工業(yè)微生物代謝控制育種

工業(yè)微生物代謝控制育種第1頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一工業(yè)微生物代謝控制育種第2頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一代謝控制發(fā)酵大體過程如下：以生物化學(xué)和遺傳學(xué)為基礎(chǔ)，研究代謝產(chǎn)物的生物合成途徑和代謝調(diào)節(jié)的機(jī)制——選擇巧妙的技術(shù)路線，通過遺傳育種技術(shù)獲得解除或繞過了微生物正常代謝途徑的突變株——從而人為地使有用產(chǎn)物選擇性地大量合成和累積。代謝控制發(fā)酵的關(guān)鍵：取決于微生物代謝調(diào)控機(jī)制是否能夠被解除，能否打破微生物正常的代謝調(diào)節(jié)，人為地控制微生物的代謝。實(shí)現(xiàn)代謝控制目標(biāo)的手段：代謝控制育種和發(fā)酵過程的代謝控制培養(yǎng)，而代謝控制育種則為主要支柱技術(shù)。第3頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一

微生物菌體積累的發(fā)酵產(chǎn)物主要有

酶

代謝產(chǎn)物（酒精、甘油、乳酸、丙酮、丁醇、有機(jī)酸、氨基酸、核苷酸、蛋白質(zhì)、抗生素、維生素、脂肪、多糖等）這些產(chǎn)物中有些是某種微生物在一定的環(huán)境條件下生成的，如酒精、乳酸等；也有許多產(chǎn)物是生理正常的微生物不能過量積累的，必須是具有特異生理特征的微生物才能積累。人為地改變微生物的代謝調(diào)控機(jī)制，使有用的中間代謝產(chǎn)物過量積累，這種發(fā)酵稱為代謝控制發(fā)酵。第4頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一考察工業(yè)微生物發(fā)展史，可以看到經(jīng)典的誘變育種具有一定盲目性，而代謝控制育種將微生物遺傳學(xué)的理論與育種實(shí)踐密切結(jié)合，先研究目的產(chǎn)物的生物合成途徑、遺傳控制及代謝調(diào)節(jié)機(jī)制，然后進(jìn)行定向控制育種。代謝控制發(fā)酵的出現(xiàn)與發(fā)展，與以下幾方面是密不可分的：生物化學(xué)的發(fā)展，確立了代謝圖譜，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了代謝過程中的各種調(diào)節(jié)機(jī)制；分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的發(fā)展，可以人為地在DNA分子水平上改變微生物的代謝，多方面利用微生物的代謝活性；合理控制環(huán)境，采用過程控制方法，對發(fā)酵過程進(jìn)行最優(yōu)化控制，使目的產(chǎn)物大量積累。第5頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一第一節(jié)概論一、初級代謝產(chǎn)物和初級代謝初級代謝產(chǎn)物——微生物產(chǎn)生的對自身生長和繁殖必須的物質(zhì)初級代謝——產(chǎn)生這些物質(zhì)的代謝系稱為初級代謝。初級代謝體系分解代謝體系：包括糖、脂、蛋白質(zhì)等物質(zhì)的降解，獲取能量素材性生物合成體系：合成某些小分子材料結(jié)構(gòu)性生物合成體系：用小分子合成產(chǎn)物裝配大分子。第6頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一二、次級代謝產(chǎn)物和次級代謝根據(jù)Demain的定義：“次級代謝產(chǎn)物是對產(chǎn)生它們的生物體本身不需要的一種產(chǎn)物”。這些物質(zhì)有抗生素、生長刺激素、生物堿、色素、毒素以及甾體等。通常把以初級代謝產(chǎn)物為前體，合成次生產(chǎn)物的代謝體系稱為次級代謝。第7頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一三、初級代謝與次級代謝的關(guān)系1.