核酸分子雜交技術(shù)

第三節(jié)核酸分子雜交技術(shù)

核酸分子雜交技術(shù)第1頁(yè)按堿基互補(bǔ)配對(duì)標(biāo)準(zhǔn)，含有一定同源性兩條核苷酸單鏈在適宜條件下形成雙鏈雜交過(guò)程含有高度特異性（即使有一個(gè)堿基不配對(duì)都不能雜交）。經(jīng)過(guò)檢測(cè)探針是否發(fā)生了雜交及雜交量多少，從而對(duì)待測(cè)核苷酸序列進(jìn)行定性和定量分析。核酸分子雜交成敗，關(guān)鍵在于探針。核酸分子雜交技術(shù)基本原理核酸分子雜交技術(shù)第2頁(yè)

1.探針概念：在化學(xué)及生物學(xué)意義上探針(Probe)，是指能與特定靶分子發(fā)生特異性相互作用分子，并可被特殊方法所探知核酸分子探針則是指帶有標(biāo)識(shí)物，能與互補(bǔ)核酸序列退火雜交特定已知核酸片段。探針設(shè)計(jì)和選擇影響核酸雜交試驗(yàn)結(jié)果高度特異性、正確性。(一)探針概念、種類及其選擇、探針標(biāo)識(shí)核酸分子雜交技術(shù)第3頁(yè)2.探針?lè)N類、選擇及特點(diǎn)種類：基因組DNA探針、cDNA探針、RNA探針、寡核苷酸探針選擇：寡核苷酸探針是指人工合成短鏈核苷酸片段，并帶有標(biāo)識(shí)物特點(diǎn)：人為控制，雜交時(shí)間短，特異性高，可以用于點(diǎn)突變檢測(cè)；缺點(diǎn)是靈敏度低

核酸分子雜交技術(shù)第4頁(yè)

設(shè)計(jì)寡核苷酸探針遵照標(biāo)準(zhǔn)：

①探針長(zhǎng)度：普通要求10～50bP。過(guò)短則特異性降低，過(guò)長(zhǎng)，則合成困難、雜交時(shí)間延長(zhǎng)，亦會(huì)出現(xiàn)非特異性雜交

②G：C堿基對(duì)含量應(yīng)占40～60％；過(guò)少，則不易雜交，或雜交雙鏈不穩(wěn)定；過(guò)多，則會(huì)產(chǎn)生非特異性雜交

③探針內(nèi)部互補(bǔ)堿基對(duì)不應(yīng)大于4bP，不然會(huì)形成探針內(nèi)部“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)。

核酸分子雜交技術(shù)第5頁(yè)④同一堿基連續(xù)出現(xiàn)次數(shù)不應(yīng)超出4次⑤探針設(shè)計(jì)完后，最好利用基因庫(kù)軟件進(jìn)行分析，并與已知各種基因序列進(jìn)行同源性比較，探針與非目標(biāo)基因序列有70％以上同源性，或連續(xù)有8個(gè)以上堿基序列相同，則放棄。核酸分子雜交技術(shù)第6頁(yè)一個(gè)理想標(biāo)識(shí)物應(yīng)具備特征：①高度靈敏性；②標(biāo)識(shí)物不影響探針堿基配對(duì)特異性、雜交特異性、雜交穩(wěn)定性及Tm值；③高度特異性（發(fā)生雜交能檢測(cè)到，不然檢測(cè)不到）；3.探針標(biāo)識(shí)物與標(biāo)識(shí)核酸分子雜交技術(shù)第7頁(yè)④較高化學(xué)穩(wěn)定性，保留時(shí)間較長(zhǎng)；⑤標(biāo)識(shí)方法及檢測(cè)方法簡(jiǎn)單；⑥對(duì)人體無(wú)損傷，對(duì)環(huán)境無(wú)污染；⑦價(jià)格低廉。3.探針標(biāo)識(shí)物與標(biāo)識(shí)核酸分子雜交技術(shù)第8頁(yè)放射性核素標(biāo)識(shí)：32P、35S、3H、125I、131I優(yōu)點(diǎn)是靈敏度極高，能夠檢測(cè)到10-14g～10-18g物質(zhì)；缺點(diǎn)是對(duì)人體有一定影響，對(duì)環(huán)境有污染。核酸分子雜交技術(shù)第9頁(yè)非放射性標(biāo)識(shí)物：半抗原（生物素、地高辛）；配體；熒光素；化學(xué)發(fā)光物；產(chǎn)生顏色物質(zhì)核酸分子雜交技術(shù)第10頁(yè)固相雜交

