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基因與基因工程第1頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一生物工程主要有基因工程、細胞工程、酶工程、發(fā)酵工程等4個部分。其中基因工程就是人們對生物基因進行改造,利用生物生產(chǎn)人們想要的特殊產(chǎn)品。隨著DNA的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和遺傳機制的秘密一點一點呈現(xiàn)在人們眼前,生物學家不再僅僅滿足于探索、提示生物遺傳的秘密,而是開始躍躍欲試,設想在分子的水平上去干預生物的遺傳特性。第2頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一基因工程誕生于70年代。自1977年成功地用大腸桿菌生產(chǎn)生長激素釋放抑制因子以來,人胰島素、人生長激素、胸腺素、干擾素、尿激酶、肝火病毒疫菌、口蹄疫疫菌、腹瀉疫菌和腫瘤壞死因子等數(shù)十種基因工程產(chǎn)品相繼問世;1982年開始進入商品市場,在醫(yī)療保健和家畜疾病防治中獲得廣泛應用,并已取得或正在取得巨大的效果和收益。第3頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一第一節(jié)基因研究的發(fā)展一、基因?qū)W說的創(chuàng)立1、Gene的染色體遺傳學階段(50年代前)2、Gene的分子生物學階段(50年代以后)3、反向生物學第4頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一1、Gene的染色體遺傳學階段(細胞的染色體水平上)孟德爾遺傳學規(guī)律(1)(G.Mendel)(1857-1864)豌豆雜交試驗第5頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一孟德爾曾做過雜交實驗的園地第6頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一孟德爾在雜交試驗中主要以豌豆作為試驗材料,這是因為豌豆是自花傳粉植物,而且是閉花受粉,也就是豌豆花在花未開時已經(jīng)完成了受粉。兩性花的花粉,落到同一朵花的雌蕊柱頭上的過程叫做自花傳粉。豌豆花的結(jié)構(gòu)很適合自花傳粉,這是因為花在未受粉前,雄蕊和雌蕊都緊緊地被花瓣包裹著。第7頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一▲每種性狀由遺傳因子控制,提出遺傳因子(Hereditaryfactor)概念第8頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一(2)約翰遜(W.Johannsen丹麥植物學家)(1909)▲首次用基因代替上述“遺傳因子”,但僅是遺傳性狀之符號,無物質(zhì)概念。第9頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一(3)摩爾根(T.H.Morgan,USA)(1910-1915)果蠅遺傳學試驗▲將代表某一性狀的gene與染色體聯(lián)系起來,創(chuàng)立了遺傳的染色體理論。第10頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一2、Gene的分子生物學階段(1)確定遺傳物質(zhì)DNA①Avery等(1944)細菌(肺炎球菌)轉(zhuǎn)化試驗(從DNA大分子水平上)Watson-Crick:DNA雙螺旋模型致病力強的光滑型(S型)肺炎鏈球菌DNA導致致病力弱的粗糙型(R型)細菌發(fā)生遺傳轉(zhuǎn)化的實驗;第11頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一第12頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一②Hershey及Chase等人(1952):噬菌體侵染細菌實驗第13頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一SummaryoftheHershey-Chaseexperiment.Twobatchesofisotopicallylabeledbacteriophageparticleswereprepared.Onewaslabeledwith32PinthephosphategroupsoftheDNAandtheotherwith35Sinthesulfur-containingaminoacidsoftheproteincoats(capsids).(NotethatDNAcontainsnosulfur,andviralproteinnophosphorus.)Thetwobatchesoflabeledphagewerethenaddedtoseparatesuspensionsofunlabeledbacteria.Eachsuspensionofphage-infectedcellswasagitatedinablendertosheartheviralcapsidsfromthebacteria.Thebacteriaandemptyviralcoats(ghosts)werethenseparatedbycentrifugation.Thecellsinfectedwiththe32P-labeledphagewerefoundtocontain32P,indicatingthatthelabeledviralDNAhadenteredthecells,andtheviralghostscontainednoradioactivity.Thecellsinfectedwith35S-labeledphagewerefoundtohavenoradioactivityafterblendertreatment,buttheviralghostscontained35S.Progenyvirusparticleswereproducedinbothbatchesofbacteriasometimeaftertheviralcoatswereremoved,thusthegeneticmessagefortheirreplicationhadbeenintroducedbyviralDNA,notbyviralprotein.