氨基酸育種及擴(kuò)大培養(yǎng)

氨基酸育種及擴(kuò)大培養(yǎng)目前一頁\總數(shù)六十七頁\編于十點目錄Chapter1L-谷氨酸菌種選育及培養(yǎng)過程Chapter2L-纈氨酸育種目前二頁\總數(shù)六十七頁\編于十點Chapter1L-谷氨酸菌種選育及培養(yǎng)過程

目前三頁\總數(shù)六十七頁\編于十點第一節(jié)谷氨酸生產(chǎn)菌的主要特征現(xiàn)有谷氨酸生產(chǎn)菌的分類現(xiàn)有谷氨酸生產(chǎn)菌的主要特征目前四頁\總數(shù)六十七頁\編于十點CorynebacteriumBrevibacteriumArthrobacterMicrobacterium現(xiàn)有谷氨酸生產(chǎn)菌的分類目前五頁\總數(shù)六十七頁\編于十點現(xiàn)有谷氨酸生產(chǎn)菌的主要特征細(xì)胞形態(tài)為球形、棒形以至短桿形革蘭氏染色陽性，無芽孢，無鞭毛，不能運動都是需氧型微生物脲酶強(qiáng)陽性目前六頁\總數(shù)六十七頁\編于十點現(xiàn)有谷氨酸生產(chǎn)菌的主要特征不分解淀粉、纖維素、油脂、酪蛋白以及明膠等發(fā)酵中菌體發(fā)生明顯的形態(tài)變化，同時發(fā)生細(xì)胞膜滲透性的變化CO2固定反應(yīng)酶系活力強(qiáng)異檸檬酸裂解酶活力欠缺或微弱，乙醛酸循環(huán)弱α-酮戊二酸氧化能力微弱目前七頁\總數(shù)六十七頁\編于十點現(xiàn)有谷氨酸生產(chǎn)菌的主要特征還原型輔酶Ⅱ(NADPH2)進(jìn)入呼吸鏈能力弱檸檬酸合成酶、烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶以及谷氨酸脫氫酶活力強(qiáng)能利用醋酸，不能利用石蠟具有向環(huán)境中泄漏谷氨酸的能力不分解利用谷氨酸，并能耐高濃度的谷氨酸，產(chǎn)谷氨酸5％以上目前八頁\總數(shù)六十七頁\編于十點第二節(jié)谷氨酸生產(chǎn)菌在

發(fā)酵過程中的形態(tài)變化種子的菌體形態(tài)谷氨酸發(fā)酵不同階段的菌體形態(tài)谷氨酸發(fā)酵感染噬菌體后的菌體形態(tài)目前九頁\總數(shù)六十七頁\編于十點典型的谷氨酸種子擴(kuò)大培養(yǎng)與發(fā)酵過程示意圖目前十頁\總數(shù)六十七頁\編于十點涂片干燥固定染色1min水洗、吸干鏡檢谷氨酸菌種結(jié)晶紫染色過程示意圖目前十一頁\總數(shù)六十七頁\編于十點種子的菌體形態(tài)斜面培養(yǎng)的菌體較細(xì)小，一、二級種子比斜面菌體大而粗壯，革蘭氏染色深菌體細(xì)胞多為短桿至棒桿狀，有的微呈彎曲狀，兩端鈍圓，無分枝細(xì)胞排列呈單個、成對及“V”字形，也有柵狀或不規(guī)則聚塊分裂的細(xì)胞大小為0.7～0.9×1.0～3.4μm目前十二頁\總數(shù)六十七頁\編于十點谷氨酸發(fā)酵不同階段的菌體形態(tài)從谷氨酸發(fā)酵中菌體形態(tài)的變化來看，大致可以分為3種不同時期的細(xì)胞形態(tài)：長菌型細(xì)胞轉(zhuǎn)移期細(xì)胞產(chǎn)酸型細(xì)胞目前十三頁\總數(shù)六十七頁\編于十點長菌型細(xì)胞發(fā)酵0～8h或0～10h細(xì)胞形態(tài)與二級種子基本相似這種細(xì)胞多為短桿至棒桿，有的微呈彎曲狀，細(xì)胞排列呈單個、成對及“V”字形谷氨酸發(fā)酵不同階段的菌體形態(tài)目前十四頁\總數(shù)六十七頁\編于十點轉(zhuǎn)移期細(xì)胞發(fā)酵8～18h或10～20h此階段細(xì)胞形態(tài)急劇變化，細(xì)胞開始伸長、膨大，在生物素貧乏的條件下，通過再度倍增，從谷氨酸非積累型細(xì)胞轉(zhuǎn)變成谷氨酸積累型細(xì)胞（產(chǎn)酸型細(xì)胞）轉(zhuǎn)移期有長菌型細(xì)胞，也有產(chǎn)酸型細(xì)胞。產(chǎn)酸速度逐漸加快谷氨酸發(fā)酵不同階段的菌體形態(tài)目前十五頁\總數(shù)六十七頁\編于十點產(chǎn)酸型細(xì)胞發(fā)酵16～20h以后細(xì)胞為含磷脂不足的異常形態(tài)，呈現(xiàn)伸長、膨大、不規(guī)則，缺乏“Ｖ”字形排列，有的呈彎曲形，邊緣顏色淺，稍模糊；有的邊緣褶皺及至殘缺不齊，但菌體形態(tài)基本清楚在發(fā)酵后期，細(xì)胞較長，多呈現(xiàn)有明顯的橫隔（1～3個或更多）的多節(jié)細(xì)胞，類似花生狀，產(chǎn)酸高谷氨酸發(fā)酵不同階段的菌體形態(tài)目前十六頁\總數(shù)六十七頁\編于十點

