哺乳動物與胚胎干細(xì)胞技術(shù)

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)研究生課程論文論文題目 哺乳動物與胚胎干細(xì)胞技術(shù)課程名稱 畜牧學(xué)理論與技術(shù)學(xué)號專業(yè)導(dǎo)師院所 動物科技學(xué)院評閱評語評閱成績—閱卷老師四川農(nóng)業(yè)大學(xué)研究生院制2014年12月29日哺乳動物與胚胎干細(xì)胞技術(shù)(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院)摘要：胚胎性干細(xì)胞包括從動物早期胚胎的卵裂球、囊胚內(nèi)細(xì)胞團細(xì)胞分離建系的胚胎干細(xì)胞(embryonicstemcell,ESC)、從胚胎生殖嵴原始生殖細(xì)胞(primordialgermcell,PGC)分離建系的胚胎生殖細(xì)胞(embryonicgermcell，EGC)和來源于畸胎瘤中的胚胎性癌細(xì)胞(embryoniccarcinomacell，ECC)。ESC具有發(fā)育分化的多潛能性和無限的自我更新能力,能在體外長期培養(yǎng)并具有向機體各種組織細(xì)胞分化的潛能。所以,被廣泛應(yīng)用于胚胎發(fā)育與細(xì)胞分化調(diào)控的研究，作為修復(fù)器官與器官移植的種子細(xì)胞，并可用于轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)。本文主要綜述了干細(xì)胞的生物學(xué)特質(zhì)，ESC培養(yǎng)擴增誘導(dǎo)機制，定向分化方法及其實際應(yīng)用和最新研究進展。關(guān)鍵詞：哺乳動物；胚胎干細(xì)胞；胚胎干細(xì)胞技術(shù)；分化MammalianembryonicstemcellstechnologyRanJinshanS20143108(CollegeofAnimalScienceandTechnology,SichuanAgriculturalUniversity)Abstract:Embryonicstemcellsfromanimals,includingearlyembryonicblastomeric,embryonicinnercellmasscellsisolatedstemcelllineestablishment(embryonicstemcell,ESC),isolatedfromtheembryonicgenitalridgeprimordialgermcells(primordialgermcell,PGC)buildsystemembryonicgermcells(embryonicgermcell,EGC)andderivedteratomainembryonalcarcinomacells(embryoniccarcinomacell,ECC).ESChasdevelopedpluripotentdifferentiationandunlimitedself-renewalcapacity,long-termtrainingandhavethepotentialtovarioustissuesofthebodycelldifferentiationinvitro.So,arewidelyusedtostudytheregulationofembryonicdevelopmentandcelldifferentiation,andrepairorgansandorgantransplantationasseedcellscanbeusedtoproducetransgenicanimals.Thispapersummarizesthecharacteristicsofstemcellbiology,ESCculturesinducedamplificationmechanism,thelatestresearchadvancesanddifferentiationmethodsandtheirpracticalapplicationorientation.Keyword:Mammals;embryonicstemcells;embryonicstemcelltechnology;differentiation胚胎干細(xì)胞(Embryonicstemcells,ESC)是從附置前早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(ICM)或附置后胚胎原始生殖細(xì)胞(Primordialgermcells，PCGs)分離克隆出來的一種具無限增殖能力和全向分化能力的干細(xì)胞。