第14頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一(2)將核酸和蛋白質(zhì)聯(lián)系在一起的是著名的中心法則第15頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一原核細胞基因編碼區(qū)(編碼序列):能指導有關(guān)蛋白質(zhì)的合成,即能夠編碼蛋白質(zhì)非編碼區(qū)(調(diào)控序列):位于編碼區(qū)上游和編碼區(qū)下游的DNA序列,雖不能指導有關(guān)蛋白質(zhì)的合成,但有調(diào)控遺傳信息表達的核苷酸序列,如啟動子、終止子等(3)基因的結(jié)構(gòu)①原核生物基因結(jié)構(gòu)第16頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一②真核細胞的基因結(jié)構(gòu)真核細胞基因編碼區(qū)(間隔、不連續(xù))外顯子:能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列內(nèi)含子:不能編碼蛋白質(zhì)的DNA序列非編碼區(qū):與原核生物具有相似功能的啟動子、終止子第17頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一(4)基因表達調(diào)控①原核生物中許多基因以操縱子為基礎(chǔ)進行調(diào)節(jié)細菌中許多基因按照功能相關(guān)性串聯(lián)在一起,組成轉(zhuǎn)錄單位,受同一個啟動子驅(qū)動形成多順反子mRNA。操縱子(operon)——若干個結(jié)構(gòu)基因,共同的啟動子及行使一定功能的附加序列(如操縱基因)第18頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一例如:乳糖操縱子結(jié)構(gòu)lacI——調(diào)節(jié)基因lacO——操縱基因lacZ——
β-半乳糖苷酶基因lacY——透過酶基因lacA——乙酰轉(zhuǎn)移酶基因第19頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一lacIlacPlacOlacZlacYlacA阻遏誘導lacIlacPlacOlacZlacYlacA乳糖第20頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一②真核生物主要是轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控,順式作用元件與反式作用因子之間的相互作用第21頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一3、反向生物學由于基因工程的出現(xiàn),在生命科學研究中的許多難題,由基因操作下手,往往更為簡捷方便。與傳統(tǒng)生物學的由表及里不同,而是由生命的核心——基因物質(zhì)出發(fā),反向而行,這就是反向生物學。例:①研究胰島素分子的結(jié)構(gòu)功能,可以由基因設計開始,利用基因工程技術(shù)做出各種各樣結(jié)構(gòu)的胰島素來,從中可以很快地得到速效胰島素分子。②把功能還不太清楚的基因引入小鼠,做成特殊的轉(zhuǎn)基因鼠,來研究此基因的功能,或者相反的敲除這個基因來研究其功能。第22頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一第二節(jié)基因的現(xiàn)代概念一、轉(zhuǎn)座子1、基本概念:DNA的轉(zhuǎn)座,或稱移位(transposition),是由可移位因子(transposableelement)介導的遺傳物質(zhì)重排現(xiàn)象。轉(zhuǎn)座過程中,可移位因子的一個拷貝常常留在原來位置上,在新位點上出現(xiàn)的僅僅是拷貝。因此,轉(zhuǎn)座有別于同源重組,它依賴于DNA的復制,發(fā)生的頻率低。第23頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一2、分類(1)插入序列(insertionalsequence,IS)表示方法如λ::IS1,是細菌染色體或質(zhì)粒DNA的正常組成部分,IS序列都是可以獨立存在的單元,帶有介導自身移動的蛋白。第24頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一特點:①長700-2000bp②末端有倒置重復序列,轉(zhuǎn)座時往往復制宿主靶位點一小段DNA(4-15bp),形成位于IS兩端的正向重復③只有一個開放讀碼框,產(chǎn)生功能型轉(zhuǎn)座酶第25頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一第26頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一(2)復合式轉(zhuǎn)座子(compositetransposon)是一類帶有某些抗藥性基因(或其他宿主基因)的轉(zhuǎn)座子,其兩翼往往是兩個相同或高度同源的IS序列,表明IS序列插入到某個功能基因兩端時就可能產(chǎn)生復合轉(zhuǎn)座子。一旦形成復合轉(zhuǎn)座子,IS序列就不能再單獨移動,因為它們的功能被修飾了,只能作為復合體移動。第27頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一第28頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一3、轉(zhuǎn)座作用機制特點:受體分子中有一段很短的(3-12bp)、被稱為靶序列的DNA會被復制,使插入的轉(zhuǎn)座子位于兩個重復的靶序列之間。不同轉(zhuǎn)座子的靶序列長度不同,但對于一個特定的轉(zhuǎn)座子來說,它所復制的靶序列長度都是一樣的,如IS1兩翼總有9個堿基對的靶序列,而Tn3兩端總有5bp的靶序列。分類:轉(zhuǎn)座可被分為復制性和非復制性兩大類
