基因工程在轉(zhuǎn)基因動物領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀及展望

生命科學(xué)院分子生物學(xué)期末綜述題目：基因工程在轉(zhuǎn)基因動物領(lǐng)域的應(yīng)用現(xiàn)狀及展望班級：09動物科學(xué)姓名：曾雪婷學(xué)號：2009084548【摘要】本文闡述了基因工程和轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究的原理、基本路線，介紹了轉(zhuǎn)

基因技術(shù)和生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的方法，總結(jié)轉(zhuǎn)基因技術(shù)在哺乳動物領(lǐng)域的應(yīng)用，提出了轉(zhuǎn)基因動物面臨的問題，并對轉(zhuǎn)基因技術(shù)及轉(zhuǎn)基因動物的前景進行了展望。【關(guān)鍵詞】基因工程；原理；轉(zhuǎn)基因動物；應(yīng)用；展望基因工程是改變生物的遺傳組成，增加生物的遺傳多樣性，賦予轉(zhuǎn)基因生物新的表型特征，使其能夠更好地服務(wù)于人類社會的一項工程技術(shù)?；蚬こ淘谵D(zhuǎn)基因動物領(lǐng)域的應(yīng)用具有巨大的發(fā)展?jié)摿?，促進了轉(zhuǎn)基因方法的不斷發(fā)展和轉(zhuǎn)基因動物應(yīng)用領(lǐng)域的迅速擴大?；蚬こ膛c動物基因工程的原理基因工程又名遺傳工程(geneticengineering)、一主要包括DNA重組技術(shù)、分子克隆或基因克隆等技術(shù)，它是指在分子水平上提取(或合成)不同生物的遺傳物質(zhì)，在體外切割，再和一定的載體拼接重組，然后把重組的DNA分子引入細胞或生物體內(nèi)，使這種外源DNA(基因)在受體細胞質(zhì)中進行了復(fù)制與表達，按人們的需要繁殖擴增基因或生產(chǎn)不同的產(chǎn)物或定向創(chuàng)造生物的新性狀，并能穩(wěn)定遺傳給后代［1］?；蚬こ痰暮诵膬?nèi)容包括基因克隆和表達。動物基因工程就是利用基因工程技術(shù)來人為地改造動物遺傳特性的技術(shù)體系。它的具體應(yīng)用就是生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物(transgenicanimal)，即用基因工程的方法獲得目的基因并導(dǎo)入到動物的受精卵中，使外源基因與動物本身的基因組DNA整合到一起，并隨細胞的分裂而增殖，從而在動物體內(nèi)得到表達，產(chǎn)生具有特定性狀的個體。這種在基因組中穩(wěn)定有效地整合有人工導(dǎo)入外源基因的動物稱轉(zhuǎn)基因動物。應(yīng)用實驗胚胎學(xué)和分子生物學(xué)原理，將來自一種生物的特定基因?qū)肆硪粍游锏氖芫鸦蛟缙谂咛ゼ毎?，并整合到宿主染色體中，在動物發(fā)育過程中表達，并能通過生殖細胞傳遞給后代。其基本程序為：目的基因的制備一一目的基因的導(dǎo)入一染外源基因供體的培養(yǎng)——篩選外源基因的供體檢驗——受體細胞的準備——轉(zhuǎn)基因重組胚的構(gòu)建——轉(zhuǎn)基因重組胚的培養(yǎng)——轉(zhuǎn)基因重組胚胎的移植——產(chǎn)下轉(zhuǎn)基因動物——轉(zhuǎn)基因動物鑒定——生殖細胞傳遞給后代。轉(zhuǎn)基因動物的出現(xiàn)弓I起了世人的矚目。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域2.1轉(zhuǎn)基因技術(shù)在哺乳動物遺傳育種領(lǐng)域的應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)完全可以按照人類的主觀愿望設(shè)計目的基因及其表達產(chǎn)物，通過定向精心培育，使物種符合人類經(jīng)濟目的的變異，能加快其積累和保存的步伐。在畜牧業(yè)生產(chǎn)上，主要是用于遺傳改良，加速動物育種，研究真核生物基因表達調(diào)控機理。當出現(xiàn)符合我們預(yù)想結(jié)果的轉(zhuǎn)基因動物時，再利用優(yōu)良動物品種的體細胞作核供體克隆動物，用于大量生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以很快地在實驗室創(chuàng)造出新物種。