。由同尾酶切割的限制片段彼此相連，不能再被原來(lái)的限制酶切割。表13-1顯示了部分限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列。目前十六頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)表13-1限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列(↓表示酶切位點(diǎn)) 酶識(shí)別序列Sau3AIBamHIEcoRIPstIHindIIISmaIINotI↓GATA/CTAG↓G↓GATCC/CCTAG↓GG↓AATTC/CTTAA↓GCTGCA↓G/G↓ACGTCA↓AGCTT/TTCGA↓ACCC↓GGG/GGG↓CCCGC↓GGCCGC/CGCCGG↓CG目前十七頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)(3)Ⅲ型限制修飾系統(tǒng)為兩個(gè)亞基的雙功能酶，M亞基負(fù)責(zé)識(shí)別與修飾，R亞基負(fù)責(zé)切割。其修飾與切割均需ATP提供能量，切封位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)下游24～26bp處。目前十八頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)限制酶的生物學(xué)功能在于降解外來(lái)的DNA，自身DNA的酶切位點(diǎn)由于修飾酶的甲基化而受到保護(hù)。在基因工程操作中限制酶可作為切割DNA分子的手術(shù)刀，用以制作DNA限制酶譜，分離限制片段，進(jìn)行DNA體外重組等，是十分有用的工具酶。目前十九頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)由于DNA的遺傳連鎖圖譜僅能顯示出遺傳標(biāo)記之間的相對(duì)距離，而Ⅱ型內(nèi)切酶總是在特定序列或其附近切割，根據(jù)這個(gè)原理可以獲得DNA的物理圖譜，從而顯示堿基對(duì)之間的實(shí)際距離。已繪制出的第一張DNA物理圖譜是猿猴病毒40(SV40)的圖譜。目前已經(jīng)測(cè)繪出許多種細(xì)菌、病毒和低等真核生物DNA的物理圖譜?！└叩日婧松?，包括人的DNA圖譜正在繪制之中。目前二十頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前二十一頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前二十二頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前二十三頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)酶切后產(chǎn)生限制性DNA片段的大小是物理圖譜的基礎(chǔ)。對(duì)特定的限制酶，切割位點(diǎn)之間距離越遠(yuǎn)，限制性片段就越長(zhǎng)。通過(guò)凝膠電泳?？梢詫⒋笮〔煌钠畏珠_(kāi)，依據(jù)片段的遷移率與已知片段比較，可判定未知片斷的大小。圖13-3顯示了一種對(duì)DNA片段上限制性酶切位點(diǎn)作圖的方法。目前二十四頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)表13-2給出了3類(lèi)限制性內(nèi)切酶的酶切特性。特性I型II型III型限制和修飾活性蛋白亞基數(shù)必需條件

宿主特異性位點(diǎn)序列

切割位點(diǎn)

酶活性轉(zhuǎn)換DNA轉(zhuǎn)運(yùn)甲基化位點(diǎn)功能不分開(kāi)3ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸(SAM)EcoB：TGANδTGCTEcoK：AACNδGTGC隨機(jī)，距宿主持異性位點(diǎn)1000bp以上無(wú)有宿主持異性位點(diǎn)功能分開(kāi)1Mg2+

旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)

在特異性位點(diǎn)上或其附近有無(wú)宿主特異性位點(diǎn)功能分開(kāi)2ATP、Mg2+(SAM)EcoP1：AGACCEcoP15：CAGCAG距宿主特異性位點(diǎn)3′端24~36bp有無(wú)宿主特異性位點(diǎn)目前二十五頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前二十六頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)13.2.2核酸的限制酶切圖譜與物理圖譜目前二十七頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)1.DNA限制酶切圖譜DNA的限制酶切圖譜指DNA限制酶切的片段沿著染色體或染色體片段上的DNA鏈中依次排列的順序。限制性內(nèi)切DNA(restrictionendonudease)是一類(lèi)能識(shí)別雙鏈DNA分子中特異核苷酸序列的DNA水解酶。目前二十八頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)限制內(nèi)切核酸酶的生物學(xué)功能在于降解外來(lái)的DNA，自身DNA的酶切位點(diǎn)由于修飾酶的甲基化而受到保護(hù)。在基因工程操作中，限制酶作為切割DNA分子的重要工具用以繪制DNA限制酶譜，進(jìn)行DNA體外重組等。它的發(fā)現(xiàn)為選擇性切割基因提供了極為方便的工具，使DNA的重組技術(shù)成為可能。目前二十九頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)2.DNA物理圖譜(physicalmap)DNA限制酶切圖譜并不是DNA的物理圖譜，物理圖譜指的是有關(guān)構(gòu)成基因組全部基因的排列和間距參數(shù)和信息，包括限制性酶切圖譜、cDNA圖譜、一定水平上排列的DNA克隆庫(kù)等，其中如果包括了DNA的核苷酸序列，則是分辨率最高的物理圖譜(參見(jiàn)有基因工程方面的專(zhuān)著)。目前三十頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)

雖然同一物種的遺傳圖譜基本相同，但個(gè)體的DNA序列還有細(xì)微的差別，即具有“多態(tài)性”。遺傳學(xué)上的多態(tài)性指某個(gè)基因在不同物種中的表現(xiàn)型。基因的不同表現(xiàn)型反映出DNA序列的不同，限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)也可能不同。對(duì)同一物種的不同個(gè)體而言，這種差異稱(chēng)為“限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性”(RFLPs)。目前三十一頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)根據(jù)限制性酶切位點(diǎn)的物理圖譜，可以區(qū)分同一物種的不同個(gè)體，這對(duì)判斷DNA的來(lái)源很重要。例如：父母雙方某基因上的限制性位點(diǎn)有所不同，從子代的DNA圖譜可以推知其基因來(lái)自雙親中的哪一方，這對(duì)跟蹤遺傳病、標(biāo)出致病的突變位點(diǎn)有重要意義。目前三十二頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)13.2.3DNA連接酶

