蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj的學(xué)習(xí)材料

蛋白質(zhì)組學(xué)proteomicswxj的學(xué)習(xí)材料第1頁(yè)/共101頁(yè)P(yáng)roteome&Proteomics定義Proteome：1994年，由澳大利亞Macguarie大學(xué)的Wilkins等首先提出：“蛋白質(zhì)組指由一個(gè)細(xì)胞或一個(gè)組織的基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)”

“proteome”是由蛋白質(zhì)一詞的前幾個(gè)字母“prote”和基因組一詞的后幾個(gè)字母“ome”拼接而成第2頁(yè)/共101頁(yè)P(yáng)roteome&Proteomics定義Proteomics：蛋白質(zhì)組學(xué)是從整體水平細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的組成、結(jié)構(gòu)、功能及其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的科學(xué)。研究?jī)?nèi)容包括分析蛋白質(zhì)組所有組分及它們的表達(dá)水平，確定各種組分的空間定位、修飾方法、互作機(jī)制、生物活性及相應(yīng)特定功能等。由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生，細(xì)胞代謝等過(guò)程的整體而全面的認(rèn)識(shí)第3頁(yè)/共101頁(yè)Genome&Proteome第4頁(yè)/共101頁(yè)GenomicsTranscriptomics&Proteomics第5頁(yè)/共101頁(yè)P(yáng)roteomics&StructuralGenomics第6頁(yè)/共101頁(yè)P(yáng)roteomics&FunctionalGenomics第7頁(yè)/共101頁(yè)特點(diǎn)之一∶整體性第8頁(yè)/共101頁(yè)特點(diǎn)之二∶系統(tǒng)性第9頁(yè)/共101頁(yè)特點(diǎn)之三∶動(dòng)態(tài)性第10頁(yè)/共101頁(yè)StructuralProteomics結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)FunctionalProteomics功能蛋白質(zhì)組學(xué)分類第11頁(yè)/共101頁(yè)StructuralProteomicsSeparationIdentificationPTM(post-translationalmodification)IdentificationComparison&SubtractionAnalysis第12頁(yè)/共101頁(yè)FunctionalProteomicsLocalizationProteinComplexDeterminationProtein-ProteinInteraction/InteractionNetworkFunctionofProtein(MetabolicandRegulatoryPathway;SignalTransductionPathway)第13頁(yè)/共101頁(yè)

蛋白質(zhì)鑒定：可以利用一維電泳和二維電泳并結(jié)合生物質(zhì)譜、Western印跡、蛋白質(zhì)芯片等技術(shù)，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行全面的鑒定研究。翻譯后修飾的鑒定：如磷酸化、糖基化、酶原激活等過(guò)程。蛋白質(zhì)功能確定：包括蛋白質(zhì)定位研究，蛋白質(zhì)活性，蛋白質(zhì)相互作用，酶活性和確定酶底物，細(xì)胞因子的生物分析，配基-受體結(jié)合分析等。蛋白質(zhì)組學(xué)的主要任務(wù)第14頁(yè)/共101頁(yè)蛋白質(zhì)組學(xué)研究思路與方法策略、技術(shù)、工具第15頁(yè)/共101頁(yè)主要專業(yè)術(shù)語(yǔ)及其英文對(duì)照和縮寫(xiě)IPG-IEF：固相pH梯度等電聚焦（immobilizedpHgradientsisoelectricfocusing）SDS-PAGE：十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis）2-DE：雙向電泳(TwoDimensionalElectrophoresis)HPLC：高效液相色譜（HighperformanceLiquidChromatography）MALDI-TOFMS：基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MatrixAssistedLaserDesorption/IonizationTime-of-FlightMassSpectrometry)第16頁(yè)/共101頁(yè)蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)（SWISS-PROT/TrEMBL；http://www.expasy.ch）基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)（Genbank，/EMBL；http://www.ebi.ac.uk/）蛋白模式數(shù)據(jù)庫(kù)（Prosite；http://www.expasy.ch/sprot/prosite.html）蛋白質(zhì)二維凝膠電泳數(shù)據(jù)庫(kù)、蛋白三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)（PDB，/；FSSP，http://www.embl-ebi.ac.uk）蛋白翻譯后修飾數(shù)據(jù)庫(kù)（O-GLYCBASE，http://www.cbs.dtu.dk/databases/OGLYCBASE）蛋白質(zhì)組學(xué)研究相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)第17頁(yè)/共101頁(yè)研究策略兩條互補(bǔ)的實(shí)驗(yàn)流程基于凝膠的工作流程 （Gel-basedworkflow）基于液相色譜的工作流程 （LC-basedworkflow）第18頁(yè)/共101頁(yè)ClassicalGE&LCtoProteinIDGapelo(2010)JProteomicsHPLC-MS第19頁(yè)/共101頁(yè)第20頁(yè)/共101頁(yè)蛋白質(zhì)組研究的主要手段雙向電泳（twodimensionalgelelectrophoresis,2D-GE）差示電泳（differentialgelelectrophoresis,DIGE

