血紅蛋白的凝膠過濾

血紅蛋白的凝膠過濾第1頁/共27頁凝膠層析技術(shù)及原理凝膠:是膠體溶液凝固而成的固體物質(zhì)，其內(nèi)部是立體的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu).交聯(lián)葡聚糖(sephadex)瓊脂糖凝膠(sepharose)聚丙烯酰胺凝膠(BIO-GelP)硅膠(SilicondioxideorSilicagel)第2頁/共27頁葡聚糖分子篩凝膠是一種不帶電的具有三維空間的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，每個(gè)顆粒的細(xì)微結(jié)構(gòu)及篩孔的直徑均勻一致，小分子可以進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔，而大分子則排阻于顆粒之外。第3頁/共27頁第4頁/共27頁凝膠層析(Gelchromatography):

凝膠過濾柱層析所用的基質(zhì)是具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、篩孔直徑一致，且呈珠狀顆粒的物質(zhì)。這種物質(zhì)可以完全或部分排阻某些大分子化合物于篩孔之外，而對(duì)某些小分子化合物則不能排阻，但可讓其在篩孔中自由擴(kuò)散、滲透。任何一種被分離的化合物被凝膠篩孔排阻的程度可用分配系數(shù)Kav（被分離化合物在內(nèi)水和外水體積中的比例關(guān)系）表示。Kav值的大小與凝膠床的總體積（Vt）、外水體積（Vo）及分離物本身的洗脫體積（Ve）有關(guān)，即：Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)第5頁/共27頁在限定的層析條件下，

Vt和

Vo都是恒定值，而

Ve值卻是隨著分離物分子量的變化而變化的。分離物分子量大，

Kav值??；反之，則

Kav值增大。因此，在同一凝膠柱上分離分子量不同的物質(zhì)時(shí)，由于流動(dòng)相的作用，這些分離物質(zhì)將發(fā)生排阻和擴(kuò)散效應(yīng)。若緩沖液連續(xù)地傾入柱中，柱中物質(zhì)的排阻和擴(kuò)散效應(yīng)也將連續(xù)地發(fā)生，其最終結(jié)果是分子量大的物質(zhì)先從柱中流出，分子量小的物質(zhì)則后從柱中流出。流出物用部分收集器分管等量或等時(shí)地收集起來，檢測后分段合并相同組分的各管流出物，即等于把分子量不同的物質(zhì)相互分離開第6頁/共27頁第7頁/共27頁常用的色譜分離方法一.按兩相所處的狀態(tài)分類氣相色譜法:氣固色譜法,氣液色譜法液相色譜法:液固色譜法,液液色譜法二.按固定相的幾何形式分類柱色譜法紙色譜法薄層色譜法

第8頁/共27頁凝膠過濾技術(shù)特點(diǎn)凝膠過濾的突出優(yōu)點(diǎn)是層析所用的凝膠屬于惰性載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件比較溫和，可在相當(dāng)廣的溫度范圍下進(jìn)行，不需要有機(jī)溶劑，并且對(duì)分離成分理化性質(zhì)的保持有獨(dú)到之處。對(duì)于高分子物質(zhì)有很好的分離效果。第9頁/共27頁凝膠層析的應(yīng)用⑴脫鹽：高分子（如蛋白質(zhì)、核酸、多糖等）溶液中的低分子量雜質(zhì)，可以用凝膠層析法除去，這一操作稱為脫鹽。⑵用于分離提純：凝膠層析法已廣泛用于酶、蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、激素、生物堿等物質(zhì)的分離提純。⑶測定高分子物質(zhì)的分子量⑷高分子溶液的濃縮第10頁/共27頁凝膠層析應(yīng)用1.生物大分子的純化凝膠過濾是依據(jù)分子量的不同來進(jìn)行分離的，由于它的這一分離特性，以及它具有簡單、方便、不改變樣品生物學(xué)活性等優(yōu)點(diǎn)，使得凝膠過濾成為分離純化生物大分子的一種重要手段，尤其是對(duì)于一些大小不同，但理化性質(zhì)相似的分子，用其它方法較難分開，而凝膠過濾無疑是一種合適的方法。

第11頁/共27頁2.分子量測定在一定的范圍內(nèi)，各個(gè)組分的Kav以及Ve與其分子量的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系。Kav＝－blgMW＋cVe＝－b’lgMW＋c’由此通過對(duì)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行洗脫，作出Ve或Kav對(duì)分子量對(duì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后在相同的條件下測定未知物的Ve或Kav，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求出其分子量。第12頁/共27頁3.脫鹽及去除小分子雜質(zhì)利用凝膠過濾進(jìn)行脫鹽及去除小分子雜質(zhì)是一種簡便、有效、快速的方法，它比一般用透析的方法脫鹽要快得多，而且一般不會(huì)造成樣品較大的稀釋，生物分子不易變性。一般常用的是SephadexG-25，另外還有Bio-GelP-6等排阻極限較小的凝膠類型。目前已有多種脫鹽柱成品出售，使用方便，但價(jià)格較貴。

