分子生物學(xué)實驗(生技生科)下游

實驗流程一目前一頁\總數(shù)四十二頁\編于三點實驗安排準(zhǔn)備材料：重組工程菌目標(biāo)蛋白的表達第1次菌體超聲破壁、離心、包涵體復(fù)性、裝離子交換柱第2次測酶活、定蛋白、離子交換層析第3次親和柱層析，并對收集樣品進行測活、定蛋白等

第4次對分離純化各樣品進行蛋白電泳分析第5次Westernblotting，繪出分離純化表繪制包涵體復(fù)性曲線目前二頁\總數(shù)四十二頁\編于三點實驗操作第1次：菌體超聲破壁、離心、包涵體復(fù)性、裝離子交換柱實驗順序：超聲破壁-->離心（洗滌，注意平衡）-->裝柱

-->平衡-->包涵體溶解（2hr）-->復(fù)性-->測活涉及單元實驗：破壁、離心、裝柱、復(fù)性、酶活測定掌握要點：破壁原理裝離子交換柱方法包涵體復(fù)性原理及方法脂肪酶測活原理

目前三頁\總數(shù)四十二頁\編于三點R=CH3;C3H8…用不同碳鏈長度的對硝基苯酚酯(p-nitrophenyl(pNP)esters)作為底物pNP–黃色物質(zhì)在405nm處有最大吸收峰底物30μl酶液100μl緩沖液

2.87ml分光光度計根據(jù)吸光值的變化率和公計算酶活測活方法目前四頁\總數(shù)四十二頁\編于三點對硝基苯酚磷酸酯p-NPP堿性磷酸酶對硝基苯酚p-NP酯酶測活原理以對硝基酚磷酸二鈉為底物，根據(jù)水解磷酯鍵所產(chǎn)生的對硝基酚量測定酶活力。在37℃、pH10.0條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化產(chǎn)生1μmol/L對硝基酚的酶量為1個酶單位目前五頁\總數(shù)四十二頁\編于三點每10秒記一個數(shù)（0、10、20、……120）將時間及其對應(yīng)的A405導(dǎo)入EXCEL文檔中，做時間t—A405曲線，得到斜率，用公式：酶活=（ΔOD405-Δ自分解）*18231.26*稀釋倍數(shù)（此處為1000）（u/ml）（注：ΔOD405為曲線斜率、Δ自分解為如果底物未分解（無黃色），視為0，否則需要將底物以KPB為對照進行標(biāo)定）定量測活與定性測活（2分鐘測一個點）對每個收集管進行A280與酶活力定性測定目前六頁\總數(shù)四十二頁\編于三點酶標(biāo)定性測活每組一條酶標(biāo)版（8孔單位uL）

孔號12345678破碎上清原液原液稀釋10倍原液稀釋100倍原液稀釋1000倍原液稀釋10000倍包涵體復(fù)興液空白對照無KPB（磷酸緩沖液）174174174174174174194酶液2020202020200底物6666666底物留待即將酶標(biāo)測定時加目前七頁\總數(shù)四十二頁\編于三點實驗1次序安排1超聲－離心－保留上清沉淀－洗滌－離心-保留沉淀2包涵體溶解－復(fù)性放置冰箱，每次實驗測活3洗柱、裝柱：水1：1介質(zhì)平衡50-100ml4洗試管，自然倒扣晾干（紙巾墊）5注意留樣!（上清0.5ml-20度保存）注意標(biāo)清組號！6登記測活數(shù)據(jù)（老師本子）8值日：A室、B室（2組/次）

公用臺物品不得挪用桌面整齊出席率-平時分！冰箱分配測活次序上午定性測活！目前八頁\總數(shù)四十二頁\編于三點目前九頁\總數(shù)四十二頁\編于三點目前十頁\總數(shù)四十二頁\編于三點實驗二內(nèi)容對上一次制備的上清液（8ml）/2