菌體代謝方面抗生素是微生物的次級代謝產(chǎn)物中的一大類。微生物的初級代謝與次級代謝既有區(qū)別，又有聯(lián)系。許多抗生素的基本結(jié)構(gòu)是由少數(shù)幾種初級代謝產(chǎn)物構(gòu)成的，所以次級代謝產(chǎn)物是以初級代謝產(chǎn)物為母體衍生出來的，次級代謝途徑并不是獨(dú)立的，而是與初級代謝途徑有密切關(guān)系的。糖代謝中間體，既可用來合成初級代謝產(chǎn)物，又可用來合成次級代謝產(chǎn)物，這種中間體叫做分支(叉)中間體。第8頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一分叉中間體初級代謝產(chǎn)物次級代謝產(chǎn)物α-氨基己二糖丙二酰CoA乙酰CoA賴氨酸脂肪酸青霉素、頭孢菌素利福霉素族、四環(huán)素族大環(huán)內(nèi)酯族、多烯族抗生素、灰黃霉素、橘霉素、環(huán)己酰亞胺、棒曲霉素莽草酸對氨基苯丙氨酸苯丙氨酸酪氨酸、對氨基苯甲酸、色氨酸氯霉素綠膿菌素新生霉素第9頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一次級代謝產(chǎn)物的合成，至少有一部分取決于與初級代謝產(chǎn)物無關(guān)的遺傳物質(zhì)，并和由這類遺傳物質(zhì)形成的酶所催化的代謝途徑有關(guān)，它們多數(shù)是特異菌株。從代謝途徑來看，次級代謝產(chǎn)物是以初級代謝產(chǎn)物為前體衍生出來的，見下圖。第10頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一脂肪酸（nC3、nC2）葡萄糖（C6）丙糖—P丙酮酸（C3）（C3）乙酰CoA（C2）檸檬酸（C6）草酰乙酸α-酮戊二酸（C5）CO2CO2谷氨酸（C5N）次級代謝產(chǎn)物戊糖（C5）氨基糖苷類抗生素糖苷類多糖核苷核苷類抗生素絲氨酸（C3N）甘氨酸（C2N）半胱氨酸次級代謝物丁糖（C4）莽草酸（C7）芳香族氨基酸次級代謝產(chǎn)物芳香族次級代謝產(chǎn)物纈氨酸（C5N）生物甲基化次級代謝產(chǎn)物C1丙氨酸（C3N）甲羥戊酸（C3）焦磷酸異戊酯（C3）CO2萜甾體甾體（6C5）丙二酸（C3）CO2CO2CO2聚酮體次級代謝產(chǎn)物天冬氨酸（C4N）（nC2）葡萄糖分解代謝的主要途徑初級代謝的合成過程圖—從碳代謝流看初級代謝與次級代謝第11頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一由初級代謝產(chǎn)物衍生的次級代謝產(chǎn)物的生物合成途徑有七種。在這些次級代謝途徑中所涉及的酶有的是初級代謝酶，有的是次級代謝所特有的酶。初級代謝與次級代謝都受菌體的代謝調(diào)節(jié)，在調(diào)節(jié)控制上是相互影響的，當(dāng)與抗生素合成有關(guān)的初級代謝途徑受到控制時(shí)，抗生素的生物合成必然受阻。葡萄糖碳架參入途徑莽草酸途徑與核苷有關(guān)的途徑聚酮糖和聚丙酸途徑由氨基酸衍生的途徑甲羥戊酸途徑其他復(fù)合途徑綜上所述，在代謝途徑、酶系關(guān)系以及調(diào)控上，次級代謝與初級代謝都有著密切關(guān)系。因此，在研究次級代謝時(shí)，必須與初級代謝聯(lián)系起來考慮。第12頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一2.遺傳代謝方面初級代謝與次級代謝同樣都受到核內(nèi)DNA的調(diào)節(jié)控制,而次級代謝產(chǎn)物還受到與初級代謝產(chǎn)物合成無關(guān)的遺傳物質(zhì)的控制,即受核內(nèi)遺傳物質(zhì)(染色體遺傳物質(zhì))和核外遺傳物質(zhì)(質(zhì)粒)的控制.有一部分代謝產(chǎn)物的形成，取決于由質(zhì)粒信息產(chǎn)生的酶所控制的代謝途徑，這類物質(zhì)稱為質(zhì)粒產(chǎn)物。由于這類物質(zhì)的形成直接或間接受質(zhì)粒遺傳物質(zhì)的控制，因而產(chǎn)生了質(zhì)粒遺傳的觀點(diǎn)。

