人類基因組技術(shù)課件

人類基因組計劃與后基因組時代TransgenicMouse,1982AchievementsofgeneengineeringTransgenicplant克隆羊“多莉”克隆羊“多莉”的研究者伊斯維姆.穆特Nucleustransferringcloning中心法則（TheCentralDogma）﹡DNA是遺傳信息的載體，能夠為生物活性產(chǎn)物（蛋白質(zhì)或RNA）編碼的DNA功能片段稱為基因(gene)。﹡DNA通過復(fù)制，將遺傳信息代代相傳。﹡通過基因表達（轉(zhuǎn)錄和翻譯），將DNA分子攜帶的遺傳信息轉(zhuǎn)變?yōu)榈鞍踪|(zhì)分子的氨基酸信息或RNA的信息，從而表現(xiàn)出生物體的各種遺傳性狀。﹡RNA參與遺傳信息的表達過程。﹡RNA也可作為遺傳信息的載體。﹡以RNA攜帶遺傳信息的病毒可以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成DNA。

核酸(nucleicacid) 是以核苷酸為基本組成單位的生物信息大分子，起攜帶和傳遞遺傳信息的作用。核酸的分類、分布及功能

脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid,DNA):

90%以上分布于細(xì)胞核，其余分布于線粒體內(nèi)。

儲存和攜帶遺傳信息。

核糖核酸(ribonucleicacid,RNA):

分布于胞核、胞質(zhì)、線粒體中。

參與遺傳信息的表達，病毒RNA也可作為遺傳信息的載體。

一、堿基(base)

堿基結(jié)構(gòu)：

二、戊糖

戊糖結(jié)構(gòu)：

三、核苷（ribonucleoside)：

嘌呤堿N-9或嘧啶堿N-1與核糖或脫氧核糖C-1′通過C-N糖苷鍵相連形成核苷或脫氧核苷。核苷的命名就是在核苷的前面加上堿基的名稱，如腺嘌呤核苷，簡稱腺苷；如果由脫氧核糖構(gòu)成的，就再加上“脫氧”二字，如脫氧胞嘧啶核苷，簡稱脫氧胞苷，依次類推（P.156表9－1）。核苷酸的命名：“核苷”＋“磷酸”：核苷一磷酸（nucleosidemonophosphate,NMP）

核苷二磷酸（nucleosidediphosphate,NDP）

核苷三磷酸（nucleosidetriphosphate,NTP）再加上堿基的名稱，就構(gòu)成了各種核苷酸的命名。五、核酸的一級結(jié)構(gòu)

指核酸中核苷酸的排列順序。又稱為核苷酸序列或堿基序列。核苷酸之間通過3，5-磷酸二酯鍵相連形成的線性大分子，稱為核苷酸鏈。(是前一核苷酸的3-OH和后一核苷酸的5-磷酸形成的)

書寫方法：從5到3方向DNA與RNA的區(qū)別核酸堿基核糖DNAA、G、C、T脫氧核糖RNAA、G、C、U核糖

一、DNA的二級結(jié)構(gòu)—雙螺旋結(jié)構(gòu) （一）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)研究背景

Chargaff規(guī)則：A=T，G=C；不同生物種屬的DNA堿基組成不同；同一個體的不同器官或組織的DNA堿基 組成相同。此外，F(xiàn)ranklin獲得了DNA的X線衍射照片，提示DNA是雙鏈的螺旋形分子。

（二）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)

1953年，Watson和Crick以Chargaff 規(guī)則為基礎(chǔ)，經(jīng)過對DNA晶體的X－射線衍 射分析，提出了右手DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。

4.兩條鏈通過堿基間的氫鍵相連，AT配對含兩 個氫鍵，CG配對含三個氫鍵，這種A-T、C-G 配對的規(guī)律，稱為堿基互補規(guī)則。

5.維持雙螺旋穩(wěn)定的因素：橫向為氫鍵，縱 向為堿基間的堆積力。

堿基互補配對：

（三）DNA結(jié)構(gòu)的多樣性 B型DNA雙螺旋是核酸二級結(jié)構(gòu)的重要 形式。當(dāng)改變了溶液的離子強度和相對濕度 時，DNA螺旋結(jié)構(gòu)可以改變，除B型外，還 有Z型及A型。 在體內(nèi)，不同構(gòu)象的DNA可能與基因表 達的調(diào)控有關(guān)。