膜上印跡雜交細(xì)胞原位雜交液相雜交（二）雜交核酸分子雜交技術(shù)第11頁(yè)用印跡技術(shù)將凝膠電泳分離核酸片段轉(zhuǎn)移到特異固相支持物上（轉(zhuǎn)移后核酸片段將保持其原來(lái)相對(duì)位置不變）。再用標(biāo)識(shí)核酸探針與固相支持物上核酸片段進(jìn)行雜交。最終洗去未雜交游離探針?lè)肿?，?jīng)過(guò)放射自顯影等檢測(cè)方法顯示標(biāo)識(shí)探針位置及量多少。

膜上印跡雜交基本操作流程核酸分子雜交技術(shù)第12頁(yè)1.印跡技術(shù)

印跡技術(shù)是指將待測(cè)核酸分子轉(zhuǎn)移并結(jié)合到一定固相支持物上方法。印跡技術(shù)主要包含兩個(gè)關(guān)鍵原因：選擇良好固相支持物；有效轉(zhuǎn)移方法。

核酸分子雜交技術(shù)第13頁(yè)⑴固相支持物選擇

①含有良好機(jī)械性能，如柔軟性好，韌性強(qiáng)，方便操作時(shí)不易損壞；②含有較強(qiáng)結(jié)合核酸分子能力；結(jié)合穩(wěn)定、牢靠，能經(jīng)受雜交、洗膜等操作過(guò)程，而不會(huì)脫落或脫落極少；③結(jié)合后應(yīng)不影響核酸分子與探針?lè)肿与s交反應(yīng)；④非特異性吸附較少，即使有，在洗膜時(shí)也易被洗脫掉。

核酸分子雜交技術(shù)第14頁(yè)硝酸纖維素濾膜尼龍膜化學(xué)活化膜濾紙當(dāng)前慣用固相支持物核酸分子雜交技術(shù)第15頁(yè)硝酸纖維素濾膜

含有較強(qiáng)吸附結(jié)合單鏈DNA和RNA能力尤其是在高鹽濃度，其結(jié)協(xié)力可達(dá)80μg/cm2～100μg/cm2。這種結(jié)合主要靠疏水作用。非特異性吸附核酸（探針）能力較弱，所以雜交信號(hào)本底值較低。核酸分子雜交技術(shù)第16頁(yè)缺點(diǎn)：①與核酸結(jié)協(xié)力較弱（因?yàn)槭强渴杷饔茫?，在雜交及洗脫進(jìn)程中，核酸會(huì)慢慢脫落，尤其是在高溫情況下，更輕易脫落。對(duì)于小分子量DNA片段結(jié)協(xié)力更弱，所以不太適合小分子DNA片段雜交。②硝酸纖維素膜質(zhì)地較脆，尤其是經(jīng)烘烤后更易破損，所以操作不方便，須尤其小心。硝酸纖維素膜與核酸結(jié)合，有賴于高鹽濃度，而高鹽溶液又不適合于電轉(zhuǎn)印跡法核酸分子雜交技術(shù)第17頁(yè)尼龍膜