）毛細(xì)管電泳

(capillaryelectrophoresis,CE)高效液相色譜

(highperformanceliquidchromatography,HPLC)

分子篩柱層析反向柱層析質(zhì)譜分析(massspectrometryMS)

基質(zhì)輔助激光解吸離子化-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(matrix-assistedlaserdisorptionionization-timeofflight/tandemMS,MALDI-TOF/MS/MS)

電噴霧離子化串聯(lián)質(zhì)譜（electrosprayionizationESI-MS）生物信息學(xué)第21頁(yè)/共101頁(yè)蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)室所需的條件第22頁(yè)/共101頁(yè)蛋白質(zhì)組學(xué)研究的基本技術(shù)路線蛋白質(zhì)樣品的制備雙向電泳或HPLC圖像分析凝膠中的蛋白溶液中的蛋白混合肽蛋白質(zhì)質(zhì)量N端測(cè)序肽序列質(zhì)譜數(shù)據(jù)肽指紋圖數(shù)據(jù)搜索新的或已知蛋白翻譯后修飾的鑒定酶解第23頁(yè)/共101頁(yè)SampleProteinPreparationUsuallythecomplexityoftheproteinand/orpeptidemixtureliesbeyondthetheoreticalseparationspaceofanyseparationmethod.ProteomeComplexity.

Genomictranscriptionindiversity;post-transcriptionprocessing;post-translationalmodification;constitutionofcombinatorialcomplex.Itrequiresquitealongtimeforanalysisofproteincomplex.Samplerecoverylowthroughseparation:moresteps,lessoverallrecovery.Theconc.oftheproteinswitharangeof6-ordermagnitude:intissues,proteinconcentrationsspanadynamicrangeofsixordersofmagnitudes(forregulatoryproteinorTFsafewmoleculespercell,forhousekeepingproteinsmillioncopiespercell).So,itisdifficulttodetectverylowconcentratedproteinsinthepresenceofhighlyabundantproteins.Thecomplexproteinsampleswithlimitedstabilityduetoexistenceofenzymesandproteases,enzymeinhibitorscanonlypartlystabilizethesample.第24頁(yè)/共101頁(yè)Manyparametersinfluencethecompositionofproteomebetweeninducedandinherentbiologicalvariations,suchasgeneticdifferences,genderandageofpatientsandcellgrowthconditions.Thisrequiressamplereplicates.(statisticianswoulddemandatleastfivereplicates,inmanycasesthreereplicatescandeliverhighlyconfidentresults.Inclinicalthenumberofrequiredproteinsaremuchhigh).Membraneproteinsareverydifficulttosolubilize,andeasytolossduringsamplepreparationandseparationbystickingtoasurfaceoraggregation.Post-translationalmodifications(PTMs)likephosphorylationandglycosylationrequiresophisticatedanalysistoolslikeMSn,wherethepeptideionsgeneratedseveraltimesfragmented.SampleProteinPreparation第25頁(yè)/共101頁(yè)蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)