三種類型DNA雙螺旋的比較

類型螺旋方向螺距(nm)每圈bp數(shù)螺旋直徑骨架走行存在條件A型右手螺旋2.311變寬平滑體外脫水B型右手螺旋3.4102nm平滑隨機DNA生理條件下Z型左手螺旋4.512變窄鋸齒型CG間隔排列區(qū)段

二、DNA的超級結(jié)構(gòu) （一）超螺旋：原核生物DNA的高級結(jié)構(gòu)。正超螺旋，負(fù)超螺旋

（二）核小體、

真核生物染色質(zhì)的基本組成單位是核小體。

核小體：DNA與組蛋白構(gòu)成；

1.H2A,H2B,H3,H4各兩分子構(gòu)成八聚體（核心組蛋白），DNA雙鏈纏繞形成核心顆粒2.連接DNA與組蛋白H1結(jié)合，將各核心顆粒連接成串株樣結(jié)構(gòu)。

3.由許多核小體形成的串珠樣結(jié)構(gòu)又進一步盤曲成直徑為30nm的中空的染色質(zhì)纖維，稱為螺線管。

螺線管再經(jīng)幾次卷曲才能形成染色單體。人類細(xì)胞核中有46條染色體，這些染色體的DNA總長達1.7m,經(jīng)過這樣的折疊壓縮，46條染色體總長亦不過200nm左右。

三、DNA的功能

以基因的形式攜帶遺傳信息；并作為基因復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的模板。它是生命遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)（基因的物質(zhì)基礎(chǔ)），也是個體生命活動的信息基礎(chǔ)。

基因：（從結(jié)構(gòu)上定義）是指DNA分子中的特定區(qū)段，其中的核苷酸排列順序決定了基因的功能。（從功能上定義）是為生物活性物質(zhì)編碼的DNA功能片段。mRNA的功能：

把核內(nèi)DNA的堿基順序(遺傳信息),按照堿基互補的原則,抄錄并轉(zhuǎn)送至胞質(zhì),在蛋白質(zhì)合成中用以翻譯成蛋白質(zhì)中氨基酸的排列順序(作為蛋白質(zhì)合成的模板)。mRNA分子上每3個核苷酸為一組,稱為三聯(lián)體密碼(tripletcode)。

tRNA的功能：

在蛋白質(zhì)合成中作為氨基酸的載體三、rRNA的結(jié)構(gòu)與功能

大亞基rRNA+核蛋白體蛋白→核蛋白體

(ribosome)小亞基

核蛋白體的組成亞基原核生物（70S）真核生物（80S）蛋白質(zhì)rRNA蛋白質(zhì)rRNA小亞基21種30S16S33種40S18S大亞基31種50S23S5S49種60S28S5.8S5S

rRNA的功能：

參與構(gòu)成核蛋白體，核蛋白體是蛋白質(zhì)合成的場所。

人類基因組計劃的問世和實施雖然人類已經(jīng)經(jīng)過多年的努力，但解開生命之謎的愿望還未實現(xiàn)。以往的失敗使大家認(rèn)識到，單靠一門學(xué)科的獨自努力太局限了，難以完成人類對自身的認(rèn)識和保護。美國投巨資的腫瘤十年計劃基本上以失敗告終就說明這個問題?，F(xiàn)在，人們認(rèn)識到先認(rèn)識全局再研究局部也許會訊捷和方便的多。于是，決定開始進行人的基因組的研究，由此形成了基因組學(xué)和人類基因組計劃.

2000年6月26日，六國科學(xué)家宣布完成了99%的測序計劃，獲得了HGP的“工作框架圖”（WorkingDraft），此為人類基因組計劃中的一個重要的里程碑。2003月4月,人類基因組計劃宣布測序工作全部提前完成。人類基因組計劃最初的目標(biāo)是：測定30億個堿基對的排列順序，確定基因在染色體上的位置，破譯人類全部遺傳信息。人類基因組計劃開展至今，對生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、生物技術(shù)和制藥工業(yè)產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響，一批新的交叉學(xué)科如功能基因組學(xué)，蛋白質(zhì)組學(xué)，藥物基因組學(xué)和生物信息學(xué)等應(yīng)運而生，并得到了迅速發(fā)展，成為新千年中生物科學(xué)研究中最活躍的領(lǐng)域。基因是控制生物體遺傳性狀的基本單元?；蚪M則是表示一個生物體所有遺傳信息的總和。人的單倍體基因組包括3×109堿基對（bp）?？傞L度約1米。有大約5萬～10萬個基因。一個生物體基因組所包含的信息決定了該生物體的生長、發(fā)育、繁殖和消亡等所有生命現(xiàn)象。人類基因組核基因組

