基因工程的步驟好有真原核基因區(qū)別

基因工程的步驟好有真原核基因區(qū)別第1頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一知識點一：1．原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點啟動子終止子啟動子：是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因首端是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位并能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA。沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，它能阻礙RNA聚合酶的移動，并使其從DNA模板鏈上脫離下來，使轉(zhuǎn)錄終止。第2頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一①不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，不能編碼蛋白質(zhì)。：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA，能編碼蛋白質(zhì)編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)②有調(diào)控序列，最重要的是RNA聚合酶結(jié)合位點。非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動子終止子第3頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)內(nèi)含子外顯子啟動子終止子知識點一：2．真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列與原核細(xì)胞相同非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子第4頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較思考編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞基因結(jié)構(gòu)一樣長嗎？連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼第5頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一1．目的基因的獲取2．基因表達(dá)載體的構(gòu)建3．將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4．目的基因的檢測與鑒定基因工程基本操作的四個步驟第6頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一目的基因的獲取閱讀課本第一自然段，回答以下問題：2．獲取目的基因的常用方法有哪些？（1）從基因文庫中獲?。?）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增（3）人工合成1．什么叫目的基因？并舉例說明。主要是編碼蛋白質(zhì)的基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子第7頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一（一）從基因文庫中獲取目的基因1.基因文庫：概念見課本2.基因文庫的分類:按外源DNA片段的來源分類種類基因組文庫：含有一種生物的全部基因部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫3.基因文庫的目的為了在不知目的基因序列的情況下，便于獲得所需的目的基因。第8頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一提取某種生物的全部DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖幸欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與載體連接導(dǎo)入受體菌中儲存基因組文庫4.基因文庫的構(gòu)建方法（1）直接分離法第9頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一單鏈互補(bǔ)DNA雙鏈cDNA片段導(dǎo)入受體菌中儲存與載體連接cDNA文庫反（逆）轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶（2）反轉(zhuǎn)錄法：cDNA的合成流程圖解某種生物的單鏈mRNA第10頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一思考：１．基因組文庫和部分基因文庫（如cDNA）的關(guān)系？2．基因組文庫和cDNA文庫的比較3．如何從基因文庫中得到所需要的目的基因？文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小基因中啟動子有無基因中內(nèi)含子有無基因多少物種間的基因交流小大無有無有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以第11頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一2．利用PCR擴(kuò)增目的基因（閱讀課本第10頁回答問題）（1）RCR的中文全稱？PCR是一項什么樣的技術(shù)？（2）PCR原理？利用這一技術(shù)獲取目的基因的前提？（3）PCR的過程？這一過程利用了什么酶？（4）通過PCR使目的基因的數(shù)目如何增長？第12頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一

概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)條件：原理：方式：以_____方式擴(kuò)增，即___（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）結(jié)果：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段DNA復(fù)制四種脫氧核苷酸熱穩(wěn)定DNA聚合酶指數(shù)2n在短時間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因前提：要有一段已知目的基因的核苷酸序列一對引物、模板DNA（含目的基因）第13頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一過程：A．DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________B．退火（復(fù)性55℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，

引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。C．延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補(bǔ)的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈第14頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一5/3/G—GT—C3/5/A—GC—C5/3/引物ⅡG—G變性復(fù)性延伸1．變性(90－－95℃)：目的基因DNA受熱變性，解鏈為單鏈；2．復(fù)性（55－－60℃）：引物與兩條單鏈通過堿基互補(bǔ)配對原則結(jié)合；3．延伸（70－－75℃）：在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈5/3/A—G引物Ⅰ（二)利用PC(R技術(shù)擴(kuò)增目的基因第15頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較PCR技術(shù)DNA復(fù)制相同點原料條件不同點解旋方式場所酶結(jié)果四種脫氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化體外復(fù)制細(xì)胞核內(nèi)熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整個DNA分子第16頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一(二)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因第17頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一目的基因的mRNA單鏈DNA(cDNA）雙鏈DNA(即目的基因)反轉(zhuǎn)錄合成1．反轉(zhuǎn)錄法：