樣品預(yù)分離樣品的制備（預(yù)處理）：組織細(xì)胞細(xì)胞器（線粒體、葉綠體、細(xì)胞核）第26頁(yè)/共101頁(yè)蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)

蛋白提取重要性：在制備時(shí)丟失的蛋白永遠(yuǎn)不能在后面實(shí)驗(yàn)中彌補(bǔ)原則：使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)防止樣品在聚焦時(shí)發(fā)生蛋白的聚集和沉淀防止在樣品制備過(guò)程中發(fā)生樣品的抽提后化學(xué)修飾（如酶性或化學(xué)性降解等）完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白第27頁(yè)/共101頁(yè)蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)

蛋白提取步驟：破碎沉淀蛋白去除雜質(zhì)第28頁(yè)/共101頁(yè)蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)

蛋白提取樣品制備流程

破碎

盡可能減少蛋白水解/其它形式蛋白降解原則機(jī)械法（超聲波法、高壓法、機(jī)械勻漿法）化學(xué)法（去污劑法、酶裂解法）物理法（液氮研磨法、反復(fù)凍融法、滲透 法、玻璃珠破碎法）第29頁(yè)/共101頁(yè)蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)

蛋白提取樣品制備流程

沉淀蛋白

去雜濃縮后蛋白可溶性是關(guān)鍵

三氯醋酸（TCA）-丙酮沉淀法

TCA沉淀法–

引起降解/修飾丙酮沉淀法硫酸銨沉淀法–

影響IEF醋酸銨沉淀法–

步驟繁瑣

第30頁(yè)/共101頁(yè)2D電泳結(jié)果影響因素分析第31頁(yè)/共101頁(yè)蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)

蛋白提取樣品制備流程

去除雜質(zhì)

關(guān)鍵是盡量不丟失蛋白和減少蛋白修飾

核酸的清除（DNase/RNase）多糖的清除（超離心、TCA沉淀等）去污劑的清除（丙酮沉淀法等）鹽離子和外源帶電小分子的清除（透析、TCA-丙酮沉淀法）第32頁(yè)/共101頁(yè)2D電泳結(jié)果影響因素分析可能原因：樣品含高豐度Pr可能原因：TCA殘留致使Pr丟失第33頁(yè)/共101頁(yè)蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)

蛋白提取樣品制備注意事項(xiàng)：蛋白質(zhì)水解

蛋白酶抑制劑(PMSF等)特殊樣品的制備(低豐度、強(qiáng)堿性蛋白質(zhì)（核糖體）、極端分子量)樣品定量重復(fù)性第34頁(yè)/共101頁(yè)TwoDimensionalGelElectrophoresis(2D-GE)DifferentialGelElectrophoresis(DIGE)GelElectrophoresis第35頁(yè)/共101頁(yè)WorkflowforTwo-DimensionalElectrophoresis(2-DE)GE(2004)2-DElectrophoresis第36頁(yè)/共101頁(yè)twodimensionalgelelectrophoresis(2D-GE)第37頁(yè)/共101頁(yè)IsoelectricFocusingElectrophoresis(IEF)IEFmainlyappliedforthefollowingpurposes:1stdimensionalfractionationofproteinmixturesinhigh-resolution2-DelectrophoresisPre-fractionationofproteinmixturesaccordingtochargeFortheseparationofveryheterogeneousmixturesoftrypticpeptidesinsteadofstrongcationexchangechromatographyinMDLC-MSIPGimmobilizedpHgradientIPGStripforIEFpH10.0Cathode(-)pH3.0Anode(+)pH10→3第38頁(yè)/共101頁(yè)IEFisperformedinapHgradientgel.ProteinsChargedwithAnion(-)orCation(+)

dependon(i)theirmoleculartraitsduetotheiracidicandbasicgroups,and(ii)theenvironmentalpH.EnvironmentalpH:inbasicbuffer,theacidicgroupsofproteinswithnegativecharge;inacidicbuffer,thebasicgroupswithpositivecharge.ProteinIsoelectricPoint(pI):AtapHvalue,thenetchargeofaproteiniszero.39IEFTheoreticalBackground