也有只由染色體DNA控制的抗生素產(chǎn)物。第13頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一次級代謝產(chǎn)物（質(zhì)粒產(chǎn)物）初級代謝產(chǎn)物＋（質(zhì)粒產(chǎn)物）底物（營養(yǎng)物）中間體（質(zhì)粒產(chǎn)物）底物（異常營養(yǎng)物）酶、蛋白質(zhì)酶、蛋白質(zhì)、次級代謝產(chǎn)物（質(zhì)粒產(chǎn)物）核糖核蛋白體系統(tǒng)mRNAmRNA染色體質(zhì)粒次級代謝產(chǎn)物生物合成與初級代謝產(chǎn)物的關(guān)系第14頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一第二節(jié)初級代謝的調(diào)節(jié)控制一、酶合成的調(diào)節(jié)通過調(diào)節(jié)酶合成量進(jìn)而調(diào)節(jié)代謝速率，是在基因水平上（原核生物中轉(zhuǎn)錄水平）的代謝調(diào)節(jié)

特點(diǎn)：間接緩慢、節(jié)約能量和原料酶合成調(diào)節(jié)誘導(dǎo)酶合成阻遏酶合成酶合成調(diào)節(jié)的類型誘導(dǎo)：當(dāng)環(huán)境中存在誘導(dǎo)物（底物及類似物、底物前體）時(shí)，促進(jìn)酶合成，誘導(dǎo)方式有同時(shí)誘導(dǎo)、順序誘導(dǎo)阻遏：過量代謝產(chǎn)物阻礙代謝途徑中包括關(guān)鍵酶在內(nèi)的一系列酶的合成，從而控制代謝，減少末端產(chǎn)物的合成第15頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一酶合成調(diào)節(jié)的機(jī)制乳糖操縱子的調(diào)節(jié)第16頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一色氨酸操縱子的反饋?zhàn)瓒舻?7頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一DNA（促進(jìn)）分解代謝物阻遏的乳糖操縱子模型轉(zhuǎn)乙?；刚{(diào)節(jié)基因CAP-cAMPRNApolLacZOLacYLacA阻遏蛋白啟動基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因RNA聚合酶乳糖阻遏蛋白×mRNA半乳糖苷酶透過酶××××××葡萄糖（阻斷）XATP×cAMP×CAPAMP葡萄糖分解代謝物X阻止CAP-cAMP的形成，從而阻止了RNA聚合酶與啟動基因上結(jié)合位點(diǎn)(RNApol.)的結(jié)合，即使有誘導(dǎo)物乳糖存在，與乳糖代謝有關(guān)的酶仍無法合成第18頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一二、酶活性的調(diào)節(jié)通過改變現(xiàn)成的酶分子活性來調(diào)節(jié)新陳代謝的速率的方式。是酶分子水平上的調(diào)節(jié)，屬于精細(xì)的調(diào)節(jié)。（一）調(diào)節(jié)方式：包括兩個(gè)方面：1、酶活性的激活：在代謝途徑中后面的反應(yīng)可被較前面的反應(yīng)產(chǎn)物所促進(jìn)的現(xiàn)象；常見于分解代謝途徑。如：粗糙脈孢霉的異檸檬酸脫氫酶的活性受檸檬酸促進(jìn)2、酶活性的抑制：包括：競爭性抑制和反饋抑制。概念：反饋：指反應(yīng)鏈中某些中間代謝產(chǎn)物或終產(chǎn)物對該途徑關(guān)鍵酶活性的影響。凡使反應(yīng)速度加快的稱正反饋；凡使反應(yīng)速度減慢的稱負(fù)反饋（反饋抑制）；反饋抑制——主要表現(xiàn)在某代謝途徑的末端產(chǎn)物過量時(shí)可反過來直接抑制該途徑中第一個(gè)酶的活性。主要表現(xiàn)在氨基酸、核苷酸合成途徑中。特點(diǎn)：作用直接、效果快速、末端產(chǎn)物濃度降低時(shí)又可解除第19頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一1.