在動物雜種優(yōu)勢利用方面，可增強選育的種畜性狀穩(wěn)定，提高育種效率，大大縮短育種年限，加速動物育種的進程。另外，對于家畜可以做基因工程改造，將結(jié)合特異抗原抗體基因轉(zhuǎn)入動物體內(nèi)，制造出對細菌、病毒及寄生蟲等疾病具有遺傳免疫特性的轉(zhuǎn)基因抗性動物。2.2轉(zhuǎn)基因技術(shù)在生物制藥領(lǐng)域的應(yīng)用目前，轉(zhuǎn)基因動物的乳腺可以用作生產(chǎn)醫(yī)用蛋白，提高轉(zhuǎn)入基因（如K-酪蛋白基因）以及一些激素（如生長激素）及酶（如轉(zhuǎn)乳糖酶基因）的基因表達的經(jīng)濟有效的生物反應(yīng)器，即通過乳腺生物反應(yīng)器可得到治療一些疑難病癥的藥物。把一些目的基因（即能夠產(chǎn)生治療某種疾病特效物質(zhì)的基因）注射到一個奶牛受精卵的原核里，通過基因整合、胚胎發(fā)育，再將其移人母體子宮中繼續(xù)發(fā)育成后代，在雌性性成熟后的乳汁中提取有用的藥物。這種方法整合率低乳腺里的表達量很低，得不到理想的藥物?，F(xiàn)在可利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)結(jié)合克隆技術(shù)來生產(chǎn)乳腺生物反應(yīng)器。首先把目的基因整合到體細胞、成纖維細胞或胚胎干細胞中培養(yǎng)，再篩選出高表達量的細胞進行克隆，其后代動物乳腺里就有高表達量的蛋白質(zhì)。即動物成為“制藥廠”。2003年，Brophy等[2]通過轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)使牛奶中B-伊酪蛋白的含量提高了8%~20%,k-酪蛋白的含量提高了兩倍。由此表明，通過轉(zhuǎn)基因的方法利用乳腺生物反應(yīng)器來生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因生物制劑具有極大的開發(fā)潛力。2.3轉(zhuǎn)基因技術(shù)在建立動物模型和器官移植等醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用轉(zhuǎn)基因鼠是人類疾病的動物模型，它可以幫助人們深入了解復(fù)雜疾病的病因和發(fā)展過程?？茖W(xué)家們已經(jīng)建立了包括老年性癡呆癥、關(guān)節(jié)炎、肌肉營養(yǎng)缺乏癥、腫瘤發(fā)生、高血壓、神經(jīng)衰變癥、內(nèi)分泌功能障礙、動脈硬化癥等疾病鼠模型［3］。在器官移植方面，研究者成功敲除a-1,3-半乳糖苷酶基因的豬，這為人類異體器官移植的設(shè)想帶來了曙光。轉(zhuǎn)基因動物3.1轉(zhuǎn)基因動物的研究方法利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育新品種既可以加快家畜品種的改良速度提高肉，奶、蛋的產(chǎn)量和品質(zhì)，又可以生產(chǎn)珍貴的藥用蛋白。常用的制備轉(zhuǎn)基因動物的方法主要有：原核期胚胎的顯微注射法(genmicroiniectioninpronucleus’embryo);逆轉(zhuǎn)錄病毒感染技術(shù)(retrovirus-mediatedgenetransfer);精子載體法(sperm-mediatedgenetransfer);生殖細胞轉(zhuǎn)染法(germcell—mediatedgenetransfer);胚胎干細胞(ES)技術(shù)及原始生殖細胞(PGCs)技術(shù)(embryostemcell/primordialgermcells一mediatedgenetransfer);受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(recipient—mediatedgenetransfer)等。DNA顯微注射法、胚胎干細胞介導(dǎo)法和轉(zhuǎn)基因體細胞克隆技術(shù)足目前轉(zhuǎn)基因動物研究中常用的方法［4］。隨著研究的深入，動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)已從簡單的顯微注射法向高效率的轉(zhuǎn)基因體細胞核移植方向發(fā)展，從外源基因隨機插入(或整合)到定點整合的轉(zhuǎn)變，從傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因到條件控制的轉(zhuǎn)變。