谷氨酸發(fā)酵感染

噬菌體后的菌體形態(tài)

在谷氨酸發(fā)酵時感染噬菌體，會使谷氨酸生產(chǎn)菌的菌體形態(tài)發(fā)生改變，但是感染噬菌體的時期不同，菌體形態(tài)變化也不一樣發(fā)酵前期感染噬菌體的菌體形態(tài)發(fā)酵中、后期感染噬菌體的菌體形態(tài)目前十七頁\總數(shù)六十七頁\編于十點發(fā)酵前期感染噬菌體的菌體形態(tài)發(fā)酵前期感染噬菌體后，菌體細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞不規(guī)則，發(fā)圓、發(fā)胖，缺乏“Ｖ”字形排列有明顯的細(xì)胞碎片，嚴(yán)重時出現(xiàn)拉絲、拉網(wǎng)，互相堆在一起，幾乎找不到完整的菌體細(xì)胞，類似蛛網(wǎng)或魚翅狀

谷氨酸發(fā)酵感染

噬菌體后的菌體形態(tài)目前十八頁\總數(shù)六十七頁\編于十點發(fā)酵中、后期感染噬菌體的菌體形態(tài)在發(fā)酵中、后期感染噬菌體后，菌體細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，邊緣不整齊，有的邊緣似乎有許多毛刺狀的東西有細(xì)胞碎片，不同于正常發(fā)酵的產(chǎn)酸細(xì)胞

谷氨酸發(fā)酵感染

噬菌體后的菌體形態(tài)目前十九頁\總數(shù)六十七頁\編于十點第三節(jié)育種過程天津短桿菌GDK-9的定向選育譜圖天津短桿菌GDK6經(jīng)原生質(zhì)體紫外誘變、紫外誘變以及DES化學(xué)誘變，依次被賦予酮基丙二酸、氟乙酸、磺胺胍、谷氨酰胺抗性（KMr+FAr+SGr+GLr）遺傳標(biāo)記，再經(jīng)分離純化獲得一株L-谷氨酸高產(chǎn)菌GDK-9，其定向選育譜系見圖目前二十頁\總數(shù)六十七頁\編于十點遺傳穩(wěn)定性試驗將目的突變株GDK-9進(jìn)行單菌落分離，連續(xù)搖瓶傳代10代，并進(jìn)行遺傳標(biāo)記驗證和搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酸試驗，結(jié)果見表傳代數(shù)246810遺傳標(biāo)記＋＋＋＋＋谷氨酸/g/L79.3479.2679.1779.2179.39目前二十一頁\總數(shù)六十七頁\編于十點第四節(jié)菌種擴(kuò)大培養(yǎng)及