DNA連接酶能將DNA分子共價(jià)連接，當(dāng)目的DNA片段插入載體后，分別連接雙鏈DNA分子中的一條鏈，所提供的5′一末端須攜有磷酸基團(tuán)。大腸菌連接酶需要NAD+提供能量，而來(lái)自T4噬菌體的酶需要ATP供能。連接酶可效地使在黏性末端退火堿基對(duì)處閉合斷開(kāi)的磷酸二酯鍵連接。目前三十三頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前三十四頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)互補(bǔ)黏性末端之間堿基配對(duì)促使連接反應(yīng)容易進(jìn)行。平末端之間連接反應(yīng)效率很低，為提高平末端連接效率常采取以下措施：①提高T~DNA連接酶濃度；②提高DNA片段濃度；③降低ATP濃度，以增強(qiáng)連接酶與DNA的結(jié)合；④加入多胺化合物，如亞精胺(spern~dine)，降低DNA的靜電排斥力；⑤加入大分子排阻物乙二醇(PEG)、強(qiáng)水化物三氯化六氨鈷等。目前三十五頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)DNA片段兩末端若為相容黏性末端或平末端，連接時(shí)可以發(fā)生分子間串聯(lián)，或是分子自身環(huán)化。這兩個(gè)過(guò)程以何者占優(yōu)勢(shì)取決于DNA片段的鏈長(zhǎng)與濃度，鏈短濃度較低，有利于自身環(huán)化。反之，鏈長(zhǎng)濃度較高，有利于分子間串聯(lián)。目前三十六頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)在DNA的末端加上一段限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列，隨后用限制酶切出所需要的黏性末端，使DNA的平端連接得以轉(zhuǎn)變成為較易進(jìn)行的黏性末端連接。這種含限制酶識(shí)別序列的DNA片段稱(chēng)為接頭，通常是一條回文結(jié)構(gòu)的寡核苷酸，在溶液中自身配對(duì)成為雙鏈片段。例如，EcoRI的接頭為GGAATTCC；HindⅢ的接頭為CCCAAGCTTGGG。目前三十七頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)限制酶的切割位點(diǎn)靠近DNA片段的末端時(shí)其活性將受到影響。不同限制酶所受影響不同，因此限制酶的接頭通常要比識(shí)別序列長(zhǎng)。含有不只一種限制酶的末端識(shí)別序列，稱(chēng)為多接頭。如果合成兩條互補(bǔ)的寡核苷酸鏈，使其配對(duì)后—端為平末端，另一端為黏性末端，或兩端為不同的黏性末端，此片段稱(chēng)為銜接物(adaptor)。目前三十八頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)在需要連接的兩個(gè)DNA片段末端加上互補(bǔ)的均聚核苷酸后，連接反應(yīng)比較容易進(jìn)行。末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶能催化DNA末端3′-OH上添加脫氧核苷酸。如果在—個(gè)DNA片段的末端添加寡聚dT，在另一片段末端添加寡聚dA；或者分別添加寡聚dC和寡聚dG，這樣兩個(gè)片段末端可以“粘合”。然后用DNA聚合酶(常用DNA聚合酶I的大片段Klenow酶)填補(bǔ)缺口，最后留下的缺刻被T4DNA連接酶連上，互補(bǔ)均聚核苷酸末端的連接可見(jiàn)圖13-4。目前三十九頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前四十頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)13.2.4核酸的聚合酶在圖13-1標(biāo)出一類(lèi)聚合酶，這類(lèi)酶在前面的有關(guān)章節(jié)中已做了介紹，此處不在贅述。目前四十一頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)13.2.5其他工具酶

圖13-1中還列出了其他的工具酶，如堿性磷酸酶是催化去除DNA、RNA、rNTP和dNTP的5′磷酸的反應(yīng)；末端轉(zhuǎn)移酶是一種特殊的DNA聚合酶，在二價(jià)陌離子存在下，催化dNTP加到DNA分子的3′。羥基端，為DNA片段末端加尾提供方便，但此酶強(qiáng)烈偏向于帶3′突出端的DNA受體；T4噬菌體多核苷酸激酶催化ATP的γ-磷酸基轉(zhuǎn)移到DNA或RNA的5′末端，使探針的標(biāo)記成為可能。目前四十二頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)另外還有其他一些核酸酶，如Sl核酸酶可降解單鏈RNA或DNA，產(chǎn)生帶5′一磷酸的單核苷酸或寡核苷酸，但雙鏈DNA、雙鏈RNA或DNA-RNA雜合體對(duì)此酶不敏感；以及Bal31、外切核酸酶Ⅱ等。目前四十三頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)將外源DNA片段帶入宿主細(xì)胞并進(jìn)行復(fù)制的運(yùn)載工具稱(chēng)為克隆載體(vector)?？寺≥d體含有在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的起點(diǎn)，是—個(gè)能自主復(fù)制的復(fù)制子。通常由質(zhì)粒、病毒或一段染色體DNA改造而成，質(zhì)粒是染色體外自主復(fù)制的遺傳因子，多為共價(jià)閉環(huán)DNA分子。目前四十四頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)13.3分子克隆的載體與宿主系統(tǒng)作為克隆載體最基本的要求是：①具有自主復(fù)制的能力；②攜帶易于篩選的選擇標(biāo)記；③含有多種限制酶的單_識(shí)別序列，以供外源基因插入；④除保留必要序列外，載體應(yīng)盡可能小，便于導(dǎo)入細(xì)胞和進(jìn)行繁殖；⑤使用安全。目前四十五頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)構(gòu)建載體時(shí)，通常需選擇適當(dāng)質(zhì)粒、病毒或染色體復(fù)制子作為基礎(chǔ)序列，刪除其中非必需序列，然后插入或融合選擇標(biāo)記序列。最常用的選擇標(biāo)記是對(duì)抗生素的抗性基因，如抗氨芐青霉素(ampr)等。利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型宿主可以將相應(yīng)生物合成基因作為標(biāo)記，帶有合成基因的載體可使宿主細(xì)胞在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，無(wú)需補(bǔ)充原來(lái)所缺的營(yíng)養(yǎng)成分。目前四十六頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)在構(gòu)建載體時(shí)保留一些限制酶的切點(diǎn)作為外源DNA插入位點(diǎn)?，F(xiàn)在常用一段合成的多接頭插入載體，其上十分緊湊地排列著多種限制酶的單—識(shí)別序列，因此在用限制酶切時(shí)不會(huì)將載體切成碎片。對(duì)于載體上不合適的序列則需要用定位誘變的方法予以改造。目前四十七頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)13.3.1質(zhì)粒載體基因工程的興起，使克隆載體的發(fā)展與研制十分迅速，大致可分為三個(gè)階段：第一個(gè)階段主要依賴天然存在的質(zhì)粒，如1973年Cohen等最早使用的載體pSCl01。其后對(duì)載體做了許多改造，包括刪除非必需序列，引入標(biāo)志基因，減少酶切位點(diǎn)等，通過(guò)刪除、融合、轉(zhuǎn)座及重排等操作，構(gòu)建適合于多種用途的克隆載體目前四十八頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)如pBR322。它全長(zhǎng)4361bp，含兩個(gè)抗性基因(tetr和ampr)，具有天然質(zhì)粒pMB的復(fù)制起點(diǎn)(ari)。pSCl01的復(fù)制受?chē)?yán)緊型控制(stringentcontr01)，每個(gè)細(xì)胞只有1～2個(gè)拷貝；而pBR322為松弛型控制(relaxedcontrol)，每個(gè)細(xì)胞含25個(gè)拷貝以上(圖13-5)。目前四十九頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前五十頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前五十一頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)pUC系列的質(zhì)粒載體集中了當(dāng)時(shí)載體的諸多優(yōu)點(diǎn)。包括4個(gè)部分：①來(lái)自pBR322的復(fù)制起點(diǎn)(ori)；②氨芐青霉素抗性基因(ampr)；③大腸桿菌乳糖操縱子的調(diào)節(jié)基因(laci)、啟動(dòng)子(Plac)和β半乳糖苷酶的α-肽(lacZ′)；④位于lacZ′基因中靠近5′端的一段多接頭，或稱(chēng)為多克隆位點(diǎn)(MCS)。目前五十二頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)當(dāng)宿主細(xì)胞的β-半乳糖苷酶基因發(fā)生刪除突變(AMl5)，缺失N端的—段氨基酸序列，使酶失活，但在α-肽存在時(shí)可以互補(bǔ)使酶恢復(fù)活性。攜帶pUc質(zhì)粒載體的大腸桿菌細(xì)胞在異丙基硫代母-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside,IPTG)的誘導(dǎo)下發(fā)生α-互補(bǔ)，可使呈色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(5-bromo-4一chloro-3-indolyl-β-D-galactoside，X-gal被分解產(chǎn)生藍(lán)色。目前五十三頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)多接頭上十分緊湊地排列著多種限制酶的單—識(shí)別序列，外源基因在此插入后使α-肽失活，因此攜帶空載體的大腸桿菌呈藍(lán)色菌落，攜帶外源基因的菌落呈白色菌落。此方法能夠十分方便地鑒別重組克隆。目前五十四頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)