未經(jīng)特殊處理尼龍膜，叫普通尼龍膜。經(jīng)過(guò)了正電荷基團(tuán)修飾，又叫特殊尼龍膜。特殊尼龍膜帶有正電荷，對(duì)核酸結(jié)協(xié)力要比硝酸纖維素膜強(qiáng)好多倍。經(jīng)短波紫外線照射后，核酸中部分嘧啶堿基可與膜上帶正電荷氨基相互交聯(lián)。所以尤其適合用于小分子核酸片段雜交。堿處理也可使核酸牢靠地結(jié)合在尼龍膜上，尤其適合用于菌落原位印跡法。核酸分子雜交技術(shù)第18頁(yè)尼龍膜質(zhì)地堅(jiān)韌，不易損壞，操作方便，可進(jìn)行屢次重復(fù)雜交。在低離子強(qiáng)度條件下，也可與核酸牢靠結(jié)合，所以適合用于電轉(zhuǎn)印跡法。缺點(diǎn)：因?yàn)榻Y(jié)協(xié)力強(qiáng)，非特異性吸附較多，雜交信號(hào)本底較高，應(yīng)注意封閉。核酸分子雜交技術(shù)第19頁(yè)⑵印跡方法

①斑點(diǎn)或狹縫印跡

②虹吸印跡法③電轉(zhuǎn)印跡法④真空轉(zhuǎn)移法Southern印跡法Northern印跡法核酸分子雜交技術(shù)第20頁(yè)a.DNA分子經(jīng)限制內(nèi)切酶酶切。酶切變成適當(dāng)長(zhǎng)度DNA片段。普通理想是0.5～10Kb，因片段大小直接影響轉(zhuǎn)移效率。b.在瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。分離DNA片段，與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)參考物比較（Marker）,EB染色后觀察DNA片段大小Southern印跡法核酸分子雜交技術(shù)第21頁(yè)

c.將凝膠浸泡于適量變性液中(1.5mol/LNacl和0.5mol/LNaOH)室溫1h，其目標(biāo)使DNA變性，即將雙鏈DNA變成單鏈DNA。假如DNA片段較大(大于15kb)，可在變性前，用稀鹽酸（0.2mol/L）處理10min,因?yàn)槠未笮≈苯佑绊戅D(zhuǎn)移率速。小于15Kb，轉(zhuǎn)移1h。d.印跡(轉(zhuǎn)移)方法：虹吸印跡法，電轉(zhuǎn)印跡法和真空印跡法。不論采取哪種方法，均是將DNA從凝膠轉(zhuǎn)移到固相支持物上e.固定，對(duì)于硝酸纖維膜，可真空下80℃烘烤2h(亦可無(wú)真空)，對(duì)尼龍膜還可用短波紫外線（波長(zhǎng)254nm）照射幾分鐘進(jìn)行固定。核酸分子雜交技術(shù)第22頁(yè)基本原理與Southern印跡相同但RNA變性方法與DNA不一樣:不能用堿變性，因?yàn)閴A造成RNA水解。RNA變性常與電泳同時(shí)進(jìn)行，常有3種方法:聚乙醛和二甲基亞砜變性電泳甲醛變性凝膠電泳甲基氧化汞電泳

Northern印跡法核酸分子雜交技術(shù)第23頁(yè)RNA經(jīng)變性電泳后，普通可進(jìn)行轉(zhuǎn)移（印跡），其印跡方法與Southern方法相同。對(duì)含甲醛凝膠，可用DEPC預(yù)處理水漂洗，以去除甲醛。固定方法，慣用真空烘烤（80℃）2h核酸分子雜交技術(shù)第24頁(yè)2．雜交（固－液相雜交）技術(shù)

DNA分子雜交實(shí)際上是雙鏈DNA變性和含有同源序列兩條單鏈復(fù)性過(guò)程。RNA分子雜交也包括變性和復(fù)性過(guò)程（這種變性是單鏈RNA分子內(nèi)部發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開過(guò)程）。所以以DNA分子雜交為例進(jìn)行介紹。核酸分子雜交技術(shù)第25頁(yè)（1）變性