種子的質(zhì)量要求溶氧濃度菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù)種子擴(kuò)大培養(yǎng)的過程影響種子質(zhì)量的主要因素目前二十二頁\總數(shù)六十七頁\編于十點菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù)菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的目的就是要為每次發(fā)酵罐的投料提供相當(dāng)數(shù)量的代謝旺盛的種子種子擴(kuò)大培養(yǎng)的任務(wù)，不但要得到純而壯的培養(yǎng)物，還要獲得活力旺盛的、接種數(shù)量足夠的培養(yǎng)物對于不同產(chǎn)品的發(fā)酵過程來說，必須根據(jù)菌種生長繁殖速度快慢決定種子擴(kuò)大培養(yǎng)的級數(shù)

目前二十三頁\總數(shù)六十七頁\編于十點種子擴(kuò)大培養(yǎng)的過程斜面菌種的培養(yǎng)菌種的斜面培養(yǎng)必須有利于菌種生長而不產(chǎn)酸，并要求斜面菌種絕對純，不得混有任何雜菌和噬菌體，培養(yǎng)條件應(yīng)有利于菌種繁殖，培養(yǎng)基以多含有機(jī)氮而不含或少含糖為原則。

目前二十四頁\總數(shù)六十七頁\編于十點一級種子培養(yǎng)一級種子培養(yǎng)的目的在于大量繁殖活力強(qiáng)的菌體，培養(yǎng)基組成應(yīng)以少含糖分，多含有機(jī)氮為主，培養(yǎng)條件從有利于長菌考慮。目前二十五頁\總數(shù)六十七頁\編于十點二級種子培養(yǎng)為了獲得發(fā)酵所需要的足夠數(shù)量的菌體，在一級種子培養(yǎng)的基礎(chǔ)上進(jìn)而擴(kuò)大到種子罐的二級種子培養(yǎng)。種子罐容積大小取決于發(fā)酵罐大小和種量比例。目前二十六頁\總數(shù)六十七頁\編于十點種子罐配料順序首先，將配料池中沖洗干凈，所用糖液盡量用新鮮糖液，依次將水（配料池的2/3體積）、葡萄糖、玉米漿、糖蜜、尿素（用液氨的不用）、磷酸氫二鈉、氯化鉀（溶液）加入配料池中，用NaOH稀溶液調(diào)pH，然后取樣分析，加消泡劑，加水定容至刻度線待打料，配料過程中，攪拌始終開啟。正確的配料順序是為了保證培養(yǎng)基的初OD值低和減少培養(yǎng)基副反應(yīng)發(fā)生。目前二十七頁\總數(shù)六十七頁\編于十點天津短桿菌T6～13的谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)培養(yǎng)基成分斜面/%搖瓶種子/%二級種子/%發(fā)酵/%蛋白質(zhì)1牛肉膏0.5NaCl0.5葡萄糖0.12.52.5(淀粉水解糖)13~15(淀粉水解糖)玉米漿0.910.6液

氨K2HPO4·3H2O0.10.1MgSO4·7H2O0.040.060.06Na2HPO4·12H2O0.15KCl0.05瓊脂2pH76.86.87目前二十八頁\總數(shù)六十七頁\編于十點各級種子的質(zhì)量要求指標(biāo)斜面種子一級種子二級種子種齡培養(yǎng)18~24h，斜面菌種一般只傳三次12h7~8hpH/6.4±0.16.8~7.2光密度/凈增OD0.5以上凈增OD0.5以上殘?zhí)?＜0.5%消耗1%左右無菌檢查無無無噬菌體檢查無無無鏡檢菌體生長均勻、粗壯、革蘭氏陽性反應(yīng)菌體生長均勻、粗壯、革蘭氏陽性反應(yīng)菌體生長均勻、粗壯、革蘭氏陽性反應(yīng)目前二十九頁\總數(shù)六十七頁\編于十點影響種子質(zhì)量的主要因素培養(yǎng)基構(gòu)成溫度pH溶解氧接種量種齡目前三十頁\總數(shù)六十七頁\編于十點培養(yǎng)基構(gòu)成種子培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分應(yīng)適合種子培養(yǎng)的需要，一般選擇一些有利于菌體生長的培養(yǎng)基，在營養(yǎng)上易于被菌體直接吸收和利用，營養(yǎng)成分要適當(dāng)?shù)刎S富和完全，氮源和維生素含量較高，碳源含量少，這樣可以使菌絲粗壯并具有較強(qiáng)的活力。如果糖分過多，菌體代謝活動旺盛，產(chǎn)生有機(jī)酸，使pH降低，菌種容易衰老。培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分要盡可能地和發(fā)酵培養(yǎng)基接近，以適合發(fā)酵的需要，這樣的種子一旦移入發(fā)酵罐后也能比較容易適應(yīng)發(fā)酵罐的培養(yǎng)條件。發(fā)酵培養(yǎng)基一般比較濃，而種子培養(yǎng)基以略稀薄為宜。目前三十一頁\總數(shù)六十七頁\編于十點溫度種子培養(yǎng)應(yīng)選擇最適溫度,幼齡菌對溫度變化敏感，應(yīng)避免溫度過高和波動過大目前三十二頁\總數(shù)六十七頁\編于十點pH種子培養(yǎng)基的pH值要比較穩(wěn)定，以適合菌的生長和發(fā)育。pH值的變化會引起各種酶活力的改變，對菌體形態(tài)和代謝途徑影響很大。種子培養(yǎng)的初始pH不宜過高，培養(yǎng)結(jié)束時pH不宜過低。目前三十三頁\總數(shù)六十七頁\編于十點溶解氧