第三個(gè)階段主要是借助一些輔助序列引入新的功能，如在puc18/19質(zhì)粒載體中插入絲狀噬菌體M13的基因間隔區(qū)，其含有單鏈復(fù)制起點(diǎn)，在M13輔助噬菌體幫助下可以產(chǎn)生單鏈DNA模板，該載體稱(chēng)為pUC118/119(圖13-6)。目前五十五頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前五十六頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)質(zhì)粒載體用途很廣，借助插入各種特殊序列而適用于不同目的。當(dāng)一個(gè)質(zhì)粒含有噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)時(shí)，稱(chēng)為噬菌質(zhì)粒(phagemid)，可按噬菌體的方式復(fù)制和裝配。上述的DUCll8/119即為噬菌質(zhì)粒。若一個(gè)質(zhì)粒含有兩種宿主細(xì)胞中復(fù)制的起點(diǎn)，可在兩種細(xì)胞中復(fù)制和存在，則稱(chēng)為穿梭質(zhì)粒(shuttleplasmid)。目前五十七頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)真核生物的克隆載體，為了便于操作常使其先在大腸桿菌中擴(kuò)增，將目的基因與其構(gòu)成合適的重組體后才轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞，因此一般構(gòu)成穿梭載體。如果插入能控制外源基因在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的序列，則稱(chēng)為表達(dá)載體(expressionvector)。目前五十八頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)13.3.2λ噬菌體(λphage)一般質(zhì)粒載體約可攜帶外源DNA數(shù)千堿基，但如欲構(gòu)建基因文庫(kù)(genomiclibrary)，需要載體的容量更大些，常用入噬菌體改造而成的載體。λ噬菌體是大腸桿菌中的一種溫和噬菌體，基因組為雙鏈DNA，大小在50kb左右。DNA兩端有黏性末端，由12nt組成。一旦進(jìn)入宿主細(xì)胞后，λDNA兩端的黏性末端配對(duì)結(jié)合形成環(huán)狀。目前五十九頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)λDNA通過(guò)兩條不同的途徑增殖。裂解途徑(lyticpathway)。溶源途徑(1ysogenicpathway)。目前六十頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)在整個(gè)λ噬菌體基因組中，約有1/3的DNA序列對(duì)于噬菌體的復(fù)制和裝配并非必需，因此可以用外源DNA取代這一部分DNA。此時(shí)，λ噬菌體攜帶外源DNA一起增殖，起到了載體的作用。已經(jīng)設(shè)計(jì)出許多可用于DNA重組技術(shù)的λ噬菌體載體，其中用得較多的是Charon和λgt系列。目前六十一頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)λ噬菌體載體分為插入型(insertion)和置換型(substitution)兩種，前者將線性載體用單個(gè)限制酶切開(kāi)后即可將外源基因相容限制片段與載體兩臂連接；后者需切除載體的一個(gè)片段，再將外源基因與之替換。無(wú)論是前者還是后者，攜帶外源基因后重組體DNA總長(zhǎng)度應(yīng)為λ噬菌體DNA的78%～105%，病毒外殼蛋白才能將其裝配成病毒顆粒。目前六十二頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)用入噬菌體DNA作載體進(jìn)行DNA克隆的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是易于使細(xì)胞感染，提高了使外源DNA導(dǎo)入細(xì)胞的效率，這對(duì)于建立基因文庫(kù)十分重要。圖13-7為以入噬菌體載體克隆DNA的圖解。目前六十三頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前六十四頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)λ噬菌體外殼蛋白在包裝噬菌體顆粒時(shí)，需先形成囊狀頭部前體。λDNA經(jīng)滾環(huán)復(fù)制使單位長(zhǎng)度基因組(單體)串聯(lián)成一條長(zhǎng)鏈，稱(chēng)為多聯(lián)體(concate-mer)，彼此以COS位點(diǎn)相連接。噬菌體編碼的A蛋白結(jié)合在cos位點(diǎn)上，并將λDNA帶到頭部前體的入口處，DNA填滿頭部，A蛋白在cos位點(diǎn)處交錯(cuò)切開(kāi)λDNA，產(chǎn)生黏性末端。隨后分別裝配的針筒狀尾部與頭部結(jié)構(gòu)連成一體，最終成為成熟的λ噬菌體顆粒。目前六十五頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)13.3.3柯斯質(zhì)粒(cosmid)含有cos位點(diǎn)的質(zhì)粒稱(chēng)為柯斯質(zhì)粒，這種質(zhì)?？梢詳y帶大至35~48kb的外源DNA，而入噬菌體載體最多只能攜帶23kb的外源DNA。目前六十六頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)cosmid主要用于構(gòu)建基因組文庫(kù)，以獲得基因組大片段DNA的克隆。cosmid與外源DNA的重組體只要兩個(gè)COS位點(diǎn)間的長(zhǎng)度合適，即可裝配成入噬菌體顆粒，但其中的DNA卻并非XDNA。該噬菌體顆粒仍可感染大腸桿菌，進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)的重組cosmid質(zhì)粒攜帶了外源DNA，而不含入噬菌體基因。圖13-8為柯斯質(zhì)料克隆基因組DNA的示意圖。目前六十七頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前六十八頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)13.3.4M13大腸桿菌絲狀噬菌體包括親緣關(guān)系十分相近的M13、fl和fd，它們都含有長(zhǎng)度為6.4kb的單鏈環(huán)狀DNA，基因組共編碼10種蛋白質(zhì)或小肽，復(fù)制起點(diǎn)和裝配起始信號(hào)均位于基因間隔區(qū)(IG)。絲狀噬菌體經(jīng)F菌毛(pilus)感染大腸桿菌。噬菌體DNA的復(fù)制需先將單鏈DNA(ssDNA)轉(zhuǎn)變成雙鏈復(fù)制形式DNA(RFDNA)。目前六十九頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)構(gòu)建M13載體(M13mp系列)是在M13復(fù)制型的IG區(qū)插入乳糖操縱子(lac)的一個(gè)片段，其中包含lacIq(lacI的突變體，可產(chǎn)生超量阻遏蛋白)、lac啟動(dòng)子以及帶有多接頭的lacZ′(β-半乳糖苷酶的α-肽)，使M13載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后，在IPTG和X-gal存在下由于α-互補(bǔ)作用產(chǎn)生藍(lán)色噬菌斑；但若載體插入外源DNA，不形成α-互補(bǔ)，只產(chǎn)生白色噬菌斑，為重組噬菌體篩選提供了方便的標(biāo)志。目前七十頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)