第13頁/共27頁4.溶液的濃縮利用凝膠顆粒的吸水性可以對(duì)大分子樣品溶液進(jìn)行濃縮。例如將干燥的Sephadex（粗顆粒）加入溶液中，Sephadex可以吸收大量的水，溶液中的小分子物質(zhì)也會(huì)滲透進(jìn)入凝膠孔穴內(nèi)部，而大分子物質(zhì)則被排阻在外。通過離心或過濾去除凝膠顆粒，即可得到濃縮的樣品溶液。這種濃縮方法基本不改變?nèi)芤旱碾x子強(qiáng)度和pH值。第14頁/共27頁5.蛋白質(zhì)的復(fù)性為了減少高濃度下的聚集反應(yīng),凝膠過濾層析技術(shù)也可以用來進(jìn)行蛋白的體外復(fù)性。層析介質(zhì)的隔離作用,降低了蛋白之間相互作用產(chǎn)生的聚集,使復(fù)性濃度、復(fù)性率都得到很大的提高。同時(shí),蛋白經(jīng)過凝膠過濾層析本身也可得到一定的純化。第15頁/共27頁為了提高蛋白質(zhì)復(fù)性效率，發(fā)展了一種梯度凝膠過濾層析復(fù)性方法。在色譜柱中預(yù)先設(shè)置變性劑濃度的梯度，當(dāng)復(fù)性的蛋白質(zhì)進(jìn)入到柱子中后，由于蛋白質(zhì)的表觀分子量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于變性劑的，從而蛋白質(zhì)經(jīng)過了一個(gè)變性劑濃度逐步降低的環(huán)境，蛋白質(zhì)逐步地折疊復(fù)性，從而有效地降低了聚集體的形成，并能把聚集體和折疊的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。第16頁/共27頁影響分離效果的因素1.基質(zhì)的顆粒大小、均勻度2.篩孔直徑和床體積的大小3.洗脫液的流速4.樣品的種類等，5.緩沖液的pH6.而最直接的影響是Kav值的差異性，Kav值差異性大，分離效果好；Kav值差異性小，則分離效果很差，或根本不能分開。第17頁/共27頁影響凝膠過濾的因素層析柱的選擇一般來講，主要是層析柱的長度對(duì)分辨率影響較大，長的層析柱分辨率要比短的高；但層析柱長度不能過長，否則會(huì)引起柱子不均一、流速過慢等實(shí)驗(yàn)上的一些困難。一般柱長度不超過100cm加樣量加樣過多，會(huì)造成洗脫峰的重疊，影響分離效果；加樣過少，提純后各組分量少、濃度較低，實(shí)驗(yàn)效率低。凝膠柱的鑒定凝膠柱填裝后用肉眼觀察應(yīng)均勻、無紋路、無氣泡洗脫速度一般來講，洗脫速度慢一些樣品可以與凝膠基質(zhì)充分平衡，分離效果好。但洗脫速度過慢會(huì)造成樣品擴(kuò)散加劇、區(qū)帶變寬，反而會(huì)降低分辨率，而且實(shí)驗(yàn)時(shí)間會(huì)大大延長第18頁/共27頁本實(shí)驗(yàn)的原理本實(shí)驗(yàn)利用凝膠過濾的特點(diǎn)，先向?qū)游鲋屑尤隖eSO4溶液，形成一個(gè)還原帶，然后加入血紅蛋白樣品（血紅蛋白與高鐵氰化鉀的混合液）。由于血紅蛋白分子量大，在凝膠床中流速快，當(dāng)其流經(jīng)還原帶時(shí)，褐色的高鐵血紅蛋白立即被還原為紫紅色的亞鐵血紅蛋白。亞鐵血紅蛋白繼續(xù)下移，與緩沖液溶解的O2結(jié)合，形成鮮紅色的氧合血紅蛋白。鐵氰化鉀是小分子量化合物，呈黃色帶遠(yuǎn)遠(yuǎn)地落在后邊。這樣，就可以形象直觀地觀察到凝膠過濾的分離效果。第19頁/共27頁實(shí)驗(yàn)主要步驟凝膠溶脹裝柱制備血紅蛋白樣品平衡（20min）上樣和緩沖液洗脫形成層析柱還原層第20頁/共27頁裝柱注意事項(xiàng)1.裝柱后要檢查柱床是否均勻，若有氣泡或分層的界面時(shí)，需要重新裝柱。2.流速不可太快，否則分子小的物質(zhì)來不及擴(kuò)散，隨分子大的物質(zhì)一起被洗脫下來，達(dá)不到分離目的。3.進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，注意與目標(biāo)物分子量相似的盡量少。4.凝膠柱填裝后用肉眼觀察應(yīng)均勻、無紋路、無氣泡。第21頁/共27頁操作步驟11.裝柱:檢查上下柱帽是否通暢,將接線短的柱帽接在層析柱的下端.加入1/8柱體積的去離子水或磷酸鹽緩沖液,攪拌小燒杯里的凝膠,并連續(xù)的裝入層析柱中,使沉積后的凝膠高度不低于12cm,接上上端的柱帽,將其連線插入三角瓶里磷酸鹽緩沖液中,平衡20分鐘.第22頁/共27頁操作步驟22.上樣前的準(zhǔn)備調(diào)節(jié)恒流泵的流速為6—10滴/分鐘,并將其進(jìn)水口與層析柱的下端接線相接.撤去柱上端的柱帽,放入與柱內(nèi)徑大小一致的濾紙片一塊,檢查膠面是否平整,層析柱是否均勻.然后將膠面上的緩沖液用排氣鍵放至與膠面相齊,關(guān)上恒流泵.切忌干膠!第23頁/共27頁步驟3A.上樣FeSO40.5ml于濾紙面上。開啟恒流泵至液面與膠面相齊。關(guān)泵。B.上1ml磷酸緩沖液,開啟泵,至液面與膠面相齊。關(guān)泵。C.上0.5ml血紅蛋白樣，開泵，至液面與膠面相齊，關(guān)泵。D.同B操作。E.上5ml的磷酸緩沖液。接上上端柱帽與磷酸緩沖液，連續(xù)洗脫，觀察現(xiàn)象，并用燒杯分別收集血紅蛋白樣品與鐵氰化鉀。第24頁/