進行離子交換層析樣品活性分析及蛋白濃度測定繪制純化表純度分析(蛋白電泳)目前十一頁\總數(shù)四十二頁\編于三點蛋白質(zhì)分離純化方法離子交換凝膠過濾親和層析疏水層析……目前十二頁\總數(shù)四十二頁\編于三點凝膠過濾的工作原理目前十三頁\總數(shù)四十二頁\編于三點離子交換層析蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)可解離基團：-氨基，-羧基，側(cè)鏈R基團蛋白質(zhì)等電點：在某一pH值，蛋白所帶正負電荷相等，即凈電荷為零時溶液的pH稱為該蛋白等電點目前十四頁\總數(shù)四十二頁\編于三點

離子交換層析柱層析程序：裝柱、平衡、上樣、洗滌、洗脫、合并樣品種類：－O－CH2－CH2－N+－(CH2CH3)3二乙基氨基乙基纖維素（DEAE）

葡聚糖瓊脂糖纖維素目前十五頁\總數(shù)四十二頁\編于三點離子交換層析的洗脫過程示意目前十六頁\總數(shù)四十二頁\編于三點離子強度梯度：通過不斷增加離子強度，吸附到交換劑上的物質(zhì)根據(jù)其靜電引力的大小而不斷競爭性的解脫pH梯度：當(dāng)pH梯度接近各樣品離子的等電點時，該物質(zhì)就被解脫連續(xù)的（稱梯度洗脫），不連續(xù)的（稱階段洗脫）待分離物質(zhì)洗脫時常用的兩種方法目前十七頁\總數(shù)四十二頁\編于三點實驗設(shè)計離子交換原理離子交換層析根據(jù)化合物的凈電荷進行分離？應(yīng)該選用哪種層析介質(zhì)？pH如何選擇吸附條件及最佳吸附條件?平衡判斷的標(biāo)準(zhǔn)操作手冊？目前十八頁\總數(shù)四十二頁\編于三點實驗二內(nèi)容對上一次制備的上清液（8ml）/2

進行離子交換層析樣品活性分析及蛋白濃度測定繪制純化表純度分析(蛋白電泳)目前十九頁\總數(shù)四十二頁\編于三點層析操作一般過程

裝柱、平衡、上樣、洗滌、洗脫、合并樣品上樣前后樣品活性測定當(dāng)天測定上樣前后蛋白濃度測定最后一天測定上樣前后樣品體積測定當(dāng)天測定目前二十頁\總數(shù)四十二頁\編于三點步驟總體積（ml）蛋白濃度（mg/ml）蛋白總量（mg）酶濃度（U/ml）比活力（U/mg蛋白）總活力（U）產(chǎn)率（％）提純倍數(shù)粗無細胞抽提液1000121200050.41650001001.0050C熱變性除雜蛋白1000880004.80.604800961.44硫酸銨分級30％-50％飽和度沉淀部分250375011.03.672730558.83DEAE-凝膠層析，pH梯度第50-60管（5ml/管）經(jīng)透析、濃縮259225889.822004423.6DEAE-纖維素KCl梯度，第21-31管（2ml/管）經(jīng)透析、濃縮573536452182036.4125凝膠過濾葡聚糖凝膠G-100第31-40管（1ml/管）合并100.929.2170185170034444羥基磷灰石層析，磷酸鹽梯度，第15-18管（1ml/管）合并40.7533755001500301200酶的提純過程純化記錄表目前二十一頁\總數(shù)四十二頁\編于三點蛋白純化過程分析純化過程評價指標(biāo)純度檢測方法柱效的初步判斷：