絲狀噬菌體復(fù)制型雙鏈DNA先經(jīng)過(guò)幾輪?型復(fù)制，再通過(guò)滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)生單鏈正鏈DNA，正鏈DNA環(huán)化后裝配成噬菌體顆粒。外殼蛋白在合成后即轉(zhuǎn)移到質(zhì)膜上，裝配發(fā)生在噬菌體單鏈DNA復(fù)合物穿膜過(guò)程中。目前七十一頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)近年來(lái)噬菌體展示技術(shù)得到迅速發(fā)展，該技術(shù)是將外源基因通過(guò)接頭與噬菌體外殼蛋白基因相融合，從而使外源蛋白能夠在噬菌體表面展示，借此可以研究蛋白質(zhì)分子的相互識(shí)別與作用，或從展示庫(kù)中選擇特定功能的蛋白質(zhì)。噬菌體展示主要用噬菌體M13作為載體。表13-3給出了各類(lèi)載體的主要功能。目前七十二頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)表13-3各類(lèi)載體的主要功能和單鏈探針、定位誘變、噬菌體展示 實(shí)例PBR322、pUC系列BluescriptM13凱倫、λgt系列PJC、pWE系列M13mp系列克隆DNA片段大小裝配成噬菌體顆粒＜10kb不能＜23kb能＜49kb能＜300~400bp能

質(zhì)粒λ噬菌體柯斯質(zhì)料單鏈?zhǔn)删w用途外源基因的克隆和表達(dá)、以及各種基因操作和分析建基因文庫(kù)和cDNA文庫(kù)建基因文庫(kù)制備單鏈模板和單鏈探針、定位誘變、噬菌體展示目前七十三頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)13.4DNA的克隆克隆，即單一親代細(xì)胞通過(guò)無(wú)性繁殖而產(chǎn)生的一組細(xì)胞，這些細(xì)胞具有相同的基因型。因此從同一受精卵分裂而來(lái)的單卵雙生子屬于同一克隆。在生物學(xué)上，要克隆一個(gè)生物，就意味著從一個(gè)生物群體中的單一個(gè)體獲得遺傳同—性的—個(gè)生物群體。在分子生物學(xué)中，欲克隆一個(gè)DNA分子，就意味著從單一DNA分子獲得一群遺傳同一性的DNA分子，這樣產(chǎn)生的DNA分子稱(chēng)克隆。目前七十四頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)任何DNA克隆的過(guò)程包括五個(gè)基本步驟：①獲得目的DNA片段；②將目的片段連接到載體上；③將人工重組的DNA引導(dǎo)進(jìn)入受體細(xì)胞；④檢出目的轉(zhuǎn)化子；⑤將目的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行表達(dá)分析。圖13-9顯示在大腸桿菌中的DNA克隆策略。目前七十五頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前七十六頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)13.4.1目的DNA片段的獲得—個(gè)生物的特定基因可以從構(gòu)建的基因文庫(kù)中篩選。如果基因的序列是已知的，可以用化學(xué)方法合成，或者用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)由模板擴(kuò)增。最常用并且無(wú)需已知序列的方法是建立一個(gè)基因組文庫(kù)(genomiclibrary)或eDNA文庫(kù)(eDNAlibrary)，從中篩選出目的基因的克隆。目前七十七頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)13.4.2將目的片段連接到載體上