第29頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一非復制性轉(zhuǎn)座第30頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一復制性轉(zhuǎn)座解離酶在兩個轉(zhuǎn)座子拷貝間將轉(zhuǎn)座共整和體分開轉(zhuǎn)座酶在靶位點處切成一個錯開的切口,并把轉(zhuǎn)座子末端切開oldnew第31頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一二、斷裂基因(interruptedgene)1、概念1977年,Broker和Sharp等發(fā)現(xiàn)了不連續(xù)基因,現(xiàn)已知道絕大多數(shù)真核生物基因都是不連續(xù)的,為不編碼的序列隔開。2、真核基因必需切除基因中的內(nèi)含子形成mRNA成熟體,翻譯成蛋白質(zhì),所以在原核細胞中表達真核基因時,必需構(gòu)建不含內(nèi)含子的重組基因。第32頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一提取細胞RNA反轉(zhuǎn)錄mRNAcDNAP1P2PCR擴增在E.coil或酵母中表達第33頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一三、假基因(Pseudogene)
G.Jacq(1977)非洲爪蟾5SrRNA基因系統(tǒng)研究提出的功能失活的特殊DNA序列。同正常的gene相比,絕大部分是同源的,但因存在許多突變(插入、缺失等)而阻礙了自身的表達。第34頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一例:重復的假基因特點:與親本基因連鎖,同其編碼區(qū)及側(cè)翼序列的DNA有很高的同源性。產(chǎn)生的原因可能是由含有親本基因的染色體區(qū)段串聯(lián)重復形成。第35頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一第36頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一四、重復序列①不重復序列(singlecopysequence,1-3copies)copy數(shù):在單倍體基因組里,這些序列一般只有一個或幾個拷貝;含量:占DNA總量的40%-80%;長度:約750-2000bp,相當于一個結(jié)構(gòu)基因的長度;特點:單拷貝基因通過基因擴增仍可合成大量的蛋白質(zhì);第37頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一②中度重復序列
(middlerepetitivesequence)copy數(shù):在單倍體基因組里,這些序列一般只有10-104拷貝;含量:占DNA總量的10%-40%;特點:基因拷貝重復,多量
序列相同或相似排列成串
功能相同舉例:rDNA,tDNA,Alufamily等第38頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一非洲爪蟾的18S、5.8S及28SrRNA基因是連在一起的,中間隔著不轉(zhuǎn)錄的間隔區(qū),這些單位在DNA鏈上串聯(lián)重復約5000次。在卵細胞形成過程中這些基因可進行幾千次不同比例的復制,產(chǎn)生2×106個拷貝,使rDNA占卵細胞DNA的75%,從而使該細胞能積累1012個核糖體。第39頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一
由于堿基組成的不同,各物種的DNA在CsCl梯度離心中,平衡時的浮力密度決定于G+C的含量,G+C含量高,浮力密度大。故對某一物種來說,其浮力密度曲線是覆蓋一定浮力密度范圍的一條寬帶,高度重復序列中,有一些簡單高度重復序列,G+C特別的低或高,故形成比主帶略重或略輕的衛(wèi)星帶,叫衛(wèi)星DNA衛(wèi)星DNA③高度重復序列(highrepetitivesequence)——衛(wèi)星DNA第40頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一copy數(shù):在單倍體基因組里,這些序列一般只有105-106拷貝;含量:占DNA總量的10%-60%;特點:基因拷貝多串聯(lián)重復排列,分布于著絲粒,端粒,結(jié)構(gòu)基因兩側(cè),異染色質(zhì)的成分,與染色體的穩(wěn)定有關(guān)長度:約6-100bp第41頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一酵母Telomeres一般以100bp左右不精確重復序列所組成。
5’(TxGy)n
3’(AxCy)n
其中X、Y一般為1-4單細胞真核生物中n常為20-100,高等真核生物中>1500。真核生物端粒Telomeres第42頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一散在序列