分布在22條常染色體和X、Y性染色體上。線粒體基因組（雙鏈環(huán)狀DNA）經(jīng)典的“基因?qū)W”與“基因組學(xué)”的相同之處是研究基因,不同之處是在策略上,前者是“零敲碎打”,而后者是“整體闡明”，從整體上研究人類整個基因組的序列基因組學(xué)是以分子生物學(xué)技術(shù)，計算機技術(shù)和信息網(wǎng)絡(luò)技術(shù)為研究手段，以生物體內(nèi)全部基因為研究對象，在全基因背景下和整體水平上探討生命活動的內(nèi)在規(guī)律及其與內(nèi)外環(huán)境的關(guān)系的一門科學(xué)?；蚪M學(xué)的分類根據(jù)研究的目的可分為：結(jié)構(gòu)基因組學(xué)；建立高分辨率的遺傳、物理轉(zhuǎn)錄和序列等圖譜。功能基因組學(xué)；確定并分析基因組的全部功能。HGP的首要目標(biāo)是測定全部DNA序列，因目前的測序技術(shù)不能進行很長的DNA測序，因此計劃的第一階段要分解基因組這一巨大的研究對象，將其分為容易操作的小的區(qū)域，這個過程簡稱為染色體作圖。根據(jù)使用的標(biāo)記和手段的不同，HGP的基本任務(wù)可用4張圖譜來概括；即遺傳圖譜，物理圖譜，序列圖譜和表達圖譜。

1、遺傳圖譜（geneticmap）遺傳圖譜又稱遺傳連鎖圖（linkagemap）。是指基因或DNA標(biāo)志在染色體上的相對位置與遺傳距離。遺傳距離用重組率來衡量。即通過計算兩個連鎖的遺傳標(biāo)記在每次減數(shù)分裂中的重組概率，確定兩者的相對距離。其單位用厘摩（cM）表示。1厘摩表示每次減數(shù)分裂的重組頻率為１％。厘摩值越高表明遺傳標(biāo)志物兩點之間距離越遠(yuǎn)，值越低則兩點間距離越近。此基因定位屬遺傳學(xué)的研究范疇。遺傳圖既然是圖，就應(yīng)在圖上設(shè)標(biāo)記，標(biāo)記越細(xì)找到東西就越方便，在過去若干年里，標(biāo)記已有幾次從“粗”演變到“細(xì)”。遺傳圖譜的繪制需要應(yīng)用多態(tài)性標(biāo)志。所有“遺傳多態(tài)性”的分子基礎(chǔ)都是核酸的差異,人類基因組研究的主要內(nèi)容

遺傳多態(tài)性（Polymorphism）標(biāo)志

人類的DNA序列上平均每幾百個堿基會出現(xiàn)一些變異，這些變異通常不產(chǎn)生病理性后果，并按照遺傳規(guī)律由親代傳給子代，從而在不同個體間表現(xiàn)出不同，既遺傳多態(tài)性。多態(tài)性可用作為遺傳標(biāo)志。限制性片段長度多態(tài)性（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，RFLP）。RFLP是最早得到應(yīng)用的多態(tài)性標(biāo)記；不同個體的DNA在用某種限制性內(nèi)切酶水解時，會產(chǎn)生兩種不同長度的水解片段。是因為一個多態(tài)性位點出現(xiàn)在某種限制性內(nèi)切酶的酶切位點上造成的。RFLP最成功的運用是在Hungtington舞蹈癥的基因定位上。

但由于這類標(biāo)記數(shù)量較少，多態(tài)性信息因而較低。80年代發(fā)展起來的第二代多態(tài)性標(biāo)記包括:

可變數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)（VariableNumberTandemRepeats，VNTR）

VNTR分布在人類基因組的非編碼區(qū)，是一些串聯(lián)排列的十幾個堿基的重復(fù)序列，重復(fù)次數(shù)一般在十次左右。VNTR的等位基因常常在10個以上，信息量比RFLP大得多。

短串聯(lián)重復(fù)序列（shorttandemrepeat,STR）,又稱微衛(wèi)星(micro-satellite,MS)標(biāo)志。是一些由2-6個堿基組成的重復(fù)序列。微衛(wèi)星標(biāo)記在人類基因組中分布比較平均，數(shù)目較多，提供的信息量相對很大。