用限制酶將質(zhì)粒DNA切開(kāi)產(chǎn)生全長(zhǎng)的線性DNA片段。再用同樣的限制酶或兼容酶將外源DNA消化，產(chǎn)生與載體同樣末端大小的DNA片段?？寺≥d體是環(huán)狀質(zhì)粒DNA或噬菌體DNA。目前七十八頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)

第二步是將消化的兩種。DNA混合，并加入DNA連接酶。當(dāng)載體的兩個(gè)末端與一個(gè)外源片段的兩個(gè)末端分別連接，形成重組體DNA后，外源片段即被克隆進(jìn)入載體。這樣形成的重組體DNA不管用什么方法引入合適的受體細(xì)胞，都能進(jìn)行復(fù)制。重組體DNA復(fù)制后，受體細(xì)胞中必定含有外源片段的多個(gè)拷貝或多個(gè)克隆。目前七十九頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)兩類(lèi)DNA片段混合后有效連接的關(guān)鍵是載體的兩個(gè)末端與DNA片段兩個(gè)末端的有效碰撞。如果載體兩個(gè)末端碰撞，則導(dǎo)致無(wú)效連接。因此在一個(gè)連接反應(yīng)中，載體和片段的濃度以及末端比例對(duì)有效連接至關(guān)重要。目前八十頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)13.4.3重組DNA引導(dǎo)進(jìn)入受體細(xì)胞1.外源基因?qū)朐思?xì)胞2.λ噬菌體的體外包裝3.外源基因?qū)胝婧思?xì)胞

目前八十一頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)1.外源基因?qū)朐思?xì)胞

將外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞，以改變細(xì)胞遺傳性狀的過(guò)程稱(chēng)為轉(zhuǎn)化(transformation)；將病毒DNA或病毒重組DNA直接導(dǎo)入宿主細(xì)胞，稱(chēng)為轉(zhuǎn)染(transfection)，以與病毒的感染(infection)相區(qū)別。目前八十二頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)在低溫下Ca2+使質(zhì)膜變脆，經(jīng)瞬間加熱產(chǎn)生裂隙，外源DNA得以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。制備感受態(tài)細(xì)胞的方法有了不少改進(jìn)，主要是加入各種金屬離子或用還原劑和二甲亞砜處理細(xì)胞膜。采用脈沖高壓電瞬間擊穿雙脂層細(xì)胞膜能使外源DNA高效導(dǎo)入細(xì)胞，該方法稱(chēng)為電穿孔法(eiectroporation)。電擊轉(zhuǎn)化的效率與兩電極間的電位梯度有關(guān)，在相等電位梯度下，細(xì)胞越大，細(xì)胞兩端的電位差也越大，因此細(xì)胞膜易被擊穿。目前八十三頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)2、λ噬菌體的體外包裝