既像培養(yǎng)的一般細(xì)胞那樣，可擴增、遺傳操作選擇和凍存，且不失其全能性(多能性)；又類似于胚胎細(xì)胞，含有正常的二倍體核型，具有發(fā)育的全能性和多能性。ESC具有與早期胚胎細(xì)胞相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核大，有一個或幾個核仁，胞核中多為常染色質(zhì)，胞質(zhì)胞漿少，結(jié)構(gòu)簡單。在適當(dāng)條件下ESC細(xì)胞可被誘導(dǎo)分化為多種細(xì)胞組織，也可與受體胚胎嵌合，生產(chǎn)包括生殖系在內(nèi)的各種組織的嵌合體個體。因此ESC細(xì)胞就成為研究哺乳動物早期胚胎發(fā)生、細(xì)胞組織分化、基因表達調(diào)控等發(fā)育生物學(xué)基礎(chǔ)研究的一個非常理想的模型系統(tǒng)和非常有用的工具，也是進行動物胚胎工程研究生產(chǎn)和臨床醫(yī)學(xué)研究的一個重要途徑。胚胎干細(xì)胞生物學(xué)特性無限增殖性胚胎干細(xì)胞在不分化的前提下通過體外培養(yǎng)可大量擴增，并且迅速增殖，每18?24h增殖1次。胚胎干細(xì)胞在體外適宜的條件下可以穩(wěn)定傳代，具有長期培養(yǎng)保持發(fā)育的潛能。高度的分化全能性(多能性)指ESC在解除分化抑制的條件下能參與包括生殖腺在內(nèi)的各種組織的發(fā)育潛力，即ESC具有發(fā)育成完整動物體的能力，可以為細(xì)胞的遺傳操作和細(xì)胞分化研究提供豐富的試驗材料。ESC發(fā)育全能性的標(biāo)志是其細(xì)胞表面表達時相專一性胚胎抗原(Stagespecificembryonicant，SSEA)，而且可以檢查到OTC4基因的表達，這兩種蛋白是發(fā)育全能性的標(biāo)志。ESC細(xì)胞的多能性是指ESC具有發(fā)育成多種組織的能力，參與部分組織的形成。將ESC培養(yǎng)在不含分化抑制物的培養(yǎng)基上，可以形成類胚體。將ESC在特定培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，可以定向分化成特定組織，如ESC在含有白血病抑制因子(LIF)和維生素A酸(RA)的培養(yǎng)基上，可以分化形成全壁內(nèi)胚層，將ESC細(xì)胞與胚胎細(xì)胞共培養(yǎng)或?qū)SC注入囊胚腔中，ESC就會參與多種組織的發(fā)育。種系傳遞性盡管多能干細(xì)胞具有高度分化的潛能，但如果把它移植入動物體內(nèi)并不能發(fā)育成胚胎。若把多能干細(xì)胞注射到受體胚胎內(nèi)，融合后再植入假孕母體子宮，就能參與宿主胚胎各組織器官的生長發(fā)育，通過育種可以獲得帶有多能干細(xì)胞遺傳性狀的后代，此即為多能干細(xì)胞的種系傳遞功能。1.4在體外的遺傳可操作性胚胎干細(xì)胞可在體外進行各種遺傳操作，如導(dǎo)入外源基因、或利用同源重組的方法插入或刪去某個特定的基因，誘導(dǎo)基因突變，基因打靶或?qū)腩~外的原有基因使基因的表達增加。從理論上說，胚胎干細(xì)胞經(jīng)遺傳操作后，仍保持其發(fā)育的全能性。因此，可應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)和對有基因突變或過量表達的純合子或雜合子個體進行基因功能的分析。ESC定向分化調(diào)節(jié)機制闡明控制ESC多能性、自我更新和細(xì)胞分化的分子機制，了解單個基因產(chǎn)物的功能和調(diào)節(jié)是極其重要的。ESC的定向分化受內(nèi)源性因素和外源性因素的共同調(diào)節(jié)。內(nèi)源性調(diào)控內(nèi)源性因素即不同基因在不同時間和空間的開啟和關(guān)閉及各種轉(zhuǎn)錄因子等。干細(xì)胞自身有許多調(diào)控因子，可對外界信號起反應(yīng)從而調(diào)節(jié)其增殖和分化。細(xì)胞蛋白的調(diào)控已經(jīng)知道有若干蛋白質(zhì)和生長因子在細(xì)胞內(nèi)外起重要作用。細(xì)胞的結(jié)構(gòu)蛋白，特別是細(xì)胞骨架成分對細(xì)胞的發(fā)育非常重要。轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控在胚胎發(fā)育過程中之所以能相繼分化出各種新類型細(xì)胞，是由于相關(guān)基因相繼活化而合成特異蛋白的結(jié)果。