即打開DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，變成單鏈DNA過(guò)程。方法有：加熱變性有機(jī)溶劑變性高濃度鹽變性堿變性等慣用方法是加熱變性和堿變性。核酸分子雜交技術(shù)第26頁(yè)

DNA變性時(shí)，在260nm處紫外吸光度增加，這種現(xiàn)象又稱增色效應(yīng)。熔解溫度（meltingtemperatureTm值）當(dāng)增色效應(yīng)到達(dá)最大值50%時(shí)溫度Tm值表明DNA溶液中二分之一DNA雙鏈已解離為單鏈Tm值反應(yīng)了DNA變性程度和難易，Tm值越大，變性越難大多數(shù)DNATm值在85～90℃左右。核酸分子雜交技術(shù)第27頁(yè)Tm值影響原因：①DNA堿基組成，Tm值主要受G：C堿基對(duì)數(shù)量多少影響，有一個(gè)經(jīng)驗(yàn)公式為：Tm＝(G+C)%×0.41＋69.3②溶液離子強(qiáng)度，DNA鏈上磷酸基團(tuán)帶負(fù)電荷，在無(wú)鹽水中，DNA在室溫條件下就會(huì)變性，而加入鹽后，正電荷離子能夠封閉磷酸基團(tuán)負(fù)電荷，使DNA雙鏈穩(wěn)定性增加，Tm值亦會(huì)升高。核酸分子雜交技術(shù)第28頁(yè)

③pH值，pH值在5～9之間范圍內(nèi)，Tm值改變不顯著，當(dāng)pH值大于11.3時(shí)，全部氫鍵均被破壞，DNA完全變性。這就是堿變性原理。④變性劑：變性劑能夠干擾堿堆積力和氫鍵形成，所以能夠降低Tm值。慣用變性劑是甲酰胺和脲。通慣用50％甲酰胺使Tm值降低30℃

核酸分子雜交技術(shù)第29頁(yè)（2）復(fù)性

單鏈核酸重新締合成雙鏈過(guò)程。復(fù)性過(guò)程是相當(dāng)復(fù)雜。復(fù)性則需要相對(duì)較長(zhǎng)時(shí)間才能完成。分子碰撞機(jī)率越大，復(fù)性速度越快，一開始往往錯(cuò)誤碰撞，只有正確配對(duì)才是復(fù)性開始。使變性DNA完全恢復(fù)天然雙鏈結(jié)構(gòu)，則要在低于Tm值25℃溫度下維持相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間才能完成。

核酸分子雜交技術(shù)第30頁(yè)復(fù)性（速度）過(guò)程影響原因：①DNA濃度：DNA濃度越大、碰撞機(jī)率越大，復(fù)性速度越快。②DNA分子量：大分子量DNA擴(kuò)散速度較慢，碰撞機(jī)率較少，同時(shí)又極難形成正確配對(duì)，所以復(fù)性速度較慢。③溫度：溫度過(guò)高，有利于DNA變性而不利于復(fù)性；而溫度過(guò)低，碰撞機(jī)率降低，易形成局部錯(cuò)誤配對(duì)，適宜溫度是較Tm值低15℃～25℃。

核酸分子雜交技術(shù)第31頁(yè)④離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度過(guò)低，不利于復(fù)性⑤pH值：pH值在5～9范圍內(nèi)，不影響復(fù)性速度，過(guò)低或過(guò)高則影響。⑥D(zhuǎn)NA分子復(fù)雜性：DNA總量一定時(shí)，基因組越復(fù)雜，其中特定次序拷貝數(shù)就越少，互補(bǔ)次序濃度就越低，因而復(fù)性反應(yīng)速度越慢。核酸分子雜交技術(shù)第32頁(yè)（3）雜交體系建立要考慮以下幾原因