OD280曲線和OD405曲線的重疊與純化效果

目前二十二頁\總數(shù)四十二頁\編于三點A瓶0NNaCl100mlB瓶1NNaCl100ml目前二十三頁\總數(shù)四十二頁\編于三點1)在梯度洗脫儀中的洗脫瓶A（混合器）和洗脫瓶B（貯存器）內(nèi)各裝入100毫升緩沖液Ⅰ和緩沖液Ⅱ（注意加溶液的方法），注意液面應(yīng)處于同一水平面，同時應(yīng)排除連接管內(nèi)的氣泡2)開動梯度洗脫儀中的電磁攪拌器開關(guān)，調(diào)節(jié)攪拌速度，以混合器內(nèi)緩沖液旋轉(zhuǎn)而無明顯旋渦為宜3)將洗脫瓶A、洗脫瓶B與層析柱上端連接管道打開，同時將層析柱下端接收樣品4)控制洗脫流速，收集洗脫流出液約20管（3毫升/管），編號！操作要點目前二十四頁\總數(shù)四十二頁\編于三點

同一凝膠柱在不同流速下的洗脫曲線：較快的流速下得到的冼脫峰也寬流速低洗脫峰窄而高--分辨率較高，樣品稀釋較少

流速對洗脫曲線的影響目前二十五頁\總數(shù)四十二頁\編于三點實驗2次序安排1上樣（稀釋一倍左右）速度要慢！洗滌（20－30ml左右）安裝梯度洗脫裝置200mlbuffer于左側(cè)瓶，平衡后關(guān)閉通道，左側(cè)加6gNaCl，然后進行梯度洗脫，（注意流速！1d/5秒5分/管），試管編號！定性測活及OD280，注意：酶活最高管留樣100ul！將有酶活試管合并，精確測活酶液上清合并液留樣0.5ml(上清液)用于分析，其余量好體積登記數(shù)據(jù)（上樣前后精確測酶活性，體積）

定性測活和定量測活

定性測蛋白和定量測蛋白?。?！留樣？？？目前二十六頁\總數(shù)四十二頁\編于三點實驗操作第2次：測酶活、定蛋白、離子交換層析分析

實驗順序：離心/留樣/量體積！-->上柱-->定蛋白-->紫外吸收測蛋白峰、酶活曲線測定-->收集樣品/留樣/量體積！涉及單元實驗：測酶活、定蛋白、離子交換層析

掌握要點：紫外吸收法繪蛋白濃度曲線方法

離子交換層析原理及方法

目前二十七頁\總數(shù)四十二頁\編于三點

BS－100自動部分收集器安裝圈1．反全閥；2換管臂；3滴管；4，5換管臂固定螺絲；6.豎桿；7.豎桿囤定螓絲；8報警板；9.試管；10．收集盤；11.時間選揮旋鈕；12.時間選擇固定螺釘；13．自動開關(guān)；14、指示燈；15.電源開關(guān)；16．換向開關(guān)（逆、順）；17．手動開關(guān)目前二十八頁\總數(shù)四十二頁\編于三點實驗操作第3次：粗酶樣品制備，親和層析，并對收集樣品進行分析

實驗順序：親和層析

-->紫外吸收測蛋白峰

-->酶活曲線測定(3管)-->考馬斯亮藍法定蛋白涉及單元實驗：破壁、離心、裝柱、層析、分析、留樣掌握要點：親和層析原理和操作

親和層析合并液量體積、精確測活、定蛋白

計算比活、純化倍數(shù)、回收率（登記數(shù)據(jù)）目前二十九頁\總數(shù)四十二頁\編于三點鎳柱純化實驗流程

一．上清液測活二．Ni柱純化步驟：裝柱:清洗玻璃柱，連接好橡皮管，將層析柱安裝到鐵架臺上向柱內(nèi)加入1-2ml蒸餾水，再加1-2ml鎳柱介質(zhì)（助教完成）平衡:先用水15-20ml洗介質(zhì),再用5-10ml