直線式代謝途徑中的反饋抑制： 蘇氨酸脫氨酶蘇氨酸 α-酮丁酸 異亮氨酸 反饋抑制 其它實(shí)例：谷氨酸棒桿菌的精氨酸合成2.分支代謝途徑中的反饋抑制：在分支代謝途徑中，反饋抑制的情況較為復(fù)雜，為了避免在一個(gè)分支上的產(chǎn)物過多時(shí)不致同時(shí)影響另一分支上產(chǎn)物的供應(yīng)，微生物發(fā)展出多種調(diào)節(jié)方式。主要有：同功酶的調(diào)節(jié)，順序反饋，協(xié)同反饋，積累反饋調(diào)節(jié)等。（二）反饋抑制的類型第20頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一（1）同功酶調(diào)節(jié)——isoenzyme定義：催化相同的生化反應(yīng)，而酶分子結(jié)構(gòu)有差別的一組酶。意義：在一個(gè)分支代謝途徑中，如果在分支點(diǎn)以前的一個(gè)較早的反應(yīng)是由幾個(gè)同功酶催化時(shí)，則分支代謝的幾個(gè)最終產(chǎn)物往往分別對這幾個(gè)同功酶發(fā)生抑制作用?！骋划a(chǎn)物過量僅抑制相應(yīng)酶活性，對其他產(chǎn)物沒影響。舉例：大腸桿菌的天冬氨酸族氨基酸合成的調(diào)節(jié)第21頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一（2）協(xié)同反饋抑制——concertedfeedbackinhibition定義：分支代謝途徑中幾個(gè)末端產(chǎn)物同時(shí)過量時(shí)才能抑制共同途徑中的第一個(gè)酶的一種反饋調(diào)節(jié)方式。舉例：谷氨酸棒桿菌（Corynebacteriumglutamicum） 多粘芽孢桿菌（Bacilluspolymyxa） 天冬氨酸族氨基酸合成中天冬氨酸激酶受賴氨酸和蘇氨酸的協(xié)同反饋抑制和阻遏。第22頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一（3）合作反饋抑制——cooperativefeedbackinhibition定義：兩種末端產(chǎn)物同時(shí)存在時(shí)，共同的反饋抑制作用大于二者單獨(dú)作用之和。舉例：在嘌呤核苷酸合成中，磷酸核糖焦磷酸酶受AMP和GMP（和IMP）的合作反饋抑制，二者共同存在時(shí)，可以完全抑制該酶的活性。而二者單獨(dú)過量時(shí)，分別抑制其活性的70%和10%。第23頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一（4）積累反饋抑制——cumulativefeedbackinhibition定義：每一分支途徑末端產(chǎn)物按一定百分比單獨(dú)抑制共同途徑中前面的酶，所以當(dāng)幾種末端產(chǎn)物共同存在時(shí)它們的抑制作用是積累的，各末端產(chǎn)物之間既無協(xié)同效應(yīng)，亦無拮抗作用。第24頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一（5）順序反饋抑制——sequentialfeedbackinhibition一種終產(chǎn)物的積累,導(dǎo)致前一中間產(chǎn)物的積累，通過后者反饋抑制合成途徑關(guān)鍵酶的活性，使合成終止。舉例：枯草芽孢桿菌芳香族氨基酸合成的調(diào)節(jié)第25頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一（三）反饋抑制的機(jī)制盡管反饋抑制的類型很多，但其主要的作用方式在于末端產(chǎn)物對反應(yīng)途徑中調(diào)節(jié)酶的抑制。受反饋抑制的調(diào)節(jié)酶一般都是變構(gòu)酶，酶活力調(diào)控的實(shí)質(zhì)就是變構(gòu)酶的變構(gòu)調(diào)節(jié)。變構(gòu)酶的酶蛋白分子一般都是由兩個(gè)以上亞基組成的多聚體，具有四級結(jié)構(gòu)，這是能夠產(chǎn)生變構(gòu)作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