①DNA濃度：DNA濃度越高，復(fù)性速度越快。加入足夠DNA并盡可能降低雜交體積，普通以每平方厘米濾膜面積加50～100μl雜交液為宜。

②DNA探針長(zhǎng)度：在雜交過(guò)程中，待測(cè)DNA固定在膜上，只有探針能夠自由擴(kuò)散，探針越長(zhǎng)，擴(kuò)散越慢，變性越慢。所以探針長(zhǎng)度不宜過(guò)長(zhǎng)，普通以10～50bp。核酸分子雜交技術(shù)第33頁(yè)③離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度對(duì)變性影響較大。普通慣用5×或6×SSC（1×SSC為0.15mol/LNacl和0.015mol檸檬酸鈉）。④溫度：溫度對(duì)于雜交（復(fù)性）反應(yīng)快慢和洗膜時(shí)去掉非特異雜交是至關(guān)主要原因。

核酸分子雜交技術(shù)第34頁(yè)普通認(rèn)為雜交溫度為：68℃（不含甲酰胺）；當(dāng)含50％甲酰胺時(shí)，在42℃進(jìn)行雜交。洗膜溫度普通認(rèn)為55℃～65℃。對(duì)于寡核苷酸探針雜交溫度，應(yīng)依據(jù)以下公式推算：Tm=4℃×GC＋2℃×AT雜交溫度普通比Tm值低5℃，55℃（20bp)

核酸分子雜交技術(shù)第35頁(yè)

⑤雜交時(shí)間：普通應(yīng)為Cot1/21～3倍。Yz小時(shí)/Cot1/2＝×25×10XCo＝單鏈DNA濃度，t1/2＝反應(yīng)二分之一時(shí)間Y為探針DNA復(fù)雜性，即片段大?。↘b）Z為雜交體系體積(ml)。

經(jīng)驗(yàn)雜交時(shí)間8～16h，過(guò)夜。核酸分子雜交技術(shù)第36頁(yè)

⑥降低或抑制非特征雜交。普通在雜交前先進(jìn)行預(yù)雜交，方便將非特異性DNA位點(diǎn)封閉，同時(shí)也將膜上非特異性吸附位點(diǎn)封閉。⑦促進(jìn)雜交反應(yīng)速度：硫酸葡聚糖(dextransulfate,Mw500000)能促進(jìn)DNA鏈間締合，其微粒表面可吸附DNA探針?lè)肿?，從而使DNA接觸面積增大，有利于雜交反應(yīng)，促進(jìn)雜交反應(yīng)速度。如10％硫酸葡聚糖可使雜交反應(yīng)速度提升10～100倍。核酸分子雜交技術(shù)第37頁(yè)①預(yù)雜交：將膜放在預(yù)雜液中，即不放探針，預(yù)雜交液中主要含Dehardt液和鮭魚精DNA，主要是封閉膜上非特異性雜交位點(diǎn)。②雜交：雜交液中除含封閉物質(zhì)外，還含有10％硫酸葡聚糖和探針。探針假如是雙鏈DNA，則需要進(jìn)行變性處理。溫度68℃（不含甲酰胺），42℃（含50％甲酰胺），雜交時(shí)間：8～16h過(guò)夜。

（4）雜交操作步驟核酸分子雜交技術(shù)第38頁(yè)③洗液：將膜上未與DNA雜交及非特異性雜交探針從膜上洗去過(guò)程。因?yàn)榉翘禺愋噪s交雜交體穩(wěn)定性較低，解鏈溫度較低，而特異性雜交體因?yàn)榉€(wěn)定而保留在濾膜上。注意，洗膜液要換幾次，要用幾個(gè)不一樣洗膜液。離子強(qiáng)度逐步降低，而洗膜溫度逐步上升（室溫～37℃～65℃）。即逐步增加洗膜強(qiáng)度。逐步降低離子強(qiáng)度，為下一步反應(yīng)（檢測(cè)）做好準(zhǔn)備。