第39頁(yè)/共101頁(yè)40ThePrincipleofIsoelectricFocusingElectrophoresis第40頁(yè)/共101頁(yè)IEFPrincipleAmpholytestoCreateApHGradient:AHeterogeneousMixtureofIsomersofaliphaticoligoamino-oligocarboxylicacidsunderelectricityfieldcouldalignthemselvesduetoindividualmoleculetrait&createapHgradientalongcathodewithhigh-pHtoanodewithlow-pH.AmpholyteProperties:(i)highbufferingandsolubilityinitspI(ii)goodandregularelectricconductivityatitspI(iii)absenceofbiologicaleffect(iv)lowmolecularweightTheAmpholyte-Gel:theampholyte2%(w/v),thegel4%(T)&3%(C)ImmobilepHGradientStripforProteinsSeparation(IPG):(i)proteinsappliedtoapositionontheIPGstripcouldbechargedwithanion,cationandzero(ii)protein-cationmovesforwardcathodeandstopthesitewherethepHvalueisequaltothepIofprotein-cation;similarityforprotein-aniontomoveforwardanodeandstop;protein-zerotobenaivetomove.41第41頁(yè)/共101頁(yè)42ImmobilizedpHGradientPolyacrylamideTheGeneralStructureofImmobiline(Ampholyte)第42頁(yè)/共101頁(yè)第43頁(yè)/共101頁(yè)雙向凝膠電泳（2-DE）是等電聚焦電泳和SDS的組合即先進(jìn)行等電聚焦電泳（按照pI分離）然后再進(jìn)行SDS（按照分子大小）凝膠經(jīng)染色得到二維分布的蛋白質(zhì)圖第44頁(yè)/共101頁(yè)蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)2D-SDS：樣品制備第一向IPG-IEF電泳IPG平衡第二向SDS電泳染色（銀染）及圖譜分析目標(biāo)蛋白獲取及其鑒定（MC分析）第45頁(yè)/共101頁(yè)第46頁(yè)/共101頁(yè)2-DE第一向IPG-IEF電泳IEF是一種根據(jù)樣品的等電點(diǎn)不同而使它們?cè)趐H梯度中相互分離的一種電泳技術(shù)將等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)混合物加入有pH梯度的凝膠介質(zhì)中，在電場(chǎng)內(nèi)經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后，各組分將分別聚焦在各自等電點(diǎn)相應(yīng)的pH位置上，形成分離的蛋白質(zhì)區(qū)帶從而得知其等電點(diǎn)信息第47頁(yè)/共101頁(yè)IPG-IEF電泳第48頁(yè)/共101頁(yè)2-DE第二向垂直SDS電泳聚丙烯酰胺凝膠形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)。SDS與蛋白質(zhì)形成雪茄狀帶負(fù)電荷復(fù)合物，從而消除了蛋白間的電荷及形狀差異，電泳速度僅與分子量有關(guān)

從而得知其分子量信息第49頁(yè)/共101頁(yè)第二向垂直SDS電泳凝膠濃度與其對(duì)應(yīng)的分離范圍膠濃度分離范圍(KD)5%36-2007.5%24-200

10%14-20012.5%14-10015%14-60第50頁(yè)/共101頁(yè)第二向垂直SDS電泳EttanDalttwelve電泳系統(tǒng)第51頁(yè)/共101頁(yè)第二向垂直SDS電泳EttanDaltsix電泳系統(tǒng)第52頁(yè)/共101頁(yè)2-DE