培養(yǎng)過程中通氣攪拌的控制很重要，各級種子罐或者同級種子罐的各個不同時期的需氧量不同，應(yīng)區(qū)別控制一般前期需氧量較少，后期需氧量較多，應(yīng)適當(dāng)增大供氧量。在種子制備過程中，如果溶氧水平過高，會抑制長菌。生產(chǎn)過程中，有時種子培養(yǎng)會產(chǎn)生大量泡沫而影響正常的通氣攪拌，此時應(yīng)嚴(yán)格控制，甚至可考慮改變培養(yǎng)基配方，以減少發(fā)泡。目前三十四頁\總數(shù)六十七頁\編于十點接種量

移入的種子液體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例，稱為接種量。接種量的大小與該菌在發(fā)酵罐中生長繁殖的速度有關(guān)。目前三十五頁\總數(shù)六十七頁\編于十點生產(chǎn)上多以大接種量和豐富培養(yǎng)基作為高產(chǎn)措施。采用大接種量，種子進(jìn)入發(fā)酵罐后容易適應(yīng)，而且種子液中含有大量的水解酶，有利于對發(fā)酵培養(yǎng)基的利用。大接種量還可以縮短發(fā)酵罐中菌體繁殖至高峰所需的時間，使產(chǎn)物合成速度加快目前三十六頁\總數(shù)六十七頁\編于十點過大的接種量往往使菌體生長過快、過稠，造成營養(yǎng)基質(zhì)缺乏或溶解氧不足而不利于發(fā)酵。接種量過小，則會引起發(fā)酵前期菌體生長緩慢，使發(fā)酵周期延長，影響種子活力，導(dǎo)致發(fā)酵異常等等。目前三十七頁\總數(shù)六十七頁\編于十點種齡種子培養(yǎng)時間稱為種齡菌體在生長發(fā)育過程中，不同生長階段的菌體的生理活性差別很大，接種種齡的控制就顯得非常重要。在發(fā)酵生產(chǎn)中，種子培養(yǎng)時間不宜太長，一般都選在生命力極為旺盛的對數(shù)生長期,菌體量尚未達(dá)到最高峰時移種目前三十八頁\總數(shù)六十七頁\編于十點種齡過于短的種子接入發(fā)酵罐后，往往會出現(xiàn)前期生長緩慢、泡沫多，發(fā)酵周期延長以及因菌體量過少而引起異常發(fā)酵等等種齡過老的種子接入發(fā)酵罐后，則會因菌體老化而導(dǎo)致生產(chǎn)能力衰退目前三十九頁\總數(shù)六十七頁\編于十點Chapter2L-纈氨酸育種目前四十頁\總數(shù)六十七頁\編于十點育種標(biāo)記及其育種目的育種標(biāo)記育種目的備注Leu-切斷L-亮氨酸的支路代謝。Ile-切斷L-異亮氨酸的支路代謝。2-TAr解除L-纈氨酸對乙酰羥基酸合成酶的反饋抑制作用；2-TA是L-亮氨酸和L-纈氨酸的結(jié)構(gòu)類似物。α-ABr解除L-纈氨酸對乙酰羥基酸合成酶的反饋抑制作用。α-AB是L-纈氨酸的結(jié)構(gòu)類似物。SGr增強(qiáng)菌體必需生長因子四氫葉酸的生物合成，從而促進(jìn)氨基酸的生物合成。SG是對氨基苯甲酸的結(jié)構(gòu)類似物。目前四十一頁\總數(shù)六十七頁\編于十點出發(fā)菌株的選擇本研究以黃色短桿菌TV10為出發(fā)菌株，在進(jìn)行誘變育種試驗之前對該菌進(jìn)行形態(tài)觀察并對菌體的某些性狀進(jìn)行了鑒定。培養(yǎng)基菌株生長情況基本培養(yǎng)基生長完全培養(yǎng)基生長完全培養(yǎng)基﹢2%磺胺胍不生長補(bǔ)充培養(yǎng)基﹢2%α-AB不生長補(bǔ)充培養(yǎng)基﹢1%2-TA不生長目前四十二頁\總數(shù)六十七頁\編于十點菌體生長曲線的測定