——重復單位散布在整個基因組的各個地方,中間被編碼的DNA間斷SINE(短散在序列):長度小于500bpLINE(長散在序列):長度在5~7kb第43頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一F.Sanger(1977)ΦX174噬菌體DNA研究中提出的概念同一部分DNA能編碼兩種不同的蛋白質(zhì),不同gene的核苷酸序列有時可以共用,即其核苷酸序列是彼此重疊。修正了關(guān)于各個gene的多核苷酸鏈是彼此分立,互不重疊的觀念。五、重疊基因第44頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一第45頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一第三節(jié)基因工程的誕生及其主要研究內(nèi)容一、1973年是基因工程誕生的元年E.coli第46頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一第47頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一1985第一批轉(zhuǎn)基因家畜(兔、豬和羊)誕生1986基因工程生物(genetically-engineeredorganisms)首次在控制的情況下實驗性地釋放到環(huán)境中1988J.D.Watson出任“人類基因組計劃”首席科學家,協(xié)調(diào)舉世矚目的人類基因組測序工作1989美國聯(lián)邦專利局宣布將接受基因工程植物和動物方面的專利申請。第一個用于醫(yī)藥研究具有專利權(quán)的動物-杜邦腫瘤鼠(Dupout's"Oncomouse")誕生第48頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一美國國家衛(wèi)生研究院(NIH)重組DNA咨詢委員會批準進行第一個轉(zhuǎn)基因植物實驗90-92第一個轉(zhuǎn)基因玉米及轉(zhuǎn)基因小麥植株誕生,谷物基因工程開始變?yōu)楝F(xiàn)實;歐洲共同體各國35個實驗室首發(fā)表第一個真核生物染色體(酵母染色體III)DNA全序列(共315000bp)1994基因工程西紅柿在美國上市1995英國Nature雜志發(fā)表了人基因組全物理圖,以及3號、16號和22號人染色體的高密度物理圖第49頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一1996完成酵母基因組DNA全序列測定工作1997英國愛丁堡羅斯林研究所的科學家宣稱應用轉(zhuǎn)基因技術(shù)首次育成克隆羊,引起世界轟動(體細胞克隆,而非基因克?。?998第一批用成年的動物體細胞克隆的克隆牛和第一次用克隆動物克隆的克隆鼠相繼誕生;美國PE公司發(fā)現(xiàn)新的DNA測序技術(shù),比現(xiàn)有技術(shù)快10倍,它最終使人類基因組計劃在二年后完成第50頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一2000年6月22日,人類基因組研究組織(政府,6個國家參與)和塞萊拉基因組公司(私人)共同宣布人類基因組計劃DNA測序草圖完成;后基因組計劃(結(jié)構(gòu)基因組)啟動2001J-M.Claverie提出“人類結(jié)構(gòu)基因可能僅有30000個(2.5-3.0萬)”的推論。但8月馬里蘭人類基因科學研究機構(gòu)的專家威廉﹒哈澤爾泰姆把該數(shù)字提高到12萬,因他的研究組已經(jīng)鑒定有9萬個基因第51頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一
2003年,美國國家人類基因組研究項目負責人弗朗西斯·柯林斯博士4月14日中午在華盛頓隆重宣布,人類基因組序列圖繪制成功,人類基因組計劃的所有目標全部實現(xiàn)。
第52頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一二、基因工程研究的內(nèi)容基因工程(geneticengineering)、基因克隆、DNA重組、DNA克隆、分子克隆1、研究內(nèi)容
應用酶學的方法,在體外將目的基因與載體DNA結(jié)合成一具有自我復制能力的DNA分子(復制子、重組體),繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞、篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細胞,再進行擴增、提取獲得大量同一DNA分子拷貝,或其表達產(chǎn)物。第53頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一2、重組DNA技術(shù)的基本過程目的基因的制備載體的選擇和制備DNA分子的體外連接將外源DNA導入宿主細胞目的基因的篩選和鑒定第54頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一基因克隆示意圖第55頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一第56頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一3、轉(zhuǎn)基因動植物在1982轉(zhuǎn)基因小鼠成功之后,1983年轉(zhuǎn)基因煙草問世,隨后轉(zhuǎn)基因植物迅速發(fā)展,目前至少有120種轉(zhuǎn)基因植物問世。自從1994年轉(zhuǎn)基因延熟西紅柿獲準上市以來,目前至少有51種轉(zhuǎn)基因植物上市,2001年轉(zhuǎn)基因種植面積達到10億畝,其中美國占68%、阿根廷占22%、加拿大占7%、中國占3%。