凝膠蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的檢測(cè)染色：

1）考馬斯亮蘭染色法；

2）銀染法；

3）負(fù)染法；

4）熒光染色法；

5）放射性同位素標(biāo)記法等第53頁(yè)/共101頁(yè)安全（safety）靈敏（sensitivity）簡(jiǎn)單（simplicity）特異性（specificity）快速（speed）穩(wěn)定（stability）兼容性（synergy）理想顯色劑的7S第54頁(yè)/共101頁(yè)有機(jī)染料和銀染考馬斯亮藍(lán)染色靈敏度為30~100ng，線性范圍是20倍；硝酸銀染色的線性范圍是40倍，靈敏度是考染的100倍。膠體考馬斯亮藍(lán)染色技術(shù)可實(shí)現(xiàn)PAGE的無(wú)背景染色，其極限靈敏度為8~10ng，但這種染液會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾而影響質(zhì)譜分析的結(jié)果。氨基黑常用于轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯（PVDF）和/或硝酸纖維素膜上的蛋白質(zhì)的染色。銀染的缺點(diǎn)是：對(duì)某些種類的蛋白質(zhì)染色效果差，對(duì)其后的蛋白質(zhì)測(cè)序和質(zhì)譜分析造成影響。這兩類染色技術(shù)都可減少膠內(nèi)蛋白質(zhì)產(chǎn)量。

第55頁(yè)/共101頁(yè)CoomassieBrilliantBlue&SilverStain

第56頁(yè)/共101頁(yè)負(fù)染能專門提高PAGE膠上蛋白質(zhì)的回收率，但不能用于膜上染色。結(jié)果表現(xiàn)為膠面著色而蛋白質(zhì)點(diǎn)透明。速度快（5~15min），蛋白質(zhì)的生物活性能保持：一旦用絡(luò)合劑如EDTA或Tris/甘氨酸轉(zhuǎn)移緩沖液來(lái)絡(luò)合金屬離子就可進(jìn)行提取來(lái)轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)。它主要適用于蛋白質(zhì)顯色、完整蛋白質(zhì)的膠上被動(dòng)提取以及質(zhì)譜分析。該技術(shù)主要包括金屬鹽染料、鋅－咪唑染料等的使用。第57頁(yè)/共101頁(yè)膠體擴(kuò)散染料主要用于高靈敏度檢出電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素和PVDF膜上的蛋白質(zhì)，不用于膠內(nèi)染色。最好的膠體金染色的靈敏度與PAGE膠內(nèi)的銀染類似。這種技術(shù)主要包括麗春紅、印度墨水染料、膠體金染料等。

第58頁(yè)/共101頁(yè)有機(jī)熒光團(tuán)染料包括共價(jià)結(jié)合和非共價(jià)結(jié)合的熒光團(tuán)染料兩類。后者最為常用，其典型代表是已經(jīng)商品化的SYPRORed、Orange、Ruby等熒光染料。這三種染料可對(duì)SDS膠內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行一步染色，約30~60min完成，靈敏度為2~10ng。染色后的凝膠用標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室300nm紫外透射儀進(jìn)行照像保存，其線性范圍為3個(gè)數(shù)量級(jí)。這三種染料的電泳染色結(jié)果與在酵母中通過(guò)SAGE所獲得的基因表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)范圍相匹配。在Tris/甘氨酸轉(zhuǎn)印緩沖液中染色后，蛋白質(zhì)可被轉(zhuǎn)印至膜上并進(jìn)行免疫染色或Edman測(cè)序來(lái)鑒定蛋白質(zhì)。第59頁(yè)/共101頁(yè)熒光染色第60頁(yè)/共101頁(yè)金屬螯合染料這是一類與現(xiàn)代蛋白質(zhì)組學(xué)研究相兼容的、相對(duì)較新的蛋白質(zhì)顯色試劑，其設(shè)計(jì)專門與常用微量化學(xué)表征過(guò)程兼容。它們不包含戊二醛、甲醛或Tween-20等，很容易和集成化蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái)（包括自動(dòng)化凝膠染色儀、圖像分析工作站、機(jī)器人剪切儀器、蛋白質(zhì)酶解工作站和質(zhì)譜儀等）相結(jié)合。其中SYPRORuby也是一種基于釕的金屬發(fā)光染料。第61頁(yè)/共101頁(yè)同位素標(biāo)記，放射自顯影靈敏度~20pg第62頁(yè)/共101頁(yè)2DE重復(fù)性Thesameprotocolandsample,howevernotthesameresultsRec:similar;cir:different第63頁(yè)/共101頁(yè)DIGE&ProteinsLabeledwithCyDyesProteinslabeledwithCyDyes:

withdyescyanine(Cy2blue,Cy3red,Cy5green),thedyescannotinfluenceproteinpropertyaswellasitsmolecularweightmuch.TheMixedRunon2-DE:

themixedratioat1:1,runonthesame2-DE,thesamekindofproteinswithdifferentdyesfromdifferentsamplescanco-migrate.TheMixedGelScanned:

withlaserscannertoscanthemixedrangelatdifferentwavelengthsaccordingtoCyDyeTheResultReadout:thepositionandthecoloroftheproteinspotsonDIGEimage,thepositiontorepresenttheproteinID,thecolor,accordingtostandardcolorcalibratortoinfereachdyetheproportiontothedyemix,torepresenttherelativeamountofthesamekindofproteinamongdifferentsamples.64第64頁(yè)/共101頁(yè)650Cx30minGE(2004)2-DElectrophoresisLysineLabeling(minimallabeling)Inpractice400pmolofdyeisaddedto50ugofprotein.Inthiswayonly3-5%oftheproteinswillreceiveatag(95-97%remainunlabeled)Labelingreaction:noIPGbuffer,noreductant,pH8.5,37℃,30minwithdye,theepsilon-aminosidegroupoflysineislabeledwithdye.第65頁(yè)/共101頁(yè)66CysteineLabeling(saturationlabeling)Thehighsensitivity,downto1000humancells(around2.5ugprotein)couldprovidegood2-DELabelingreaction:noIPGbuffer;TCEPreductantpH8.0,37℃,1h;dyeaddedpH8.0,37℃30min;thethiogroupofcysteinelabeledwithdyes(Cy3orCy5).第66頁(yè)/共101頁(yè)67Workflowfor2-DEofProteinsLabeledwithCyDyes第67頁(yè)/共101頁(yè)68WorkflowforDIGEofProteinsLabeledwithCyDyesGE(2004)2-DElectrophoresis第68頁(yè)/共101頁(yè)69ProteinsLabeledwithCyDyesMixLabeledProteins2-DELaserScannerwithDifferentWavelengthsIndividual&OverlapImageAnalysis(ProteinSpotLocation&Color)IdentificationofProteinID&Abundance1stIEF(pI)2ndSDS(Mw)第69頁(yè)/共101頁(yè)ExampleforDIGEImagesScannedwithDifferenceWavelength

ProteomicsinPracticep6970第70頁(yè)/共101頁(yè)2-DE

凝膠蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的檢測(cè)圖像掃描和分析——ImageScannerII第71頁(yè)/共101頁(yè)2-DE

凝膠蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的檢測(cè)全自動(dòng)斑點(diǎn)切取系統(tǒng)（EttanSpotPicker）

第72頁(yè)/共101頁(yè)質(zhì)譜分析(MS)質(zhì)譜原理：樣本分子離子化后,根據(jù)不同離子間質(zhì)荷比(m/e)差異,分離樣本,確定分子量2-DE