細(xì)胞定型時是通過強化某些基因的表達并抑制另一些基因的表達來形成某個單一譜系所特有的基因表達型。Oct-4和Nanog是兩種維持干細(xì)胞多能性和自我更新的轉(zhuǎn)錄因子，Oct-4是哺乳動物早期胚胎細(xì)胞表達的轉(zhuǎn)錄因子，它誘導(dǎo)表達的靶基因產(chǎn)物是成纖維生長因子-4(FGF-4)等生長因子，能夠通過生長因子的旁分泌作用調(diào)節(jié)干細(xì)胞以及周圍滋養(yǎng)層的進一步分化。Oct-4缺失突變的胚胎只能發(fā)育到囊胚期，其內(nèi)部細(xì)胞不能發(fā)育成內(nèi)層細(xì)胞團。Nanog基因維持ESC的不分化狀態(tài)。Nanog基因缺陷的ESC失去多能性，開始分化。Nanog是Oct-4基因啟動后維持內(nèi)細(xì)胞團全能性所必需的。它們通過結(jié)合靶基因調(diào)控區(qū)，選擇性地抑制分化基因表達或促進多能性基因表達。通常只在多能干細(xì)胞中表達，在分化細(xì)胞中不表達。在不同的發(fā)育階段，它們的表達量受到特異調(diào)控。2.2外源性調(diào)控細(xì)胞內(nèi)基因表達的調(diào)控作用是ESC發(fā)生分化的決定因素。細(xì)胞所在的環(huán)境條件對ESC的分化也有重要影響。分泌因子間質(zhì)細(xì)胞能夠分泌許多因子，維持干細(xì)胞的增殖、分化。有兩類因子在不同組織中都發(fā)揮重要作用，TGF-B（轉(zhuǎn)錄生長因子）家族和Wnt信號通路。Wnt的作用機制是通過阻止B-Catenin分解從而激活Tcf/Lef介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，促進干細(xì)胞的分化。蛋白信號有些信號是通過細(xì)胞-細(xì)胞的直接接觸起作用的。B-Catenin就是一種介導(dǎo)細(xì)胞黏附連接的結(jié)構(gòu)成分。穿膜蛋白Notch及其配體Delta或Jagged也對干細(xì)胞分化有重要影響。當(dāng)Notch與其配體結(jié)合時，干細(xì)胞進行非分化性增殖；當(dāng)Notch活性被抑制時，干細(xì)胞進入分化程序，發(fā)育為功能細(xì)胞。ESC誘導(dǎo)分化3.1誘導(dǎo)分化方法目前所使用的誘導(dǎo)方法主要包括：外源性生長因子誘導(dǎo)ESC分化、轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)ESC分化、ESC與其他細(xì)胞共培養(yǎng)的方式誘導(dǎo)ESC分化等。3.1.1外源細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)ESC分化體外培養(yǎng)下，ESC對細(xì)胞因子具有依賴性。利用細(xì)胞因子誘導(dǎo)ESC朝一定方向分化時，一般采用分階段的辦法，即先得到類胚體（embryoidbodies，EB），再在EBC的基礎(chǔ)上進一步誘導(dǎo)使其分化為目的細(xì)胞。3.1.2轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)ESC分化細(xì)胞因子誘導(dǎo)分化的方法雖然操作簡便，但其誘導(dǎo)產(chǎn)生的成熟細(xì)胞數(shù)量較少，而且純度較低。利用轉(zhuǎn)基因方法誘導(dǎo)ESC定向分化主要是利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)使某個促分化基因在ESC中過表達，從而調(diào)節(jié)ESC的分化。特異性轉(zhuǎn)錄因子異位表達誘導(dǎo)esc分化是將細(xì)胞系特異表達基因?qū)隕SC,使其表達產(chǎn)生特異性轉(zhuǎn)錄因子。細(xì)胞系特定轉(zhuǎn)錄因子的異位表達可誘導(dǎo)ESC分化為目的細(xì)胞系。因此利用此法誘導(dǎo)ESC分化為目的細(xì)胞系,必須建立適宜細(xì)胞系特異性轉(zhuǎn)錄因子的異位表達載體系統(tǒng)。3.1.3細(xì)胞共培養(yǎng)的方式誘導(dǎo)ESC分化ESC生長的微環(huán)境對ESC分化有很大的影響。為了使ESC維持不分化狀態(tài)，