取新鮮活化斜面菌種，接入裝有25mL完全液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，32℃，200r/min，振蕩培養(yǎng)16~18h后，取1mL菌液到另一相同的完全液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔一定時間取樣，用蒸餾水稀釋20倍后，用752分光光度計于光程1cm、波長620nm條件下測量吸光度（A620nm）。以時間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制菌體生長曲線目前四十三頁\總數(shù)六十七頁\編于十點原生質(zhì)體紫外誘變菌體前培養(yǎng)取新鮮活化斜面菌種于完全液體培養(yǎng)基中，32℃，200r/min，振蕩培養(yǎng)12h后，取1mL菌液到另一完全液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)6h，加入終濃度為0.6U/mL的青霉素，繼續(xù)培養(yǎng)3h。目前四十四頁\總數(shù)六十七頁\編于十點原生質(zhì)體形成

取上述經(jīng)青霉素預(yù)處理過的菌液5mL于離心管中，4000r/min離心10min，棄上清，用高滲液離心洗滌2次后，配成菌懸液。加入0.8g/L蛋清溶菌酶，于35℃保溫（隨時鏡檢，觀察原生質(zhì)體形成情況）16h，然后以4000r/min離心10min，棄上清，洗滌后用高滲液懸浮，制成原生質(zhì)體高滲懸浮液。目前四十五頁\總數(shù)六十七頁\編于十點原生質(zhì)體再生將上述原生質(zhì)體高滲懸浮液用高滲液適當(dāng)稀釋，取0.5mL稀釋菌液與融化后冷至45℃（水浴保溫）的半固體再生完全培養(yǎng)基4.5mL混合后，均勻傾注在已固化的再生完全培養(yǎng)基底層上，32℃培養(yǎng)48～72h。目前四十六頁\總數(shù)六十七頁\編于十點原生質(zhì)體形成率和再生率的計算

將經(jīng)青霉素處理后溶菌酶處理前的高滲菌懸液，用無菌水系列稀釋，取0.2mL菌液均勻涂布于完全培養(yǎng)基平板上，32℃恒溫培養(yǎng)。根據(jù)長出的菌落數(shù)計算原菌數(shù)(A)將獲得的原生質(zhì)體分別經(jīng)如下兩個過程處理1)用無菌水適當(dāng)稀釋，取0.2mL稀釋菌液均勻培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基平板上，32℃恒溫培養(yǎng)，在完全培養(yǎng)基平板上長出的菌落數(shù)即為未形成原生質(zhì)體的菌數(shù)(B)2)用高滲液適當(dāng)稀釋，取0.2mL稀釋菌液均勻培養(yǎng)在再生培養(yǎng)基平板上，32℃恒溫培養(yǎng)，計數(shù)，長出的菌落數(shù)為原生質(zhì)體再生的菌數(shù)和未形成原生質(zhì)體的菌數(shù)之和(C)目前四十七頁\總數(shù)六十七頁\編于十點原生質(zhì)體形成率(%)=原生質(zhì)體再生率(%)=式中A-B為原生質(zhì)體形成數(shù)，C-B為原生質(zhì)體再生數(shù)目前四十八頁\總數(shù)六十七頁\編于十點原生質(zhì)體紫外誘變