變構(gòu)酶分子具有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，一個(gè)是與底物結(jié)合的催化中心（活性中心），另一個(gè)可與調(diào)節(jié)因子（又稱效應(yīng)物）相結(jié)合的調(diào)節(jié)中心（變構(gòu)中心）。第26頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一+激活劑底物+抑制劑無活性形式活性形式活性形式無活性形式（不能結(jié)合底物）底物圖—變構(gòu)酶的激活和變構(gòu)酶的抑制變構(gòu)效應(yīng)：當(dāng)效應(yīng)物與調(diào)節(jié)中心結(jié)合后，可引起酶蛋白分子發(fā)生構(gòu)象變化，從而引起酶的活性中心對底物的親和力和催化能力的改變，激活或阻礙了酶和它的底物的結(jié)合，促進(jìn)或抑制了酶活力，使整個(gè)代謝途徑的快慢受到調(diào)節(jié)。第27頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一28

突變前突變后反饋抑制與抗反饋抑制突變效應(yīng)物底物第28頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一三、反饋?zhàn)瓒襞c反饋抑制的比較類型項(xiàng)目反饋?zhàn)瓒舴答佉种普{(diào)控對象調(diào)控開關(guān)調(diào)控的水平調(diào)控方式調(diào)控動作形成的控制調(diào)控反應(yīng)速度酶的合成終產(chǎn)物濃度DNA—mRNA—酶蛋白（轉(zhuǎn)錄水平）終產(chǎn)物與阻遏蛋白親和力阻遏蛋白與操縱基因結(jié)合,不能合成mRNA開、關(guān)控制遲緩、粗的控制酶的活性終產(chǎn)物濃度酶蛋白的構(gòu)象變化終產(chǎn)物與變構(gòu)部位親和力通過變構(gòu)效應(yīng),酶的構(gòu)象變化控制酶活性的大小迅速、精確的控制第29頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一第三節(jié)次級代謝的調(diào)節(jié)控制1.細(xì)胞生長期到抗生素產(chǎn)生期的過渡在細(xì)胞生長期，負(fù)責(zé)次級代謝產(chǎn)物合成的酶處于抑制或阻遏狀態(tài)，進(jìn)入穩(wěn)定期，這些酶便開始被激活或被合成（解除阻遏作用的原因是多方面的）。(1)一種誘導(dǎo)因子在生長期末積累或從外源加入以解除生產(chǎn)期的阻遏作用。(2)初級代謝的終產(chǎn)物對次級代謝途徑的反饋?zhàn)瓒糇饔?，?dāng)終產(chǎn)物耗盡后，受阻遏的基因就被解除阻遏。(3)在一種易被利用的糖源中生長，其分解代謝物對抗生素合成有阻遏作用，當(dāng)這些阻遏劑被利用后，便解除了阻遏作用。第30頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一2.酶的誘導(dǎo)作用在細(xì)胞營養(yǎng)期一般不出現(xiàn)催化次級代謝的酶，在穩(wěn)定期發(fā)生了次級代謝酶的誘導(dǎo)或解阻遏而生成。如色氨酸（或其類似物）刺激麥角菌誘導(dǎo)合成麥角靈生物堿；蛋氨酸刺激頂頭孢霉生物合成頭孢菌素C。(4)抗生素合成途徑受高能化合物的阻遏，當(dāng)ATP形成減少后，阻遏作用隨即解除。(5)在生長期，RNA聚合酶只能啟動生長期基因的轉(zhuǎn)錄作用，它不能附著在生產(chǎn)期操縱的促進(jìn)子的位置上，結(jié)果次級代謝途徑的酶合成受阻遏；當(dāng)生長停止后，酶的結(jié)構(gòu)改變，允許RNA聚合酶啟動生產(chǎn)期基因的轉(zhuǎn)錄作用，負(fù)責(zé)抗生素合成的酶開始生成。第31頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一3.分解代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)控制葡萄糖效應(yīng)（分解產(chǎn)物阻遏）：在含有葡萄糖和第二種碳源的培養(yǎng)基中，葡萄糖首先被利用，抑制抗生素的生物合成，只有在葡萄糖耗盡時(shí)，利用第二種碳源（如半乳糖）所需的酶開始合成，并解除對抗生素生物合成的抑制。此外，甘露糖、甘油也呈現(xiàn)明顯的阻遏作用。