MS的出現(xiàn)不但使遺傳圖的精度得到了進一步提高，同時也成為物理圖譜上的標(biāo)志，從而促進了遺傳圖譜與物理圖譜的整合。單核苷酸多態(tài)性（SingleNucleotidePolymorphism，SNP）第三代SNP是一種雙等位的多態(tài)性標(biāo)記，多態(tài)性僅表現(xiàn)為單個核苷酸的差異。SNP在基因組中的數(shù)目多，可達到300萬個，平均每1000個堿基對就有一個。因而成為一種信息量非常大的遺傳標(biāo)記系統(tǒng)。SNP可能在密度上達到人類基因組“多態(tài)”位點數(shù)目的極限。SNP與RFLP、STR等DNA標(biāo)記的不同,是不再以“長度”的差異作為檢測手段,而直接以序列的差異作為標(biāo)記。SNP成為研究基因多樣性和識別、定位疾病基因的一種新型手段這種標(biāo)記覆蓋密度大，為DNA芯片技術(shù)應(yīng)用于遺傳作圖提供了基礎(chǔ)。SNP的一個突出優(yōu)點是可以利用多種技術(shù)手段方便的檢出，因而在醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

SNP2、遺傳圖譜的應(yīng)用

通過遺傳圖譜，可大致了解各個基因或DNA片斷之間的相對距離與方向，如哪個基因更靠近著絲粒，哪個更靠近端粒等。遺傳距離是通過遺傳連鎖分析獲得的，遺傳圖譜不僅是定位基因的重要手段，即使在人類基因組物理圖譜建立起來之后，它依然是研究人類基因組遺傳與變異的重要手段。

二.物理圖譜

即確定兩個遺傳標(biāo)記之間的實際（絕對）距離。物理圖以一段已知核苷酸序列的片段STS序列為路標(biāo)，以堿基對數(shù)目的多少為圖距表示，圖距基本單位是Mb、kb、bp。序列標(biāo)簽位點（SequenceTaggedSites，STS）用來確定相連或重疊的DNA片段,近而確定片段在基因組的位置。首先，物理圖要獲得大量定位明確STS，其次，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建覆蓋每條染色體的大片段DNA的連續(xù)克隆系，為最終完成全序列的測定奠定基礎(chǔ)。

2、物理圖譜的應(yīng)用

首先，物理圖要獲得大量定位明確STS，每個基因、每條染色體，每一個個體的基因組都具有其特異的物理圖。其次在此基礎(chǔ)上構(gòu)建覆蓋每條染色體的大片段DNA的連續(xù)克隆系，為最終完成大規(guī)模全序列的測定奠定基礎(chǔ)。物理圖譜是進行DNA分析和基因結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)。

三、序列圖譜

是分別將各染色體全部堿基序列繪制的圖譜。包括轉(zhuǎn)錄序列和非轉(zhuǎn)錄序列。目前的策略是把龐大的基因組分成若干有路標(biāo)的區(qū)域后，進行測序分析。將測出的每一個DNA片段按其染色體位置進行準(zhǔn)確的排列，從而得到人類基因組DNA序列的全貌。測序方法有多種：全基因組的“鳥槍法”測序策略，cDNA測序，及BACDNA測序等。目前，我們可以從基因網(wǎng)的數(shù)據(jù)庫中查到所有基因的序列

人類基因組測序中國實驗室探密

1990年10月，被譽為生命科學(xué)″阿波羅登月計劃″的國際人類基因組計劃啟動。1999年9月，中國獲準(zhǔn)加入人類基因組計劃，負(fù)責(zé)測定全部序列的1％。承擔(dān)"1％"主要測序任務(wù)的中科院遺傳所人類基因組中心坐落在北京順義空港工業(yè)園B區(qū)，一座并不顯眼的四層樓內(nèi)。

1998年8月11日，中科院遺傳所的"人類基因組中心"開張。1999年2月，中心決定搞大規(guī)?；蚪M測序，以創(chuàng)造加入"國際測序俱樂部"的條件。同年7月7日，中國在國際人類基因組測序協(xié)作組登記，申請加入"國際測序俱樂部"。9月1日，在倫敦舉行的第五次人類基因組測序戰(zhàn)略會議上，北京中心（中科院遺傳所人類基因組中心）作為新的會員加入。目前我國已啟動了"中國生物資源基因組計劃"，第一個項目是水稻；第二個將是豬，人類的器官移植需要它們；第三個是血吸蟲，現(xiàn)在血吸蟲病還沒有消滅，并且還在回頭。