3.2轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的技術(shù)方法轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)始于20世紀80年代，隨著研究的深入，轉(zhuǎn)基因動物的制作技術(shù)得到了突破性進展?，F(xiàn)已建立了許多融合有外源基因的轉(zhuǎn)基因小鼠和大鼠，轉(zhuǎn)基因兔、豬、羊、牛等已誕生5］。目前常用DNA顯微注射法、胚胎干細胞介導(dǎo)法和轉(zhuǎn)基因體細胞克隆技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物。3.2.1DNA顯微注射法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物1990年12月，美國GenpharmInternational公司用酪蛋白啟動子與人乳鐵蛋白(humanLactoferrin，hLF)的cDNA構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因載體，通過顯微注射法獲得了世界上第一頭名為Herman的轉(zhuǎn)基因公牛。該公牛與非轉(zhuǎn)基因母牛生產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因后代，1/4后代母牛乳汁中表達了人乳鐵蛋白含量達1000ug/mLo2002年，Berkel等利用牛asl-酪蛋白啟動子與人乳鐵蛋白基因組6.2kb片段構(gòu)建轉(zhuǎn)基因載體,通過顯微注射獲得了轉(zhuǎn)基因牛。ELISA(Enzyme-LinkedlmmunosorbentAssay)結(jié)果分析表明，轉(zhuǎn)基因牛奶中人乳鐵蛋白的含量為300~2800ug/mLo這一研究結(jié)果表明，可以用轉(zhuǎn)基因牛生產(chǎn)人乳鐵蛋白。3.2.2胚胎干細胞介導(dǎo)法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物利用胚胎干細胞可以在體外培養(yǎng)和便于基因操作的優(yōu)點用自體細胞核內(nèi)的遺傳物質(zhì)生產(chǎn)完全相同的胚胎干細胞用特定的物質(zhì)進行處理和誘導(dǎo)，得到所需要的各種組織細胞，再送回人體便能夠修補和更新因疾病或老化而受損的器官組織。此構(gòu)想已經(jīng)初步在小鼠以及大型哺乳類上試驗成功。將轉(zhuǎn)基因技術(shù)與干細胞技術(shù)結(jié)合產(chǎn)生的胚胎干細胞，結(jié)合基因敲除(geneknock-out)和基因?qū)?geneknock-in)等手段，進行基因定點整合實驗，創(chuàng)建動物疾病實驗醫(yī)學(xué)模型和治療遺傳疾病及作為醫(yī)用器官移植的供體等方面，有望成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域新穎的治療途徑。人的異種器官移植的主要問題在于克服致命的超急性排斥反應(yīng)。排斥反應(yīng)是由人體內(nèi)抗體通過結(jié)合到豬血管內(nèi)的半乳糖而引發(fā)，會導(dǎo)致植入器官在被移植后幾分鐘到幾小時內(nèi)被破壞掉。因而防止排斥的最直接方法是將供體動物的a-1，3-半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因敲除掉。但真正將豬器官臨床應(yīng)用到人體內(nèi)前，還須考慮豬內(nèi)源性病毒傳播給人類的潛在危險，基因打靶是目前解決此問題的有效探索。3.2.3轉(zhuǎn)基因體細胞克隆技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)踴動物PPL公司在Dolly綿羊誕生的同年，由Schnieke等共同合作得到了用于治療血友病的第一批攜帶外源基因——人凝血因子(IX):HumanFactorIX基因的克隆綿羊，凝血因子IX可在乳中的表達量達到125ug/mL。Cibelli等用標記物p-gal/neo對雄性牛胎兒的成纖維細胞進行轉(zhuǎn)染，再經(jīng)新霉素篩選所得到抗性細胞克隆獲得都在同一個染色體位點整合了外源基因P-半乳糖苷酶的4頭小牛。Baguisi等克隆得到高效表達人抗凝血因子B的轉(zhuǎn)基因山羊。