λ噬茵體顆粒能將其DNA分子有效注入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，而與顆粒內(nèi)所含DNA的來(lái)源無(wú)關(guān)。重組λ噬菌體載體DNA或柯斯載體DNA,只要片段大小合適，都能與λ噬菌體外殼蛋白和協(xié)助包裝的蛋白一起在體外包裝成噬菌體顆粒。目前八十四頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)為獲得λ噬菌體的整套包裝蛋白，以便與重組DNA在體外進(jìn)行包裝。有兩種方法可以阻止包裝蛋白與細(xì)胞內(nèi)hDNA的包裝?！菑膬芍旮鲙в笑耸删w缺陷溶源體的大腸桿菌中制備出一對(duì)互補(bǔ)的提取物。這兩種提取物分別缺少一種關(guān)鍵的包裝蛋白，它們單獨(dú)存在時(shí)不會(huì)與內(nèi)源kDNA發(fā)生包裝，只在有重組DNA存在時(shí)將二者合并，才可包裝。目前八十五頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)其二是溶源菌的λ溶源體，cos位點(diǎn)被去除。因此可用單一菌株的包裝蛋白提取物，因其只能和外源重組DNA發(fā)生包裝。目前八十六頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)3、外源基因?qū)胝婧思?xì)胞在基因工程研究過(guò)程中，經(jīng)常需要將外源基因?qū)胝婧思?xì)胞，以對(duì)基因進(jìn)行改造和表達(dá)。常用的基因工程真核細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞。酵母菌由于生長(zhǎng)條件簡(jiǎn)單，已成為真核生物基因工程優(yōu)選的宿主細(xì)胞。目前八十七頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)在對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行外源DNA的轉(zhuǎn)化時(shí)，需先用酶將其細(xì)胞壁消化水解，變成原生質(zhì)體。蝸牛消化酶具有纖維素酶、甘露聚糖酶、葡萄糖酸酶以及幾丁質(zhì)酶等，對(duì)酵母菌細(xì)胞壁有良好水解作用。原生質(zhì)體在CaCl2和聚乙二醇存在下；重組DNA能容易地被宿主細(xì)胞吸收，將轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體懸浮在營(yíng)養(yǎng)瓊脂中，即可再生出新的細(xì)胞壁。目前八十八頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)外源基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞常用的方法有：①磷酸鈣共沉淀法②DEAE-葡聚糖(DEAE-dextron)或聚陽(yáng)離子(polycation)③脂質(zhì)體法(liposome)④脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法(1ipofecfin)⑤電穿孔法目前八十九頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)以當(dāng)諸方法中，磷酸鈣共沉淀法成本低、操作方便，但效率低；脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法和電穿孔法，前儀器者需要昂貴的試劑，后者需要特殊的儀器，但因效率很高，目前較常用：對(duì)哺乳動(dòng)物受精卵等較大的細(xì)胞，導(dǎo)入外源DNA可采用顯微注射法，在顯微鏡下，用極細(xì)的玻璃注射器針頭(0.1～0.5μm)插入細(xì)胞內(nèi)并注入DNA溶液。該方法效率極高，還可直接將DNA送入核內(nèi)，但需要昂貴的儀器，且技術(shù)復(fù)雜不易掌握。目前九十頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)原生質(zhì)體經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)后可以再生出細(xì)胞壁，顯微注射法可直接將外源NA注入細(xì)胞內(nèi)。而無(wú)需制備原生質(zhì)體。目前九十一頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的Ti質(zhì)粒上(tumerinducinggplasmid)有一段T-DNA,又稱(chēng)轉(zhuǎn)移DNA,能攜帶外源基因轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞內(nèi)，并整合到染色體DNA中。因此Ti質(zhì)粒是目前植物基因工程中最常用的理想的基因載體。將外源基因插入Ti質(zhì)粒載體的T-DNA內(nèi)，借助根癌土壤桿菌而將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞。目前九十二頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)根癌土壤桿菌能從植株傷口處侵入，吸附在細(xì)胞壁上，T-DNA隨即進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)，誘發(fā)植株形成冠癭瘤．根癌土壤桿菌本身并不進(jìn)入植物細(xì)胞。將帶有重組Ti質(zhì)粒的根癌土壤桿菌與剛再生了新細(xì)胞壁的原生質(zhì)體共同培養(yǎng)，易于促使植物細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。目前較常用的是葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法(1eafdisctransformation)圖13-10顯示了用Ti質(zhì)粒為載體進(jìn)行植物基因工程圖解。目前九十三頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前九十四頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)利用動(dòng)、植物病毒作為轉(zhuǎn)移基因的載體，不僅能將外源基因?qū)肱囵B(yǎng)的細(xì)胞，而且可以直接導(dǎo)入個(gè)體，通常效率都比較高。使用病毒載體最大的問(wèn)題是安全性，在構(gòu)建載體時(shí)通常需將病毒的毒性基因刪除，并有效防止病毒基因組在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生重組，在生物個(gè)體水平上進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的另一有效方法是高速微彈發(fā)射裝置(high-vekitymicroprojectilesbambardment)，又稱(chēng)基因槍(genegun)目前九十五頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)13.5目的基因的獲得目前，獲得目的基因的途徑主要有：①最常用且無(wú)需已知序列的方法是建立基因組文庫(kù)(genornic1ibrary)或cDNA文庫(kù)(cDNAlibrary)，從中篩選出目的基因的克?。虎谌绻虻男蛄惺且阎?，則用化學(xué)方法或酶法合成，或通過(guò)設(shè)計(jì)引物，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)由模板擴(kuò)增獲得；③通過(guò)鳥(niǎo)槍法或差異顯示和RT-PCR等方法獲得。下面簡(jiǎn)單介紹第一種途徑。目前九十六頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)13.5.1基因組文庫(kù)的構(gòu)建利用重組體DNA技術(shù)將某種生物細(xì)胞的基因組DNA的所有片段隨機(jī)連接到基因載體上，轉(zhuǎn)入合適的宿主細(xì)胞中，通過(guò)細(xì)胞增殖而使外源片段擴(kuò)增。當(dāng)克隆數(shù)目多到足以把某種生物基因組的全部基因都包含在內(nèi)時(shí)，這一組克隆的總體稱(chēng)為該生物的基因組文庫(kù)。目前九十七頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)基因文庫(kù)是指整套由基因組DNA片段插入克隆載體獲得的分子克隆的總和。理想情況下的基因文庫(kù)應(yīng)包含該基因組的全部遺傳信息。目前九十八頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)基因文庫(kù)的構(gòu)建大致分為以下五個(gè)步驟：

(1)染色體DNA的片段化(2)載體DNA的制備(3)體外連接與包裝(4)重組噬菌體感染大腸桿菌(5)基因文庫(kù)的鑒定和擴(kuò)增

目前九十九頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)基因組DNA文庫(kù)限制性內(nèi)切酶基因組DNA基因重組轉(zhuǎn)化細(xì)菌體外包裝目前一百頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前一百零一頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)基因重組反轉(zhuǎn)錄酶mRNAcDNA13.5.2cDNA文庫(kù)的構(gòu)建目前一百零二頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)1、cDNA文庫(kù)構(gòu)建的原理

真核生物的基因不能直接在原核生物中表達(dá)，只有將加工成熟的mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)的DNA(complementaryDNA，cDNA)，并連接相應(yīng)的原核細(xì)胞表達(dá)控制元件，才能在原核生物中表達(dá)。cDNA文庫(kù)指細(xì)胞全部mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并被克隆的總和。目前一百零三頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)2、mRNA的分離制備

構(gòu)建cDNA文庫(kù)的關(guān)鍵是制備高質(zhì)量的mRNA。目前實(shí)驗(yàn)室中提取細(xì)胞總RNA的方法主要有：胍鹽/氯化銫密度梯度超速離心法和酸性胍/酚/氯仿抽提法。目前一百零四頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)3、cDNA的合成

合成cDNA的反轉(zhuǎn)錄酶有兩種，一種來(lái)自禽成髓細(xì)胞性白血病病毒(AMY)，另一種來(lái)自莫洛尼鼠白血病病毒(M-MuLV)。反轉(zhuǎn)錄酶為多功能酶，它能以4種dNTP為底物，以RNA鏈為模板合成第一條cDNA鏈，并具有RNaseH活性，水解雜合分子中的RNA鏈，再以第一條cDNA鏈為模板合成第二條dDNA鏈。目前一百零五頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)4、雙鏈cDNA的克隆

用來(lái)克隆cDNA的載體主要為質(zhì)粒和入噬菌體載體。克隆的常用方法有：①平端連接法；②cDNA兩端加接頭或銜接物；③均聚物加尾法；④將上述幾步合并進(jìn)行，例如用銜接物與引物合在一起，合成cDNA后即具有黏性末端，或者將引物加在載體DNA上，cDNA合成后直接連在載體上。

目前一百零六頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)5、構(gòu)建cDNA文庫(kù)的基本步驟

構(gòu)建cDNA文庫(kù)有五個(gè)基本步驟：①制備mRNA；②合成cDNA；③制備載體DNA；④雙鏈cDNA的分子克?。虎蓁b定構(gòu)建的cDNA文庫(kù)，測(cè)定文庫(kù)所包含的克隆數(shù)，抽查克隆的質(zhì)量和異質(zhì)性。cDNA文庫(kù)的構(gòu)建如圖13-12所示。目前一百零七頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前一百零八頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)13.6克隆基因的分離與鑒定