人們選擇在鼠胚胎成纖維細(xì)胞制作的飼養(yǎng)層上培養(yǎng)ESC；并在培養(yǎng)基中添加LIFO定向誘導(dǎo)分化為其他細(xì)胞ESC可在體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、造血細(xì)胞、肝細(xì)胞、胰島B細(xì)胞、滋養(yǎng)層細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞等多種細(xì)胞類型。胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)分為胚胎的獲得與培養(yǎng)、內(nèi)細(xì)胞團的分離傳代、干細(xì)胞集落的分離傳代、干細(xì)胞的鑒定四部分。具體操作過程略。胚胎干細(xì)胞的應(yīng)用前景生產(chǎn)克隆動物自從世界上第1只克隆綿羊“多莉”問世后，ESC參與克隆動物的研究也開始起步。胚胎干細(xì)胞將為動物克隆提供高效的載體，高等哺乳動物性生殖周期長、產(chǎn)仔少，這對于優(yōu)良品種的高效利用和迅速繁衍帶來了困難。利用良種家畜胚胎分離克隆ESC進行核移植，可使一頭良種家畜在短期內(nèi)生產(chǎn)大量具有遺傳同質(zhì)型的動物。不僅可以充分發(fā)揮良種家畜的生產(chǎn)潛力，而且可以迅速擴大良種家畜群體規(guī)模，大大加快家畜育種工作的進程。性別控制性別控制是指通過人為地干預(yù)雌性動物繁殖后代性別的一種繁殖技術(shù)。通過性別控制可使受性別限制的生產(chǎn)性狀和受性別影響的生產(chǎn)性狀獲得更大的經(jīng)濟效益。研究結(jié)果表明，誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞在體外可誘導(dǎo)分化為包括生殖細(xì)胞在內(nèi)的各種細(xì)胞類型。因此，將誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為精子,再根據(jù)X精子和Y精子DNA含量的不同，利用流式細(xì)胞儀進行分離，然后將分離的精子進行體外受精即可實現(xiàn)家畜的性別控制。4.3生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物用ESC做載體，將外源基因?qū)肷诚瞪a(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物。ESC能夠高效地進行外源基因?qū)?、基因敲除和基因改造等遺傳修飾操作，通過隨機或定向整合，將外源DNA插入到基因組中。經(jīng)過篩選可獲得陽性細(xì)胞，然后將陽性細(xì)胞注入囊胚腔或與其他胚胎聚合可獲得嵌合體后代。用ESC生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物，打破了物種的界限，加速了動物遺傳變異程度。除此之外，還可在細(xì)胞水平對胚胎進行早期選擇，提高選擇的準(zhǔn)確性，縮短育種時間。4.4器官移植主要是用于人的疾病治療。利用體細(xì)胞核移植技術(shù)在體外生產(chǎn)人的克隆胚胎，當(dāng)克隆胚胎發(fā)育至囊胚時，分離并體外培養(yǎng)人胚胎ICM,獲取ESCs。然后在體外定向誘導(dǎo)分化ESC，用以修復(fù)甚至替換喪失功能的組織和器官。胚胎干細(xì)胞在哺乳動物上的研究進展1994年Cherny等從29?35日齡的牛胎兒生殖嵴中分離PGCs,接種在SNL滋養(yǎng)層(轉(zhuǎn)mLIF基因和neor基因的STO細(xì)胞株)和同齡牛胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)層上，7d后發(fā)現(xiàn)大量EGCs集落產(chǎn)生。將用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的EGCs細(xì)胞注射到體外受精的牛早期囊胚，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的細(xì)胞同ICM結(jié)合，將嵌合體移植給受體，但未產(chǎn)生子代個體。同年，Stice等建立了牛的類ESCs細(xì)胞系°Cibeili等從體細(xì)胞核移植囊胚中獲得牛類ESCs細(xì)胞系，并利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到生殖系嵌合牛。賴良學(xué)將兔分割囊胚接種到PMEF為滋養(yǎng)層培養(yǎng)，獲得傳至7代的兔類ESCs，進行嵌合體實驗后得到1只皮毛嵌合的嵌合仔兔。