第32頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一4.磷酸鹽的調(diào)節(jié)高濃度磷酸鹽對許多抗生素合成具有阻遏和抑制作用。高濃度磷酸鹽只長菌體而不合成抗生素；但磷酸鹽太少時(shí)，菌體生長不夠，也不利于合成抗生素。因此，發(fā)酵工藝上要嚴(yán)格控制“亞適量”的磷酸鹽濃度。5.NH4＋的抑制作用在抗生素發(fā)酵中，供給高濃度的容易被利用的無機(jī)氨態(tài)氮或其他迅速被利用的氮源，由于它們促進(jìn)生長，而強(qiáng)烈抑制抗生素的合成。第33頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一6.初級代謝調(diào)節(jié)對次級代謝的作用許多次級代謝產(chǎn)物來自初級代謝的關(guān)鍵中間體，因此次級代謝也就受初級代謝調(diào)節(jié)的影響。7.次級代謝的反饋抑制（或阻遏）許多抗生素能阻止自身的合成。8.次級代謝的能荷調(diào)節(jié)能荷調(diào)節(jié)機(jī)制對次級代謝途徑的控制也是有效的。第34頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一第四節(jié)代謝調(diào)節(jié)控制育種從工業(yè)微生物育種史來看，誘變育種曾取得了巨大的成就，使微生物有效產(chǎn)物成百倍、乃致成千倍的增加。但是誘變育種工作量繁重，盲目性大。近年來由于應(yīng)用生物化學(xué)和遺傳學(xué)原理，深入研究了生物合成代謝途徑以及代謝調(diào)節(jié)控制的基礎(chǔ)理論：（1）可進(jìn)行外因控制，通過培養(yǎng)條件來解除反饋調(diào)節(jié)而使生物合成的途徑朝著人們所希望的方向進(jìn)行，即實(shí)現(xiàn)代謝控制發(fā)酵；第35頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一（2）還可進(jìn)行內(nèi)因改變，通過定向選育某種特定的突變株，以達(dá)到大量積累有益產(chǎn)物的目的，即所謂代謝控制育種。內(nèi)因是變化的根據(jù)，所以改變微生物的遺傳型往往是控制代謝的更為有效的途徑。代謝控制育種可以大大減少傳統(tǒng)育種的盲目性，提高了效率。代謝控制育種很快在初級代謝產(chǎn)物的育種中得到廣泛的應(yīng)用，成就也十分顯赫，幾乎全部氨基酸和多種核苷酸生產(chǎn)菌株都被打上了抗性或缺陷型遺傳標(biāo)記。第36頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一代謝調(diào)節(jié)控制育種通過特定突變型的選育，達(dá)到改變代謝通路、降低支路代謝終產(chǎn)物的產(chǎn)生或切斷支路代謝途徑及提高細(xì)胞膜的透性，使代謝流向目的產(chǎn)物積累方向進(jìn)行。下表列出微生物代謝控制育種措施第37頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一調(diào)節(jié)體系育種措施誘導(dǎo)分解阻遏分解抑制1.組成型突變株的選育2.抗分解調(diào)節(jié)突變株的選育解除碳源分解調(diào)節(jié)突變株的選育解除氮源分解調(diào)節(jié)突變株的選育解除磷酸鹽調(diào)節(jié)突變株的選育反饋?zhàn)瓒舴答佉种?.營養(yǎng)缺陷型突變株的選育4.滲漏型缺陷型突變株的選育5.回復(fù)突變株的選育6.耐自身代謝產(chǎn)物的突變株的選育7.抗終產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類似物的突變株的選育8.耐前體物突變株的選育9.條件突變株的選育細(xì)胞膜滲透性10.營養(yǎng)缺陷型突變株的選育生物素缺陷型油酸缺陷型甘油缺陷型11.溫敏突變株第38頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一一、組成型突變株的選育組成型突變株：在沒有誘導(dǎo)底物存在時(shí)也能產(chǎn)生大量誘導(dǎo)酶的突變株。篩選原理：通過誘變處理，使調(diào)節(jié)基因發(fā)生突變，不產(chǎn)生有活性的阻遏蛋白，或者操縱基因發(fā)生突變不再能與阻遏物相結(jié)合，從而使誘導(dǎo)型酶變?yōu)榻M成型酶。第39頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一40