中國科學(xué)家今年4月提前完成了人類基因組計劃1％的測序任務(wù)，使得這一由六國參加的重大生物工程于6月26日如期完成。通過參與這一國際項目，中國的基因組測序能力一舉進入世界四強，為21世紀(jì)的中國生物產(chǎn)業(yè)帶來了光明和希望。生物信息學(xué)（bioinformatics）是一門新興的交叉學(xué)科。既涉及生物又涉及物理。是伴隨基因組研究而產(chǎn)生的?；蚪M研究需要依賴生物信息學(xué)。因伴隨著研究，相關(guān)信息出現(xiàn)了爆炸性增長，需要對海量信息進行處理和數(shù)據(jù)分析。更為本質(zhì)的原因是基因組數(shù)據(jù)的復(fù)雜性。如何讀懂它是個極大的難題。要解決問題就得發(fā)展分析理論、方法、技術(shù)、工具，必須依賴計算機的信息處理。人類基因組研究的目的，不是為了單純地積累數(shù)據(jù)，而是要揭示大量數(shù)據(jù)中所蘊藏的內(nèi)在規(guī)律，從而更好地認(rèn)識和保護生命?；蚪M研究最終是把生物學(xué)問題轉(zhuǎn)化成對數(shù)字符號的處理問題。要解決數(shù)據(jù)的問題，就必須依賴計算機的信息處理。Supercomputer具體地說，是把基因組序列信息作為源頭，找到序列中代表蛋白質(zhì)和基因的編碼區(qū)；同時闡明基因組中大量存在的非編碼區(qū)的信息實質(zhì)，破譯隱藏在序列中的遺傳語言規(guī)律。在此基礎(chǔ)上，歸納、整理與基因組遺傳信息釋放及其調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄譜和蛋白質(zhì)譜的數(shù)據(jù)，從而認(rèn)識代謝、發(fā)育、分化、進化的規(guī)律。有兩項生物信息學(xué)是重要的：*構(gòu)建與疾病相關(guān)的人類基因信息數(shù)據(jù)庫（包括SNP數(shù)據(jù)庫）*發(fā)展有效地分析基因分型數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)算法，特別是將SNP數(shù)據(jù)與疾病和致病因素相關(guān)的計算方法。HGP決定性的成功取決于生物信息學(xué)和計算機生物學(xué)的發(fā)展和應(yīng)用，主要體現(xiàn)在數(shù)據(jù)庫對數(shù)據(jù)的儲存能力和分析工具的開發(fā)。這些都將成為人類基因組計劃延伸篇中的主要內(nèi)容。。。

后基因組計劃（post-genomeproject）

完成測序后意味著結(jié)構(gòu)基因組學(xué)的結(jié)束。人類邁入了后基因組時代－功能基因組的研究時代，其研究內(nèi)容是對基因組的功能進行探索。功能基因組學(xué)核心問題主要包括：基因組的多樣性研究，基因組的表達及其時間、空間調(diào)控；模式生物體基因組研究等。其中以生物芯片測試功能基因表達圖譜，以遺傳工程模式動物測試基因功能為主要手段。模式動物構(gòu)建的關(guān)鍵在于轉(zhuǎn)基因或基因敲除。還包括：“蛋白質(zhì)組”計劃、“環(huán)境基因組學(xué)”、“藥物基因組學(xué)”、“癌腫基因組解剖學(xué)計劃”總之，人類基因組計劃的內(nèi)涵和外延將不斷地擴展。

用實驗方法，把外源目的基因整合到動物受精卵或胚胎干細(xì)胞的基因組中，再導(dǎo)入動物子宮，使之發(fā)育成個體，并把目的基因遺傳給子代的動物。世界上第一只轉(zhuǎn)基因動物巨鼠，是將大白鼠生長激素基因?qū)胄“资蟮氖芫阎?，再將這個受精卵移入借腹懷胎的母鼠子宮中，產(chǎn)下小白鼠比一般的大一倍。這只在遺傳學(xué)上具有重大意義的轉(zhuǎn)基因動物的研究培育成功，展現(xiàn)出誘人的光明前景。