平衡液（實驗臺上20mMTrispH8.0）平衡柱子(流速慢!)。平衡液沿柱內(nèi)壁緩慢加入上樣:取3ml上清液上樣，上樣過程中的穿出夜收集起來，再重新上樣，如此循環(huán)3次?。鞔┮簻y活）洗滌:上樣完成之后，用3-5ml洗滌液（實驗臺上10mMTrispH8，50mM咪唑）洗去沒有結(jié)合的蛋白（洗滌液測活）洗脫:用3ml洗脫液（實驗臺上10mMTrispH8，300mM咪唑）洗脫目標(biāo)蛋白。1ml/管，收集3-5管。各管洗脫液測活。三．復(fù)性液測活目前三十頁\總數(shù)四十二頁\編于三點各樣品測活、測蛋白稀釋倍數(shù)及加樣量參考表

待測液測酶活DEAE離子交換:上清液上樣稀釋500-1000倍復(fù)性液:直接測活DEAE洗脫合并液:Ni-NTA上清液:稀釋250-500倍測活目前三十一頁\總數(shù)四十二頁\編于三點實驗操作第4-5次：對分離純化各樣品進行蛋白電泳分析//Westernbloting，繪出分離純化表實驗順序：蛋白電泳，同時進行數(shù)據(jù)分析涉及單元實驗：蛋白電泳掌握要點：掌握蛋白電泳方法及/Westernbloting

了解分離純化樣品純度鑒定的各種方法繪制酶的分離純化表目前三十二頁\總數(shù)四十二頁\編于三點1.

包涵體復(fù)性上樣液2.

上清上樣液（Ni柱沉淀）3.DE管活性最高管4Ni柱洗脫活性最高管5.Mark（蛋白電泳位置）6.

7.

8.

9.10點樣量：20ul樣品（不足用buffer補足）＋

20ulloadingbuffer

煮沸3分鐘，離心Ni柱點樣：上清（1/3量）、洗脫Westen電泳位置！

Mark點在最邊上，并空行，用于染色要求點兩塊板，順序一致！預(yù)染Mark樣品處理勿忘！目前三十三頁\總數(shù)四十二頁\編于三點Ni柱點樣：Ni柱洗脫活性最高管1-8組

Mark點在最邊上，并空行，用于染色要求點兩塊板，順序一致！走電泳時左右方向不能錯，電泳結(jié)束后剪下Mark泳道，氨基黑染色Westernbloting目前三十四頁\總數(shù)四十二頁\編于三點目前三十五頁\總數(shù)四十二頁\編于三點實驗?zāi)康呐c原理

Westernbloting技術(shù)是用來檢測蛋白表達的靈敏方法由蛋白質(zhì)的SDS、電轉(zhuǎn)及雜交幾部分組成雜交技術(shù)主要有NC膜封閉，靶蛋白與第一抗體的反應(yīng)，結(jié)合靶蛋白的一抗和二抗的反應(yīng)，顯色等組成將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NC膜上，用其他蛋白作為封閉液，將膜上余下的其他蛋白結(jié)合位點封閉，加入與檢測蛋白特異性結(jié)合的第一抗體，經(jīng)免疫反應(yīng)，一抗與靶蛋白結(jié)合，經(jīng)洗膜后，膜上僅在靶蛋白處結(jié)合抗體。然后加入與第一抗體有免疫特異性的二抗，使之與一抗反應(yīng)，反應(yīng)后經(jīng)洗膜液洗滌，二抗僅存在于結(jié)合靶蛋白的一抗上。因為這種二抗都為酶標(biāo)抗體，通過酶顯色反應(yīng)，膜上結(jié)合靶蛋白位置即將呈現(xiàn)一定的顏色

目前三十六頁\總數(shù)四十二頁\編于三點目前三十七頁\總數(shù)四十二頁\編于三點WESTERNBLOT目前三十八頁\總數(shù)四十二頁\編于三點從負極(黑孔板)到正極(白孔板)依次為：黑孔板、凝膠支持纖維墊、濾紙、凝膠凝膠支持纖維