篩選方法及實(shí)例：

創(chuàng)造一種有利于組成型菌株生長而不利于誘導(dǎo)型菌株生長的培養(yǎng)條件，造成對組成型突變株的選擇優(yōu)勢；選擇適當(dāng)?shù)蔫b別培養(yǎng)基，直接在平板上識別兩類菌落，從而把組成型突變株選擇出來。第40頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一41

限量誘導(dǎo)物恒化培養(yǎng)法控制低于誘導(dǎo)濃度的誘導(dǎo)物作碳源進(jìn)行恒化連續(xù)培養(yǎng)。誘導(dǎo)型菌株生長極弱，而變異株由于能產(chǎn)分解底物的酶，則能分解底物而得以生長。通過連續(xù)不斷加入新鮮基質(zhì)，野生型就會被“洗出”，組成型突變株就被不斷“濃縮”，最后達(dá)到能分離的濃度。第41頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一42

循環(huán)培養(yǎng)法不含誘導(dǎo)物培養(yǎng)基?含誘導(dǎo)物培養(yǎng)基(普通碳源或氮源）（誘導(dǎo)物作唯一碳源或氮源）

兩菌都能生長，但組成型突變株已能合成特定的酶，親株不能變異株調(diào)整期短，親株調(diào)整期長，短時(shí)間培養(yǎng)后，變異株所占比例增大

反復(fù)循環(huán)培養(yǎng)幾次后，變異株所占比例逐漸提高，然后進(jìn)行分離第42頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一鑒別性培養(yǎng)基的利用

將誘變孢子懸液涂布在甘油作唯一碳源的平板上，培養(yǎng)后長出菌落。然后在菌落上噴上O-硝基苯酚-β-D-半乳糖苷（ONPG），組成型成黃色，誘導(dǎo)型呈白色。原因：組成型突變株在沒有誘導(dǎo)底物存在時(shí)仍能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，將無色試劑水解，放出O-硝基苯酚，因而很容易挑選。第43頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一44

篩選經(jīng)誘變劑處理后的菌體移接到含有誘導(dǎo)能力低，但能作為良好碳源的誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，突變體能良好生長，野生型不能生長。

例如：利用苯-β-半乳糖（PG）篩選β-半乳糖苷酶組成型突變株。

第44頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一二、營養(yǎng)缺陷型在代謝調(diào)節(jié)育種中的應(yīng)用（一）在初級代謝調(diào)節(jié)育種中的應(yīng)用1.在直線式生物合成途徑中第45頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一（利用營養(yǎng)缺陷型突變株進(jìn)行氨基酸發(fā)酵必須限制所要求的氨基酸量，這樣就將反饋?zhàn)饔梦餄舛瓤刂圃诜答仚C(jī)制的濃度之下）谷氨酸N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸N-乙酰谷氨酸半縮醛N-乙酰鳥氨酸鳥氨酸瓜氨酸精氨酸N-乙酰谷氨酸-------------------------------------------------反饋抑制谷氨酸棒狀桿菌（瓜氨酸缺陷型）的鳥氨酸發(fā)酵代謝控制機(jī)制-----------------第46頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一2.在分支式生物合成途徑中-------------------------------協(xié)同反饋抑制天冬氨酸天冬氨酰磷酸天冬氨酸半縮酸醛高絲氨酸蘇氨酸賴氨酸天冬氨酸激酶---------------------------------------------------------------------------------------------------------------谷氨酸棒狀桿菌（高絲氨酸缺陷型）的L-賴氨酸發(fā)酵代謝控制機(jī)制第47頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一分支途徑——②肌苷酸發(fā)酵