核酸分子雜交技術(shù)第39頁(yè)3．雜交信號(hào)檢測(cè)

⑴放射自顯影：探針標(biāo)識(shí)了放射性核素，如32P、35S、125I或131I。其詳細(xì)方法是：在暗盒里將雜交后濾膜放在暗盒里X光片上，蓋上暗盒，置－70℃曝光一定時(shí)間。經(jīng)顯影、定影后，可出現(xiàn)黑色曝光斑點(diǎn)，依據(jù)斑點(diǎn)密度及大小，判斷被檢測(cè)核酸是否有與探針對(duì)應(yīng)序列及大小。核酸分子雜交技術(shù)第40頁(yè)

⑵顯色反應(yīng)：探針直接標(biāo)識(shí)酶或間接結(jié)合酶，酶在有特異性底物存在情況下，可發(fā)生顯色反應(yīng)。依據(jù)顯色反應(yīng)斑點(diǎn)大小判斷結(jié)果。

A

BC酶+底物

顯色探針標(biāo)識(shí)物(地高辛)抗體核酸分子雜交技術(shù)第41頁(yè)慣用酶堿性磷酸酶：作用底物：BCIP（5-溴-4-氯-4-吲哚磷酸）NBT(硝基藍(lán)四氮唑)。顯色過(guò)程：堿性磷酸酶→BCIP→脫磷，產(chǎn)生H+

→NBT還原→紫色化合物。辣根過(guò)氧化物酶（HRP）：慣用底物：DAB（二氨基聯(lián)苯胺），紅棕色，有致癌性。TMB（四甲基聯(lián)苯胺），產(chǎn)生藍(lán)色，無(wú)致癌性。

核酸分子雜交技術(shù)第42頁(yè)⑶化學(xué)發(fā)光反應(yīng)

與顯色反應(yīng)基本一致，只是酶（HRP堿性磷酸酶）催化一個(gè)特殊底物如luminol、CSPD等，產(chǎn)生發(fā)光，而不顯色。該化學(xué)光可使X光片曝光，經(jīng)顯影、定影后，可取得雜交斑點(diǎn)?；瘜W(xué)發(fā)光是一個(gè)有發(fā)展前途檢測(cè)方法。如需準(zhǔn)確定性和定量，可用數(shù)字成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。核酸分子雜交技術(shù)第43頁(yè)第四節(jié)蛋白質(zhì)雜交技術(shù)

核酸分子雜交技術(shù)第44頁(yè)檢測(cè)DNA可用Southern印跡法檢測(cè)RNA可用Northern印跡法檢測(cè)蛋白質(zhì)一樣有蛋白質(zhì)印跡法（Western印跡法）蛋白質(zhì)印跡是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相支持物上，然后利用抗體與附著于固相支持物上靶蛋白發(fā)生特異性抗原抗體結(jié)合反應(yīng)核酸分子雜交技術(shù)第45頁(yè)待測(cè)樣品經(jīng)過(guò)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）被轉(zhuǎn)移到固相支持物上，固相支持物以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)以固相支持物上蛋白質(zhì)為抗原，與對(duì)應(yīng)抗體發(fā)生特異性抗原抗體結(jié)合反應(yīng)與酶或同位素標(biāo)識(shí)第二抗體發(fā)生反應(yīng)經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影，以檢測(cè)電泳分離靶蛋白。一、原理核酸分子雜交技術(shù)第46頁(yè)Western印跡有SDS高分辨力固相免疫測(cè)定高特異性和敏感性，可測(cè)出1ng～5ng中等大小蛋白質(zhì)。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)電泳分離幾乎總是在變性條件下進(jìn)行，所以，不存在溶解、聚集以及靶蛋白與外來(lái)蛋白共沉淀等問(wèn)題。還含有簡(jiǎn)便、標(biāo)本可長(zhǎng)久保留、結(jié)果便于比較等優(yōu)點(diǎn)。