Niemann等以PMEF作為滋養(yǎng)層培養(yǎng)去透明帶兔囊胚，建立了9個核型正常的兔類ESCs細(xì)胞系。SchoonjansL等將兔ESCs細(xì)胞注入囊胚獲得了包括生殖系在內(nèi)的嵌合體兔子。孫國杰等用山羊胎兒成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層培養(yǎng)山羊囊胚，分離出ESCs，最高傳至5代。楊繼建等分離培養(yǎng)山羊類ESCs最高傳至8代。錢永勝等分離到豬類ESCs細(xì)胞傳至2代。國內(nèi)關(guān)于豬的ESCs細(xì)胞分離與克隆的研究相對較少。錢永勝等分離到豬類ESCs細(xì)胞傳至2代。馮秀亮等將豬類ESCs細(xì)胞傳至5代，同時對所分離的細(xì)胞進行了初步檢測和鑒定。2009年中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所的科學(xué)家把豬的細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)變成了多能干細(xì)胞，首次使用有蹄類動物的體細(xì)胞實現(xiàn)了這一成果。存在的問題6.1關(guān)于ESC分化從理論上講，ESC具全能性,可獲得一種我們需要的細(xì)胞，但實際工作的進展卻很慢。細(xì)胞分化是多種細(xì)胞因子相互作用引起細(xì)胞一系列的生理生化反應(yīng)的過程，必須了解各種因子的具體作用和作用時間，才能得到產(chǎn)生某種特異類型的分化細(xì)胞，且抑制分化因子的劑量需進一步研究。ESC移植后細(xì)胞存活和畸胎瘤的問題小鼠ESCs注入成鼠皮下可形成畸胎瘤，目前對形成畸胎瘤所需ESCs的最少數(shù)量及最短時間還無定論。人ESCs也具有相似特性。為防止畸胎瘤，應(yīng)對ESCs進行細(xì)胞選擇，排除多余多能干細(xì)胞的影響。應(yīng)對ESCs進行細(xì)胞選擇，排除多余多能干細(xì)胞的影響。社會倫理問題由于胚胎干細(xì)胞的研究涉及生命的定義和來源，因此受到宗教界等相關(guān)人士倫理道德方面的爭議。然而，人類干細(xì)胞方面的研究進展及其與克隆技術(shù)結(jié)合在治療人類某些疾病上的應(yīng)用前景，促使政府放松了對人類胚胎干細(xì)胞研究的限制。參考文獻：BradleyA，EvansM.KaufmanM,etal.Formationofgerm-linechinerasfromembryo-derivedteratocarcinomacell[J].Nature,1984,309：255?256.BaharvandH,PiryaeiA,RohaniR，eta1．Uhrastructuralcomparisonofdevelopingmouseembryonicstemcellandinvivo-derivedcardiomyocytes[J．]CellBioInt，2006,30(10)：800-807．MadonnaR,eta1．Myocardinaenhancestelomeraseactivitiesinadiposetissuemesenchymalcellsandembryonicstemcellsundergoingcardiovascularmyogenicdifferentiation．StemCells，2008，26(1)：202?211．MinJ，ShangCZ，ChenYJ，eta1.Selectiveenrichmentofheap-tocytesfrommouseembryonicstemcellswithaculturesystemcontainingcholestaticserum[J．]ActaPharmacologicaSinica，2007，28(12)：193l?1937．NayerniaK.NoheJ，HansW，eta1．Invitrodifferentiatedembryonicstemcellsgiverisetomalegametesthatcangenerateoffspringmice．DevelopmentalCell，2006，11(1)：125?132．ChernyRA,StokesTM,MereiJ,etal.Strategiesfortheisolationandcharacterizationofbovineembryonicstemcells[J].ReprodfertDev,1994,6(5):569?575.SticeSL，KeeferCL.Multiplegenerationalb