第57頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一(1)轉(zhuǎn)基因植物的類型抗病轉(zhuǎn)基因植物:抗病毒轉(zhuǎn)基因煙草抗蟲轉(zhuǎn)基因植物:抗蟲棉抗逆轉(zhuǎn)基因植物:抗旱、抗鹽堿抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物:抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、棉花、油菜改良品質(zhì)轉(zhuǎn)基因植物:轉(zhuǎn)VA水稻轉(zhuǎn)基因藥品植物:生產(chǎn)霍亂疫苗的胡蘿卜第58頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一第59頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一(2)轉(zhuǎn)基因食品的優(yōu)點
把具有價值的目的基因,如高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病毒、抗蟲、抗除草劑、抗寒、抗旱、抗?jié)?、抗鹽堿、改變花色和花形、延長保鮮期等基因分別轉(zhuǎn)入到煙草、馬鈴薯、棉、番茄、大豆、苜蓿、矮牽牛等植物中,取得了可喜的成就。轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因玉米在田間生長蟲試(右為轉(zhuǎn)基因玉米)第60頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一(3)轉(zhuǎn)基因食品的缺點轉(zhuǎn)基因食品主要缺點有:①含有抗蟲害基因的食品會威脅人類健康;
②轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品可能對環(huán)境的影響;③轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品可能會破壞生物多樣性。第61頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一應用轉(zhuǎn)基因技術(shù)生產(chǎn)的食品,因為使用的特殊的現(xiàn)代分子生物學技術(shù),從而產(chǎn)生了轉(zhuǎn)入遺傳物質(zhì)后的食品是否安全的問題。轉(zhuǎn)基因過程的各個環(huán)節(jié)都有可能對食品的安全性產(chǎn)生影響。由于插入基因后所產(chǎn)生的終產(chǎn)物或許是迄今為止人類沒有充分認識到的新的產(chǎn)物,如:致癌物、激素、過敏原等。另外,由于新的基因的轉(zhuǎn)入或基因重組,對固有生物的性質(zhì),如:保水性、儲藏、硬度以及營養(yǎng)成分的含量和比例等都有影響。
轉(zhuǎn)基因食品使用安全性問題第62頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一環(huán)境安全性的核心問題是轉(zhuǎn)基因作物釋放到田間后,是否會將插入的基因漂移到野生植物中或傳統(tǒng)植物中,是否會破壞自然生態(tài)環(huán)境,打破原有生物種群的動態(tài)平衡①轉(zhuǎn)基因作物演變成農(nóng)田雜草的可能性;②基因漂流到近緣野生種的可能性;③對生物類群的影響(抗除莠劑的作物一旦有機會與野生植物雜交就可能使雜草獲得除莠劑耐受性,從而產(chǎn)生“超級雜草”,這必將嚴重影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn),造成巨大損失。同樣,抗蟲作物也存在抗性基因擴散的可能性)。轉(zhuǎn)基因作物環(huán)境安全性問題第63頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一農(nóng)業(yè)基因工程:強調(diào)提高農(nóng)作物產(chǎn)量和改善農(nóng)作物的抗蟲性、抗病性、抗除草劑和抗旱能力食品基因工程:強調(diào)改善食品的營養(yǎng)價值和食用風味,如營養(yǎng)素含量、風味品質(zhì)、延長食品儲藏和保存時間,以及用食品工程菌生產(chǎn)食品添加劑和功能因子等安全性環(huán)境安全:如插入基因的漂移、抗蟲性、抗除草性
食用安全:如插入基因后的終產(chǎn)物的致癌性、致病性、過敏性、毒性(4)轉(zhuǎn)基因食品的安全性及營養(yǎng)問題第64頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一1、國際組織
——實質(zhì)等同原則(5)國外對轉(zhuǎn)基因食品管理的現(xiàn)狀表型性狀等同成分等同第65頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一實質(zhì)等同性原則是指轉(zhuǎn)基因食品及食品成分是否與傳統(tǒng)食品具有實質(zhì)等同性。實質(zhì)等同性原則包括二方面的內(nèi)容:①表型性狀等同,如植物的形態(tài)、生長、產(chǎn)量、抗病性及育種的農(nóng)藝性狀;②成分等同,包括主要營養(yǎng)成分、有害物質(zhì)、抗營養(yǎng)因子、毒物和變應性蛋白等方面。第66頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一2000年《卡塔赫納生物安全協(xié)定書》,62個國家簽署2001年《生物安全議定書》,130多個國家簽署2003年《生物技術(shù)食品的風險評估草案》,226個國家表示歡迎。第67頁,共73頁,2023年,2月20日,星期一4、我國對轉(zhuǎn)基因食品的對策
◆1993年12月24日,國家科委頒布實施了《基因工程安全管理辦法》◆1996年7月10日,國家農(nóng)業(yè)部頒布實
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