核酸分子雜交技術(shù)第47頁(yè)（一）蛋白提取試劑1．細(xì)胞裂解液20mmol/LTris(pH7.5)150mmol/LNaCl1%TritonX-100焦磷酸鈉，β-磷酸甘油，EDTA，正釩酸鈉(Na3VO4)亮抑肽素等各種蛋白酶抑制劑二、試劑核酸分子雜交技術(shù)第48頁(yè)2×蛋白上樣緩沖液100mmol/LTris·Cl(pH6.8)200mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）4%SDS(十二烷基硫酸鈉)0.2%溴酚藍(lán)20%甘油核酸分子雜交技術(shù)第49頁(yè)（二）SDS試劑1．30%丙烯酰胺溶液丙烯酰胺30g、雙丙烯酰胺0.8g，溶于100ml水中，過(guò)濾后貯于褐色瓶中低溫保留，可用一個(gè)月。2．Tris緩沖液（1）1.5mol/LTris(pH8.8)/積層膠緩沖液：Tris堿18.17g，用HCl調(diào)pH8.8，加水至100ml。（2）1.0mol/LTris(pH6.8)分離膠緩沖液：Tris堿12.11g，用HCl調(diào)pH6.8，加水至100ml。

核酸分子雜交技術(shù)第50頁(yè)3．10%SDS可用去離子水配成貯存液保留于室溫。4．10%過(guò)硫酸胺

過(guò)硫酸胺提供丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所必需自由基?？捎萌ルx子水配制小量貯存液并保留于4℃冰箱中。因?yàn)檫^(guò)硫酸胺會(huì)遲緩分解，故應(yīng)隔周重新配制。核酸分子雜交技術(shù)第51頁(yè)5．TEMED（N,N,N′,N′－四甲基乙二胺）經(jīng)過(guò)催化過(guò)硫酸胺形成自由基而加速丙烯酰胺與雙丙烯酰胺聚合。6．Tris-甘氨酸電泳緩沖液配成10×貯存液備用，在900ml去離子水中溶解30gTris堿和144g甘氨酸，然后加入10gSDS，用HCl調(diào)pH至8.3，用去離子水補(bǔ)至1000ml。使用前用去離子水稀釋成1×應(yīng)用液。核酸分子雜交技術(shù)第52頁(yè)（三）轉(zhuǎn)膜緩沖液39mmol/L甘氨酸48mmol/LTris堿0.037%SDS20%甲醇核酸分子雜交技術(shù)第53頁(yè)（四）染色液與脫色液1．考馬斯亮藍(lán)R250染液100mg考馬斯亮藍(lán)R250溶于40ml乙醇，加10ml冰醋酸，補(bǔ)水至100ml。2．考馬斯亮藍(lán)脫色液40ml乙醇，加10ml冰醋酸，補(bǔ)水至100ml。3．麗春紅S貯存液2g麗春紅S，30g三氯乙酸，30g磺基水楊酸，加水至100ml。使用時(shí)，將1份上述貯存液加9份去離子水即為麗春紅S應(yīng)用液，使用后應(yīng)廢棄。核酸分子雜交技術(shù)第54頁(yè)（五）封閉液5％脫脂奶粉0.01%防沫劑A0.02%疊氮鈉溶于磷酸鹽緩沖液（PBS）核酸分子雜交技術(shù)第55頁(yè)（一）樣品前處理細(xì)菌普通直接用蛋白上樣緩沖液裂解；真核細(xì)胞或哺乳動(dòng)物組織通常加細(xì)胞裂解液，機(jī)械或超聲波室溫勻漿0.5min～1min。4℃10,000g～13,000g離心5min，取上清按照每4μl蛋白樣品加入1μl5×蛋白上樣緩沖液百分比混合。100℃水浴加熱3min～5min，以充分變性蛋白。冷卻到室溫，上樣到SDS膠加樣孔三、試驗(yàn)方法核酸分子雜交技術(shù)第56頁(yè)原理是依據(jù)大多數(shù)蛋白質(zhì)都能與陽(yáng)離子表面活性劑SDS按重量比結(jié)合成復(fù)合物使蛋白質(zhì)復(fù)合物所帶負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出天然蛋白質(zhì)分子所帶負(fù)電荷，消除了不一樣蛋白質(zhì)分子電荷效應(yīng)蛋白質(zhì)分子遷移速率完全取決于分子量大小，從而到達(dá)了分離不一樣分子量大小蛋白質(zhì)目標(biāo)