由注射癌癥相關(guān)基因的胚胎培養(yǎng)而成的“癌癥小鼠”已獲得專利。這些小鼠已用作癌癥研究中的治療模型。轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)第一代轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)起源于80年代末期。它對于生命科學(xué)的研究帶來了革命性的變化。但第一代技術(shù)不具備時間和空間特異性。

1993年第二代區(qū)域和組織特異性基因敲除和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究。1996年首次創(chuàng)造了國際上第一個腦區(qū)特異性的基因敲除模式動物。被譽為條件性基因敲除研究的里程碑。第三代基因敲除技術(shù)以時間可調(diào)性和區(qū)域特異性為標(biāo)志的。目前，第四代（特定蛋白質(zhì)條件性可誘導(dǎo)敲除）基因工程技術(shù)研究也取得了突破性進展。

制備轉(zhuǎn)基因動物的三個必不可少的步驟是：·欲轉(zhuǎn)移DNA的構(gòu)建——轉(zhuǎn)基因可通過常規(guī)重組DNA技術(shù)完成。包括目的基因以及基因有效表達所必需的啟動子或調(diào)控區(qū)?！せ驑?gòu)建物的插人以及引導(dǎo)其進入基因組

．構(gòu)建子插入到受精卵或胚胎中一旦證實基因得到表達，該雜合子與非轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，所產(chǎn)生的雜合子代之間相互雜交以產(chǎn)生雜合的轉(zhuǎn)基因小鼠。轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)已用于魚、小鼠、大鼠、豬、綿羊、山羊以及奶牛等。轉(zhuǎn)基因動物基因操作技術(shù)：目前制備的方法有受精卵或早期胚胎的直接操作或體外多能干細(xì)胞的操作。下列方法可將基因直接導(dǎo)入哺乳動物種系中：．通過顯微注射將DNA直接導(dǎo)人受精卵前核中。．利用攜帶目的基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染植入前胚胎。．利用胚胎干細(xì)胞滅活或破壞特定的基因(靶基因置換)。

在功能基因組時代各種疾病模型動物的需求量大增。

基因敲除（geneknockout）技術(shù)（或基因靶向滅活）是80年代發(fā)展起來的一門新技術(shù)。指有目的去除動物體內(nèi)某一特定基因的技術(shù)。應(yīng)用DNA同源重組技術(shù)將滅活的基因?qū)肱咛ジ杉?xì)（ES），以取代目的基因，篩選已靶向滅活的細(xì)胞，微注射入小鼠囊胚，該細(xì)胞參與胚胎發(fā)育，形成嵌合型小鼠，進一步傳代培育，可得到純合基因剔除鼠?；蚯贸稍诩?xì)胞水平進行而建立新的細(xì)胞系，或在整體水平，然后從整體觀察實驗動物，推測相應(yīng)基因的功能。該項技術(shù)將成為“后基因時代”研發(fā)的核心技術(shù)。世界各國已經(jīng)開始投巨資于這一領(lǐng)域。北京市在此方面已具備了一定的產(chǎn)業(yè)化基礎(chǔ)。

制備基因敲除小鼠的主要步驟1。獲得外源目的基因；與宿主的基因組序列必須有同源性。2。靶向載體；必須是真核表達載體。含較高效率的啟動子，含選擇性標(biāo)記基因，新霉素抗性基因neo可

阻斷目的基因。3。構(gòu)建同源打靶重組子；目的是使體內(nèi)的特定野生基因失活。滅活特定基因可用標(biāo)志基因插入或置換目的基因的一個外顯子，或控制基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)序列，就可以滅活或敲除特定的內(nèi)源性野生基因。通過序列置換載體，將選擇的標(biāo)志因及其啟動子插在同源重組子的中間，使外源靶向基因被分隔在選擇標(biāo)志基因的兩側(cè)，可使小鼠體內(nèi)的同源基因發(fā)生重組取代。4。小鼠ES細(xì)胞的準(zhǔn)備。5。打靶重組子導(dǎo)入ES細(xì)胞及藥物篩選。

在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用*建立疾病的動物模型，探討疾病的發(fā)生機制。如高脂血癥/動脈硬化動物模型。*作為新的治療方法和藥物的篩選?；蚯贸煽焖俣ㄎ恢虏“谢?，進而針對該致病基因開發(fā)有效藥物。在我國留美學(xué)者的積極參與下，美國密蘇里大學(xué)在世界上首次運用基因敲除技術(shù)，培育出基本不含人體免疫排斥基因的克隆豬?？晒┮浦驳娜梭w器官不足一直是困擾醫(yī)學(xué)界的難題。為解決這一問題，科學(xué)家們將目光投向了豬。