McGreath等獲得第一只定點整合外源基因的轉(zhuǎn)基因克隆綿羊；Lai等用G2/M期細胞做核供體得到表達綠色熒光蛋白的小豬；同年Lai等成功得到敲除a-1,3-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶基因的克隆豬。目前國內(nèi)已經(jīng)有許多課題組掌握了體細胞克隆技術(shù)和轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)，成勇等［6似轉(zhuǎn)基因山羊體細胞為供體細胞克隆出轉(zhuǎn)基因山羊。龔國春等［7］獲得了第一頭轉(zhuǎn)基因克隆牛。石德順研究員領(lǐng)導(dǎo)的課題組正在進行轉(zhuǎn)基因克隆水牛的研究，已經(jīng)建立了基因打靶的技術(shù)平臺，獲得了轉(zhuǎn)人a-乳清蛋白、TPO基因的克隆水牛胚胎；中國農(nóng)業(yè)大學(xué)李寧教授獲得一批轉(zhuǎn)有人體基因的轉(zhuǎn)基因克隆奶牛，轉(zhuǎn)基因克隆胚胎的移植受體牛妊娠率達到33.3%（國際水平30.7%）;轉(zhuǎn)基因克隆胚的移植受體牛產(chǎn)犢率達到37.5%（國際水平11.5%）,因此，我國轉(zhuǎn)基因體細胞克隆牛生產(chǎn)的總體效率達到了10%,轉(zhuǎn)基因體細胞克隆牛技術(shù)達到國際前沿水平。我國是繼美國之后第二個擁有高效轉(zhuǎn)基因克隆牛技術(shù)的國家，這促使我國轉(zhuǎn)基因動物新品種培育效率大幅提高。轉(zhuǎn)基因技術(shù)目前出現(xiàn)的問題及分析盡管轉(zhuǎn)基因動物研究和應(yīng)用取得了重大進展，同時也面臨著不少的問題和困難。目前出生的轉(zhuǎn)基因動物定點整合效率低，外源基因表達不穩(wěn)定，成本昂貴；對家畜染色體上控制眾多經(jīng)濟性狀的基因位置知道不多，動物的生產(chǎn)性狀的基因由多基因控制，難以實現(xiàn)同時對大批基因的轉(zhuǎn)移；控制各種主要性狀的基因在宿主表達（受體）組織內(nèi)特異性表達的調(diào)控因子和啟動因子尚未完全發(fā)現(xiàn);其食品及產(chǎn)品的安全性問題也引起了世人關(guān)注。2007年，Yang等首次對克隆牛與非克隆牛的生物化學(xué)組分進行了分析，表明兩者在生物安全評價指標上沒有大的差異。同年，Laible等在分析了轉(zhuǎn)基因和克隆奶牛的奶樣和奶酪的化學(xué)成分后得出結(jié)論，克隆牛與傳統(tǒng)育種獲得的牛奶各項指標含量基本一致和類似，轉(zhuǎn)有酪蛋白基因的奶牛初乳與正常奶牛的IgG含量和動態(tài)變化趨勢類似。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)進一步深入研究和推廣應(yīng)用，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在動物應(yīng)用方面存在的一些問題會逐漸被攻克，技術(shù)會更加日趨成熟完善。轉(zhuǎn)基因動物被更多的人們認可和接受，其應(yīng)用也將更加廣泛。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展前景基因工程技術(shù)以其巨大的生命力影響著人類的生活，并已逐步滲透到人類生活的各個領(lǐng)域。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域的不斷拓展，在實驗室獲得的新突破和技術(shù)成果不斷地運用到生產(chǎn)實踐中去，創(chuàng)造出更多具有優(yōu)良經(jīng)濟性狀的不同種類的轉(zhuǎn)基因動物，使地球的生物圈變得更加豐富多彩。轉(zhuǎn)基因技術(shù)的出現(xiàn)與發(fā)展為研究動物改良、抗病育種方面，探明人類疾病發(fā)病機理研究以及建立人類遺傳疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型，建立動物生物反應(yīng)器來生產(chǎn)天然活性藥物蛋白和基因治療以及生產(chǎn)人類器官代用品等方面極具有開發(fā)潛力，轉(zhuǎn)基因技術(shù)的成熟和推廣將給人類帶來無限光明。參考文獻：李立家.肖庚富.基因工程[M].北京：科學(xué)出版社，2004:1.BROPHYB,SMOLENSKIG,WHEELERT-etal.Clonedtransgeniecattleproducemilkwithhigherlevelsofbeta-caseinandkappa-casein[J].NatBioteehnOl.2003.21(2