（二）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳核酸分子雜交技術(shù)第57頁(yè)膠有效分離范圍取決于用于灌膠聚丙烯酰胺濃度和交聯(lián)度。經(jīng)雙丙烯酰胺交聯(lián)后丙烯酰胺凝膠剛性和抗張強(qiáng)度都有所增加，形成小孔必須能夠允許SDS蛋白復(fù)合物經(jīng)過(guò)這些小孔孔徑隨雙丙烯酰胺、丙烯酰胺比率增加而變小，比率靠近1:20時(shí)孔徑到達(dá)最小值。普通按雙丙稀酰胺、丙烯酰胺為1:29配制核酸分子雜交技術(shù)第58頁(yè)表1SDS聚丙烯酰胺凝膠有效分離范圍

丙烯酰胺濃度（％）線性分離范圍（kD）1512～431016～687.536～94557～212核酸分子雜交技術(shù)第59頁(yè)1．SDS聚丙烯酰胺凝膠灌制

（1）安裝玻璃板（2）確定凝膠溶液體積，按所需丙烯酰胺濃度配制一定體積分離膠溶液。依次混合各成份（見下表）

一旦加入TEMED，馬上開始聚合，故應(yīng)馬上快速旋動(dòng)混合物并進(jìn)入下步操作核酸分子雜交技術(shù)第60頁(yè)表2積層膠、分離膠所需溶液成份配比溶液成份（ml）5%積層膠不一樣濃度分離膠6%8%10%12%15%水3.45.34.64.03.32.330%丙稀酰胺0.832.02.73.34.05.01.5mol/LTris(pH8.8)－2.52.52.52.52.51.0mol/LTris(pH6.8)0.63－－－－－10%SDS0.050.10.10.10.10.110%過(guò)硫酸胺0.050.10.10.10.10.1TEMED0.0050.0080.0060.0040.0040.004總體積（ml）51010101010核酸分子雜交技術(shù)第61頁(yè)（3）快速在兩板間隙灌注丙烯酰胺溶液，留出積層膠所需空間（梳子齒長(zhǎng)再加1cm）。然后小心在丙烯酰胺溶液上加一層去離子水。凝膠垂直放置于室溫下。（4）分離膠聚合完全后（約30min），傾斜倒出覆蓋去離子水。（5）配制5%積層膠。

核酸分子雜交技術(shù)第62頁(yè)（6）在已聚合分離膠上直接灌注積層膠，馬上在積層膠溶液中插入潔凈梳子。小心防止混入氣泡。（7）積層膠聚合完全后（約30min），小心移出梳子。將凝膠固定于電泳裝置上，上、下槽各加入Tris-甘氨酸電泳緩沖液。必須設(shè)法排出凝膠底部?jī)刹ＡО逯g氣泡。核酸分子雜交技術(shù)第63頁(yè)2．上樣和電泳取一定量樣品與上樣緩沖液混合后，加入上樣孔。將電泳槽與電源連接（正極應(yīng)接下槽），凝膠上所加電壓為8伏/cm。當(dāng)上樣緩沖液中染料前沿進(jìn)入分離膠