豬的器官在大小、結(jié)構(gòu)和功能上與人體器官相近，一向是異種器官移植的主要研究目標(biāo)。但豬細(xì)胞表面有一種半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，會導(dǎo)致人體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生強烈排異反應(yīng)。用基因敲除手段抑制這一酶活性，再結(jié)合克隆技術(shù)，用克隆豬器官解決器官移植，能大量生產(chǎn)適合人體移植的豬器官，因此，基因敲除克隆豬培育成功的消息備受關(guān)注?？茖W(xué)界普遍認(rèn)為，這是向異種器官移植邁出的關(guān)鍵一步。

生物芯片技術(shù)（biochip）是90年代中期以來影響最深遠(yuǎn)的重大科技進展之一，是融微電子學(xué)、生物學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)、計算機科學(xué)為一體的高度交叉的新技術(shù)，具有重大的基礎(chǔ)研究價值，又具有明顯的產(chǎn)業(yè)化前景。該技術(shù)具有多種應(yīng)用價值，如基因表達譜測定、突變檢測、多態(tài)性分析、基因組文庫作圖及雜交測序。該技術(shù)被評為1998年度世界十大科技進展之一。

生物芯片技術(shù)DNA微陣列(DNAMicroarray)。指采用光導(dǎo)原位合成或微量點樣等方法，將大量生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至組織切片、等生物樣品有序地固化于支持物（如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝膠、尼龍膜等）的表面，組成密集二維分子排列，然后與標(biāo)記的待測生物樣品中的靶分子雜交，通過特定的儀器檢測雜交后芯片熒光強度分布，迅速得出所要的信息。由于常用玻片/硅片作為固相支持物，且在制備過程模擬計算機芯片的制備技術(shù)，所以稱之為生物芯片技術(shù)。根據(jù)芯片上的固定的探針不同，生物芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細(xì)胞芯片、組織芯片。而基因芯片中，最成功的是DNA芯片，即將無數(shù)預(yù)先設(shè)計好的寡核苷酸或cDNA在芯片上做成點陣，與樣品中同源核酸分子雜交的芯片。

芯片雜交熒光檢測掃描結(jié)果

基因芯片雜交結(jié)果由計算機綜合處理解讀生物學(xué)意義

應(yīng)用領(lǐng)域：它能在同一時間內(nèi)分析大量的基因，使人們準(zhǔn)確高效地破譯遺傳密碼。這將是繼大規(guī)模集成電路后又一次意義深遠(yuǎn)的科技革命。這種面積為2.25平方厘米的芯片上可承載幾千至上百萬個基因點，用它進行病理測試時，人體內(nèi)所有的“生病”基因均可顯示，這樣就給醫(yī)生治療提供了依據(jù)。1.基因表達水平的檢測2.基因診斷3.藥物篩選4.測序5.生物信息學(xué)研究

人類基因組研究的應(yīng)用

人類基因組計劃的成果不僅可以揭示人類生命活動的奧秘，而且人類6千多種單基因遺傳性疾病和嚴(yán)重危害人類健康的多基因易感性疾病的致病機理有望得到徹底闡明，為這些疾病的診斷、治療和預(yù)防奠定基礎(chǔ)。同時，人類基因組計劃的實施還將帶動醫(yī)藥業(yè)、農(nóng)業(yè)、工業(yè)等相關(guān)行業(yè)的發(fā)展，產(chǎn)生極其巨大的經(jīng)濟效益和無法估量的社會效益。各種人類基因組圖譜使尋找與特定遺傳疾病有關(guān)的基因的工作變得容易。

１、

在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用

（1）對特殊疾病基因的確定人體的各種器官和組織常受到各種特殊疾病的侵襲，但常規(guī)醫(yī)療手段無法進行診斷和治療。通過認(rèn)識這些疾病的基因序列及確定發(fā)生了規(guī)律性改變的DNA片段，為這類疾病的診斷和治療提供了可能。比如，家族性早老年癡呆癥、杜興肌營養(yǎng)不良、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、亨廷頓舞蹈癥和等基因就是依賴于人類基因組計劃的實施。