（IMP合成途徑的代謝調(diào)控）調(diào)控理論的實(shí)踐應(yīng)用第48頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一（二）在次級代謝調(diào)節(jié)育種中的應(yīng)用（自學(xué)）三、滲漏缺陷型在代謝調(diào)節(jié)育種中的應(yīng)用。滲漏缺陷型是一種特殊的營養(yǎng)缺陷型，是遺傳性代謝障礙不完全的突變型。其特點(diǎn)是酶活力下降而不完全喪失，并能在基本培養(yǎng)基上少量生長。獲得滲漏型的方法是把大量營養(yǎng)缺陷型菌株接種在基本培養(yǎng)基平板上，挑選生長特別慢而菌落小的即可?？梢岳脻B漏缺陷型既能少量地合成代謝終產(chǎn)物，又不造成反饋抑制的現(xiàn)象。篩選抗反饋調(diào)節(jié)突變株，其原理類似于營養(yǎng)缺陷型，只是不必添加限量的缺陷營養(yǎng)屋。第49頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一四、抗反饋調(diào)節(jié)突變株的選育(一)反饋調(diào)節(jié)和抗反饋調(diào)節(jié)突變1.反饋調(diào)節(jié)是指當(dāng)合成代謝途徑的終產(chǎn)物或分支代謝途徑的終產(chǎn)物過量積累時(shí)，抑制合成代謝途徑的關(guān)鍵酶（往往是代謝途徑或分支代謝途徑第一步的酶）的活力或相關(guān)酶的合成。反饋調(diào)節(jié)分為反饋抑制和反饋?zhàn)瓒簟?/p>

第50頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一51

反饋抑制是指合成代謝途徑終產(chǎn)物過量積累時(shí)對該途徑前端某些關(guān)鍵酶酶活性的抑制作用。反饋?zhàn)瓒羰侵肝⑸锖铣纱x中高濃度終產(chǎn)物對該途徑上酶合成的抑制作用。反饋抑制直接以產(chǎn)物濃度控制關(guān)鍵酶的活性，從而控制整個(gè)代謝途徑，具有快速、有效、經(jīng)濟(jì)和直接的特點(diǎn)。反饋?zhàn)瓒糇饔檬前麅?nèi)產(chǎn)物過量后終止酶合成的一種機(jī)制，與反饋抑制相比，反應(yīng)較慢，并且往往影響代謝途徑中所有酶（整個(gè)操縱子）的合成。第51頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一52

2.抗反饋調(diào)節(jié)突變是指解除了反饋調(diào)節(jié)的突變株，包括抗反饋抑制突變和抗反饋?zhàn)瓒敉蛔??？狗答佉种仆蛔兪侵附獬朔答佉种频耐蛔冎?。（調(diào)節(jié)中心發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，無法與效應(yīng)物結(jié)合）抗反饋?zhàn)瓒敉蛔兪侵附獬朔答佔(zhàn)瓒舻耐蛔冎?。（調(diào)節(jié)基因突變或操縱基因突變）第52頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一53

3.抗反饋調(diào)節(jié)突變株的篩選

篩選抗結(jié)構(gòu)類似物突變株利用回復(fù)突變篩選初級代謝產(chǎn)物營養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變篩選抗反饋調(diào)節(jié)突變株（野生型→營養(yǎng)缺陷型→原養(yǎng)型）

次級代謝產(chǎn)物營養(yǎng)缺陷型回復(fù)突變篩選抗反饋調(diào)節(jié)突變株（野生型→營養(yǎng)缺陷型→原養(yǎng)型）

次級代謝產(chǎn)物零產(chǎn)量回復(fù)突變篩選抗反饋調(diào)節(jié)突變株（高產(chǎn)株→零變株→高產(chǎn)株）

第53頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一54

(二)抗代謝類似物突變型的篩選1.代謝類似物與抗代謝類似物突變

代謝類似物：結(jié)構(gòu)與（初級）代謝物類似，因此可起到代謝物所具有的調(diào)節(jié)作用而不具備其生理功能的一類化合物。

第54頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一55

ThreonineAHV

α-Amino-β-hydroxyvalericacid

α-氨基-β-羥基戊酸第55頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一56

Lys

AEC

S-(2-Aminoethyl)-L-CysteineS-（2氨基乙基）-L半胱氨酸第56頁，共63頁，2023年，2月20日，星期一57

真正代謝物功能：合成大分子（終產(chǎn)物一般為初級代謝產(chǎn)物，為生長必需）；調(diào)節(jié)功能（反饋）代謝類似物：只有調(diào)節(jié)功