以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列目的基因推測推測化學(xué)合成2．根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：（三）人工合成的目的基因第18頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一第19頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一小結(jié)目的基因的獲取目的基因的定義常用方法從基因文庫中獲取利用PCR技術(shù)擴(kuò)增人工合成基因組文庫部分基因文庫原理、條件方式、結(jié)果過程第20頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心1．如何構(gòu)建基因表達(dá)載體？2．基因表達(dá)載體構(gòu)建的目的？3．基因表達(dá)載體的組成？4．啟動子、終止子、標(biāo)記基因的作用分別是？讀教材回答以下問題第21頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一1.用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出2.用_____________切斷目的基因，使其產(chǎn)生——核心3.將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個重組DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端／平末端同一種限制酶切口DNA連接酶二．基因表達(dá)載體的構(gòu)建相同的黏末端／平末端。第22頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一基因表達(dá)載體的組成：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。目的基因啟動子終止子標(biāo)記基因目的：第23頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來第24頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一通讀教材回答問題1．轉(zhuǎn)化的概念2．將目的基因?qū)胫参?、動物、微生物?xì)胞的方法分別有哪些？三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞第25頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（一）轉(zhuǎn)化：（二）方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細(xì)胞目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)第26頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一1．將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法：（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

①農(nóng)桿菌特點：易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力。②原理：Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。第27頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一仔細(xì)閱讀課本將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞（1）將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞采用最多的方法是？（2）農(nóng)桿菌如何感染植物細(xì)胞？（3）農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒中Ｔ－ＤＮＡ有何特點？（4）若用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法應(yīng)選用什么作為運載體？將目的基因插入運載體的什么部位？此時的農(nóng)桿菌是受體細(xì)胞嗎？（5）獲得含有目的基因的受體細(xì)胞后如何獲得具有新性狀的植物體？原理？（6）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和基因槍法分別適用于什么生物？第28頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一③過程：④優(yōu)點：穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)、有效將外源目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA中形成重組Ti質(zhì)粒將重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌使含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌感染植物細(xì)胞含目的基因的植物細(xì)胞表現(xiàn)出新性狀的植株第29頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一（2）基因槍法（3）花粉管通道法第30頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一2．將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞①方法：顯微注射法②程序：目的基因表達(dá)載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射受精卵新性狀動物第31頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一3．將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞閱讀課本：早期基因工程為何選擇原核生物作為受體細(xì)胞？方法？①原核生物特點：繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)少②方法：

用Ca2+處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子第32頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一1．獲取目的基因的常用方法、PCR技術(shù)的原理、條件、過程、方式、結(jié)果。2．人工合成目的基因的方法及過程。3．構(gòu)建基因表達(dá)載體的目的、基因表達(dá)載體的組成及各組成部分的作用。4．基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程？將目的基因?qū)胫参?、動物、微生物?xì)胞的方法分別是什么？5．農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的原理（即Ti質(zhì)粒的T-DNA的作用特點）、適用范圍。6．?dāng)⑹鲇棉r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的過程。復(fù)習(xí)（15分鐘后黑板展示）第33頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一閱讀課本：目的基因的檢測與鑒定目的基因檢測的過程分為哪幾步？分別用什么方法？鑒定（個體生物學(xué)水平）方法？第34頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一四、目的基因的檢測與鑒定檢測—（分子檢測）鑒定——（個體生物學(xué)水平）③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等——檢查是否成功②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因第35頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插了目的基因過程:A．首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA。B．對含目的基因的DNA片段作放射性同位素標(biāo)記，以此做探針。C．使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶，表明染色體已插入染色體DNA中。方法:DNA分子雜交第36頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一第37頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一DNA分子雜交示意圖采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補(bǔ)的堿基序列，那么，互補(bǔ)的堿基序列就會結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補(bǔ)堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。第38頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一目的基因的檢測示意圖第39頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法:分子雜交方法:抗原－抗體雜交過程:用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交，若出現(xiàn)雜交帶，表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA.第40頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一鑒定——抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達(dá)。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達(dá)。思考：若培育耐鹽堿的水稻，如何鑒定？第41頁，共45頁，2023年，2月20日，星期一歸納：基因工程的基本操作程序獲取目的基因從基因文庫利用PCR化學(xué)方法人工合成構(gòu)建基因表達(dá)載體目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化