利用DNA克隆庫和限制酶切圖譜，人們可以對正常的患者的DNA進行有效的分析比較，達到對某一疾病的基因進行定位的目的。

人類基因組的DNA全序列將有助于證實假定存在的所有基因，可為分析病人DNA樣品的序列提供一個數(shù)據(jù)庫。

（2）有利于優(yōu)生和產(chǎn)前診斷醫(yī)生和遺傳學(xué)家可以通過基因檢測，識別出帶有遺傳疾病的胚胎細(xì)胞，如：鐮狀細(xì)胞性貧血。在不久的將來，胎兒期的檢測也許能夠預(yù)測一般的常見病，比如：肥胖癥、抑郁癥和心臟病等。

（3）加強對癌癥的認(rèn)識和治療

癌癥的高死亡率嚴(yán)重地威脅著人類生命。癌癥是由于細(xì)胞生長失控造成的。而失控是因特定基因的異常造成的。遺傳的缺陷會使人體對特定的癌癥具有高的易感性。尋找與癌癥相關(guān)的基因的研究是當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究的熱點之一。一旦確定了易感基因，就可以進行癌前或早期癌癥的特殊監(jiān)護和治療。

人類對癌癥的認(rèn)識已有很大的進步，但仍然存在著許多問題，這些問題的解決將依賴于人類基因組計劃的研究。

２、在基礎(chǔ)理論研究方面的應(yīng)用（1）確定人類基因組中基因的序列、組織和物理位置，有利于研究基因的功能以及它們相互之間在表達和調(diào)控機制方面的聯(lián)系上理解基因轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控。（2）從整體上了解染色體結(jié)構(gòu)，包括各種重復(fù)序列以及非轉(zhuǎn)錄序列的大小。在染色體結(jié)構(gòu)、DNA復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄和表達調(diào)控中的影響和作用。(3)研究空間結(jié)構(gòu)對基因調(diào)控的作用。基因表達調(diào)控是功能基因組學(xué)研究的主要內(nèi)容之一。不同條件下基因表達譜的變化是基因組調(diào)控的結(jié)果。（4）研究正常基因與突變基因的差別，會幫助闡明與正常的生理學(xué)和疾病發(fā)生有關(guān)的新的生化和細(xì)胞學(xué)機制。盡快地確定出疾病基因，能使研究者對該基因的蛋白產(chǎn)物及其細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)進行深入的研究。（5）利于確立有重要功能意義的基因組組構(gòu)的特征。

人類染色體含有許多不是基因的片段，一些特定片段對細(xì)胞分裂前染色體復(fù)制和確保染色體組正確地分配到兩個子細(xì)胞中是不可缺少的。

這些片段的性質(zhì)及功能的機制鮮為人知，人類基因組的物理圖譜將為探討這些特定片段性質(zhì)及作用的實驗打下基礎(chǔ)。（6）發(fā)現(xiàn)新的基因和蛋白質(zhì)。迄今僅有少數(shù)參與正常和疾病的人類基因被確定。對人類基因組作圖和測序?qū)_定出大量新的人類基因及其編碼的蛋白質(zhì)。另外，物理圖譜將有助于對那些已大體定位在染色體上，但尚未分離出的基因進行精確定位。３、在生物學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用

（1）生物進化研究

人類基因組記載著人類的進化史。如果知道了人和其它生物基因組的全序列，就有可能追溯出人類基因的起源。因為所有哺乳動物有著相似的蛋白質(zhì)譜，所以哺乳動物之間的差異主要表現(xiàn)在受控的基因表達的時間、表達的水平，以及細(xì)胞類型專一的調(diào)控信號等方面。人胚胎的有序發(fā)育需要特定的場所和時間的活化，使多潛能細(xì)胞成為新類型的細(xì)胞，這一過程至少部分地受控于位于基因附近的調(diào)節(jié)順序。這些順序在其活化的基因中大多是同源的。對人類基因組進行順序分析，并將與其它哺乳動物進行比較，將使我們能確定出大量的調(diào)節(jié)順序。此外，我們將了解基因調(diào)控的規(guī)律，及其在人從其它哺乳動物分化出來的過程中在分子水平上所發(fā)生的變化。

（2）分子考古研究真核生物基因組中，編碼序列僅占一小部分，而絕大部分的序列是非編碼序列。其中相當(dāng)于轉(zhuǎn)座元件的重復(fù)序列家族又占據(jù)了相當(dāng)大的一部分。轉(zhuǎn)座元件可以通過RNA中間產(chǎn)物的逆轉(zhuǎn)錄，或DNA自身的切割和整合來完成轉(zhuǎn)座功能。

重復(fù)序列可能具有以下功能：1）作