采用15W紫外燈，距離30cm，照射原生質(zhì)體高滲懸浮液0～25s，然后采用夾層法于32℃恒溫箱中培養(yǎng)48h，根據(jù)菌落計數(shù)，繪制原生質(zhì)體紫外誘變致死率曲線。目前四十九頁\總數(shù)六十七頁\編于十點DES誘變采用DES（最終體積百分濃度為1%）進(jìn)行誘變，測定不同誘變時間的殺菌率，繪制致死率曲線。具體誘變過程如圖所示目前五十頁\總數(shù)六十七頁\編于十點目的菌株的篩選方法目前五十一頁\總數(shù)六十七頁\編于十點營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選營養(yǎng)缺陷型突變株的選育，分為誘變處理、中間培養(yǎng)、淘汰野生型、缺陷型的檢出和鑒定等步驟。目前五十二頁\總數(shù)六十七頁\編于十點誘變處理根據(jù)致死率曲線，按致死率70%~80%的時間進(jìn)行誘變處理。目前五十三頁\總數(shù)六十七頁\編于十點中間培養(yǎng)取1mL處理液于裝有25mL完全液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，32℃，200r/min振蕩培養(yǎng)過夜。目前五十四頁\總數(shù)六十七頁\編于十點淘汰野生型(青霉素法)用青霉素鈉殺死處于分裂生長的野生型細(xì)胞，達(dá)到濃縮缺陷型細(xì)胞的目的。目前五十五頁\總數(shù)六十七頁\編于十點營養(yǎng)缺陷型的檢出將菌液按一定的稀釋度涂布于限制培養(yǎng)基平板上，32℃恒溫培養(yǎng)48h～72h。野生菌長成大菌落，缺陷型菌長成小菌落。挑選在完全培養(yǎng)基上長出的與“基本培養(yǎng)基上不生長，含氨基酸的補(bǔ)充培養(yǎng)基上生長”相對應(yīng)位置的菌落。將檢出的缺陷型菌株轉(zhuǎn)接于斜面，以備鑒定缺陷型。目前五十六頁\總數(shù)六十七頁\編于十點營養(yǎng)缺陷型的鑒定（Leu-或Ile-或Leu-+Ile-）①含缺陷氨基酸平板—劃線法：用于菌株數(shù)較多時的初步鑒定。用接種環(huán)取斜面菌體，依次在“MM、MM+Leu、MM+Ile、MM+Leu+Ile”四種平板的同一編號內(nèi)劃線，32℃培養(yǎng)48~72h。單缺（Leu-或Ile-）：僅在含有L-亮氨酸或L-異亮氨酸以及含有L-亮氨酸與L-異亮氨酸的基本培養(yǎng)基平板上生長；雙缺（Leu-+Ile-）：僅在MM+Leu+Ile平板上生長。10L的L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸與L-異亮氨酸混合液。32℃恒溫培養(yǎng)48h～72h；目前五十七頁\總數(shù)六十七頁\編于十點②含菌平板—濾紙片法：用于菌株數(shù)少時的準(zhǔn)確鑒定。制備含菌平板：將待檢菌株經(jīng)斜面培養(yǎng)后制成菌懸液，用無菌水離心洗滌后涂布于基本培養(yǎng)基平板；用濾紙片法驗證：每皿放置三個無菌濾紙片，用20L可調(diào)微量移液器依次往濾紙片上加入目前五十八頁\總數(shù)六十七頁\編于十點結(jié)果判定：單缺—在含有所缺氨基酸的濾紙片周圍長有菌圈；雙缺—在含L-亮氨酸濾紙片與含L-異亮氨酸濾紙片交界處長有菌帶目前五十九頁\總數(shù)六十七頁\編于十點藥物抗性突變株的選育方法

(1)藥物抗性臨界濃度的確定按藥物質(zhì)量濃度梯度制備一系列的平板，將待誘變菌株的菌懸液均勻涂布于藥物平板表面上，于32℃培養(yǎng)72h，以