凝膠蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的檢測(cè)第73頁(yè)/共101頁(yè)P(yáng)rincipleforMassSpectrometry74SchematicofQuadrupoleTOFHybridAnalyzerWestermeier(2008)ProteomicsinPractice第74頁(yè)/共101頁(yè)電噴霧質(zhì)譜第75頁(yè)/共101頁(yè)樣品溶于固定的底物中形成晶體，用激光脈沖使其離子化，離子被加速后通過(guò)飛行管時(shí)分離，所有離子均可被檢測(cè)，常用來(lái)測(cè)蛋白質(zhì)、多肽、核酸和多糖等生物大分子MALDI-TOFMS第76頁(yè)/共101頁(yè)通過(guò)質(zhì)譜分析，可以獲得分析樣品的分子量、分子式、分子中同位素構(gòu)成和分子結(jié)構(gòu)等多方面的信息SARS病毒N蛋白整體分子量第77頁(yè)/共101頁(yè)蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)酶解成肽段后，獲得所有肽段的分子質(zhì)量，形成一個(gè)特異的肽質(zhì)量指紋圖譜（peptidemassfingerprinting，PMF），通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索與比對(duì)，便可確定待分析蛋白質(zhì)分子的性質(zhì)。PeptideMassFingerprinting(PMF)第78頁(yè)/共101頁(yè)P(yáng)eptideMassFingerprinting(PMF)第79頁(yè)/共101頁(yè)P(yáng)eptideMassFingerprinting(PMF)第80頁(yè)/共101頁(yè)用PMF方法未能鑒定的蛋白質(zhì)可通過(guò)質(zhì)譜技術(shù)獲得該蛋白質(zhì)一段或數(shù)段多肽的串連質(zhì)譜信息（氨基酸序列）并通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索來(lái)鑒定該蛋白質(zhì)。混合蛋白質(zhì)酶解后的多肽混合物直接通過(guò)（多維）液相色譜分離，然后進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行分析。用串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）鑒定蛋白質(zhì)第81頁(yè)/共101頁(yè)用串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）鑒定蛋白質(zhì)第82頁(yè)/共101頁(yè)多肽氨基酸序列分析串聯(lián)質(zhì)譜（Tandem-MS）,第一級(jí)質(zhì)譜得到肽的分子離子,選取目標(biāo)肽的離子作為母離子，與惰性氣體碰撞，使肽鏈中的肽鍵斷裂，形成一系列離子，即N端碎片離子系列（B系列）和C端碎片離子系列（Y系列），將這些碎片離子系列綜合分析，可得出肽段的氨基酸序列。“proteinladdersequencing”的方法，通過(guò)對(duì)Edman降解法的修改，產(chǎn)生一系列截去N端殘基的肽段，用MALDI-MS測(cè)得這些肽段的質(zhì)量，從而推測(cè)N端序列。

第83頁(yè)/共101頁(yè)84Theprotonatedtotalpeptidemassis1410.6.ThepeptidetobeionizedintoN-terminalions(b-ions)andC-terminalions(y-ions).Thealignmentoftheseionsofthepeptidefromsmalltolargeaccordingtotheirm/z,auniquemassspectrumforthepeptide.Thesignalintensity(theheight)ofeachionrepresentstheabundanceofthefragmentioninsystem.Contrastofb-ionstoy-ionscouldinferthepeptidesequence.多肽氨基酸序列分析第84頁(yè)/共101頁(yè)多肽氨基酸序列分析第85頁(yè)/共101頁(yè)IsotopeLabelingProteinSamplesviaMetabolism

Campbell(2002)Discoveringp189

86DifferentIsotopestolabeldifferentsamplesviametabolism.Combinethesamplesataratioofonetoonefromdiffsourcesandtosubjecttoseparation,anddigestion.AnalysisbyMStoproducecharacteristicmassspectrum(1)ateverym/zpoint,twopeaksalwaysoccurredincouple,representingthesamemoleculewithdiffmassisotopes:thefrontwithlightisotopeandthefollowingwithheavyone.(2)ateverym/zpoint,theratiooftwopeakstorepresentthesamemoleculerelativeabundancefromdiffsources.第86頁(yè)/共101頁(yè)IsotopeTagICATforLabelingofProteinSamplesinvitro

87ICATconsistsofthreeparts(i)biotinaffinitytag,bindreversiblytoavidin(ii)alinker,contain8stableisotopes(iii)thiolgroup,bindtocysteineofproteinInICATmolecule,ifXgroupspresentwithH(=1),theICATisthelightisotopetag.IfXgroupspresentwithD(deuterium=2),theICATistheheavyisotopetag.ThemassdifferencebetweenHandDinICATcouldbediscriminatedbyMS.第87頁(yè)/共101頁(yè)88WorkflowofProteinTaggedwithICATforLC-MSCampbell(2002)Disc