分離帶有目的基因的重組體克隆，一般是按照重組體某些特征直接從庫(kù)中挑選，稱(chēng)為選擇(selection)，或是從基因庫(kù)中篩選(screening)。無(wú)論是選擇還是篩選，其依據(jù)或是載體的特征、或是目的基因的序列、或是基因的產(chǎn)物。目前一百零九頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)13.6.1以載體特征直接選擇

根據(jù)載體的表型特征直接選擇重組體克隆是十分有效的也是最常用的方法。將它與微生物學(xué)的技術(shù)配合使用，常能處理大量的微生物群體。常用的直接選擇方法主要有：①抗藥性選擇；②營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記選擇；③β-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法。目前一百一十頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)13.6.2細(xì)菌菌落或噬菌斑的原位雜交

從眾多重組體中分離目的基因克隆可用特異探針原位雜交(insituhybridization)。目前一百一十一頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前一百一十二頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)

雜交篩選法的關(guān)鍵是獲得特異性探針。如果目的基因的序列已知或部分已知，探針可從已有的克隆中制備，或是設(shè)計(jì)一對(duì)引物從基因組序列中擴(kuò)增，也可以用化學(xué)法合成。目前一百一十三頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)

但如果目的基因的序列未知，而有他種生物同一基因的序列是已知的，因同源基因間有較大的相同性，故可用同源基因的序列作為探針。若未知基因序列，但其蛋白質(zhì)序列已知或部分已知，可以按密碼子的簡(jiǎn)并性，合成簡(jiǎn)并探針。目前一百一十四頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)13.6.3差別雜交或扣除雜交法分離克隆基因

細(xì)胞在不同的發(fā)育、分化和生理狀態(tài)下其基因的表達(dá)往往有差異，有些決定某種性狀的特異基因只在特異的細(xì)胞中表達(dá)，利用差別雜交法(differentialhy-bridization)可以分離該特異的基因克隆。目前一百一十五頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)

由于差別雜交法十分費(fèi)時(shí)，費(fèi)力，靈敏度低，對(duì)低豐度cDNA克隆難以檢測(cè)，于是研發(fā)出了扣除雜交(subtractivehybridization)法，用一般細(xì)胞的mRNA與特殊細(xì)胞的cDNA雜交，先扣除一般共有的eDNA，再將剩下特異的dDNA進(jìn)行克隆，用此方法已成功克隆出控制動(dòng)物胚胎發(fā)育和組織分化的基因?？鄢s交流程如圖13-14所示。目前一百一十六頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前一百一十七頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)13.6.4從表達(dá)文庫(kù)中分離克隆基因

真核與原核生物基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制卻有很大的不同，真核生物的cNDA或編碼序列必須接上原核生物基因調(diào)控元件，其中包括啟動(dòng)子、SD序列和終止子等，才能在原核細(xì)胞中表達(dá)。目前一百一十八頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)

從表達(dá)文庫(kù)中通過(guò)表達(dá)產(chǎn)物來(lái)分離克隆的基因有以下常用方法：①免疫學(xué)方法；②檢測(cè)產(chǎn)物的功能活性；③檢測(cè)產(chǎn)物性質(zhì)與結(jié)構(gòu)，相對(duì)分子質(zhì)量、肽譜等。目前一百一十九頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)13.6.5克隆基因的鑒定

無(wú)論用哪種方法分離克隆的基因，都要重復(fù)核實(shí)，以避免假陽(yáng)性，然后進(jìn)一步對(duì)基因進(jìn)行鑒定。通常鑒定基因的方法主要有：①根據(jù)基因的結(jié)構(gòu)和序列；②根據(jù)表型特征等；③根據(jù)基因產(chǎn)物的性質(zhì)。目前一百二十頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)13.7聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction，PCR)是DNA的體外酶促擴(kuò)增，故又稱(chēng)為無(wú)細(xì)胞的分子克隆法。目前一百二十一頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)13.7.1PCR反應(yīng)的基本原理PCR方法模仿體內(nèi)DNA的復(fù)制過(guò)程，首先使DNA變性，兩條鏈解開(kāi)；然后使引物與模板退火，二者堿基配對(duì)。DNA聚合酶隨即以4種dNTP為底物，在引物的引導(dǎo)下合成與模板互補(bǔ)的DNA新鏈。重復(fù)此過(guò)程，DNA鏈以指數(shù)方式擴(kuò)增。目前一百二十二頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)13.7.2PCR反應(yīng)的基本步驟(1)設(shè)計(jì)一對(duì)引物以便有效擴(kuò)增所需要的DNA序列。(2)優(yōu)化反應(yīng)體系，以便獲得最好的擴(kuò)增效果。(3)選擇3個(gè)循環(huán)溫度，變性，94℃，45～60s；退火(根據(jù)引物與模板的Tm值確定，一般為兩個(gè)引物中較低的Tm值減2)，lmin；延伸。72℃，1rain。開(kāi)始時(shí)熱變性5～10min，熱循環(huán)25～30個(gè)周期，最后延伸10min。(4)擴(kuò)增完成后取出一定量反應(yīng)產(chǎn)物，檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。最常用方法是凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外光下檢測(cè)。目前一百二十三頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前一百二十四頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)13.7.3PCR技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用

在所有生物技術(shù)中，PCR技術(shù)發(fā)展最迅速，應(yīng)用最廣泛，它對(duì)生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和相鄰學(xué)科帶來(lái)了巨大的影響。它發(fā)展的新技術(shù)和用途大約有以下幾個(gè)方面：目前一百二十五頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)(1)PCR常用于合成特異探針通常PCR所加兩端引物的摩爾數(shù)是相等的，若加入不等量的引物，例如60:1，即為不對(duì)稱(chēng)PCR(asymmetricPCR)，可用于合成單鏈探針或其他用途的單鏈模板。(2)用于DNA的測(cè)序PCR可用于制備測(cè)序用樣品。(3)RT-PCR將反轉(zhuǎn)錄技術(shù)與PCR技術(shù)相偶聯(lián)，可用于擴(kuò)增被反轉(zhuǎn)錄成cDNA形式的特定RNA序列。RT-PCR主要用于：目前一百二十六頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)①分析基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，②構(gòu)建cDNA庫(kù)，③克隆特異cDNA，④合成eDNA探針，⑤構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)等。目前一百二十七頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)(4)產(chǎn)生和分析基因突變PCR技術(shù)十分容易用于基因定位誘變。利用寡核苷酸引物可在擴(kuò)增DNA片段的末端引入附加序列，或造成堿基的取代，缺失和插入。目前一百二十八頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)(5)重組PCR將DNA不同序列連在一起。重組PCR在基因工程操作中十分有用，用酶切割和連接常常找不到合適的酶切位點(diǎn)，而且引入的多余序列無(wú)法刪除。重組PCR只需設(shè)計(jì)3個(gè)引物：①左邊DNA片段的5′引物；②連接兩片段的引物；③右邊片段的3′引物，經(jīng)過(guò)數(shù)輪PCR即可將兩片段連在一起。目前一百二十九頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)(6)未知序列的PCR擴(kuò)增通常PCR必須知道欲擴(kuò)增DNA片段兩端的序列，才能設(shè)計(jì)一對(duì)引物用以擴(kuò)增該片段。但在許多情況下需要擴(kuò)增的片段序列是未知的，一些特殊的PCR技術(shù)可用來(lái)擴(kuò)增未知序列，或從已知序列擴(kuò)增出其上游或下游未知序列。反向PCR(inversfiPCR)通過(guò)使部分序列已知的限制片段自身環(huán)化連接，然后在已知序列部位設(shè)計(jì)一對(duì)反向的引物，經(jīng)PCR而使未知序列得到擴(kuò)增(圖13-15A)。目前一百三十頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)目前一百三十一頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)

從染色體已知序列出發(fā)，通過(guò)重復(fù)進(jìn)行反向PCR，逐步擴(kuò)增出未知序列的技術(shù)，稱(chēng)為染色體步移(chromosomewalking)，為染色體DNA的研究提供了有用的手段。(圖13-15B)。目前一百三十二頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)

此外還有一些PCR技術(shù)可以擴(kuò)增未知序列。例如，錨定PCR(anchoredPCR)，用末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶在合成DNA鏈的3′端加上均聚物，再用此均聚物互補(bǔ)的寡聚核苷酸作為另一引物進(jìn)行PCR。利用人類(lèi)基因組DNA中分散分布的Alu序列，用一段已知序列和Alu序列作為一對(duì)引物，也可以擴(kuò)增出未知序列.目前一百三十三頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)

(7)基因組序列的比較研究應(yīng)用隨機(jī)引物的PCR擴(kuò)增，便能測(cè)定兩個(gè)生物基因組之間的差異。這技術(shù)稱(chēng)為隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA分析(randomamplifiedpolymorphicDNA,，RAPD)。如果用隨機(jī)引物尋找生物細(xì)胞表達(dá)基因的差異，則稱(chēng)為mR_NA的差異顯示(dfifferentialdisplay)。PCR技術(shù)在人類(lèi)學(xué)、古生物學(xué)、進(jìn)化論等的研究中也起了重要的作用。目前一百三十四頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)(8)在臨床醫(yī)學(xué)和法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用PCR技術(shù)已被廣泛用于臨床診斷。如對(duì)癌基因、遺傳病等疑難病和惡性疾病的確診，病原體的檢測(cè)(某些惡性疾病用一般微生物學(xué)、生化和免疫學(xué)技術(shù)無(wú)法查出時(shí))，確定親屬間的親緣關(guān)系，胎兒的早期檢查等。目前一百三十五頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)13.8DNA的化學(xué)合成

1956年，Khorana首次成功合成了二核苷酸。將核苷酸所有活性基團(tuán)都用保護(hù)劑封閉，只留下需要反應(yīng)的基團(tuán)，用活化劑使反應(yīng)基團(tuán)激活，再用縮合劑使一個(gè)核苷酸的羥基與另一核苷酸磷酸基之間形成磷酸二酯鍵，定向聚合，這種DNA合成法稱(chēng)為磷酸二酯法。目前一百三十六頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)DNA自動(dòng)化合成采用快速的亞磷酸三酯法。腺嘌呤、胞嘧啶堿基上的氨基用苯甲?；Ｗo(hù)，鳥(niǎo)嘌呤堿基的氨基用異丁酰基保護(hù)，5′-羥基用二甲氧三苯甲基(DMT)保護(hù)。目前一百三十七頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)13.9基因定位誘變

基因定位誘變是指按照設(shè)計(jì)的要求，使基因的特定序列發(fā)生插入、刪除、置換和重組等變異。目前常用的定位誘變方法主要有：在酶切位點(diǎn)處插入、刪除和置換序列。采用寡核核苷酸指導(dǎo)的誘變(oligonucleotide-directedmutagenesis)和PCR誘變手段。目前一百三十八頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)13.9.1酶切誘變

利用基因的酶切位點(diǎn)，可在其切點(diǎn)處改造基因序列。先選擇合適的限制酶將基因切開(kāi)，然后插入或刪除有關(guān)序列。如若基因內(nèi)部在需要誘變的部位缺乏可被利用的限制酶酶切位點(diǎn)，就要先用寡核苷酸指導(dǎo)的誘變或PCR誘變引入酶切位點(diǎn)。有時(shí)不能確定插入或刪除的最適序列，可以插入一組變異的序列或是進(jìn)行系統(tǒng)的插入或刪除，由此構(gòu)建成突變體庫(kù)，從中再挑選最理想的突變體。目前一百三十九頁(yè)\總數(shù)一百五十七頁(yè)\編于四點(diǎn)13.9.2寡核苷酸指導(dǎo)的誘變

Hutchison等用合成的寡核苷酸在體外誘導(dǎo)單鏈?zhǔn)删w~PXl74發(fā)生變異。用帶有錯(cuò)配堿基的寡核苷酸與φX174的單鏈DNA退火，并以其作為引物用Klenow酶合成DNA，所產(chǎn)生局部異源雙鏈的DNA轉(zhuǎn)染細(xì)菌，結(jié)果使顯示預(yù)期表