電子科大細胞生物學第三章細胞生物學研究方法

第三章細胞生物學研究方法目前一頁\總數(shù)七十六頁\編于十點概要了解細胞生物學常用研究方法，包括細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察方法、細胞組分分析方法、細胞培養(yǎng)方法、細胞工程與顯微操作技術(shù)等。本章學習要求目前二頁\總數(shù)七十六頁\編于十點細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察方法細胞組分分析方法細胞培養(yǎng)、細胞工程與顯微操作技術(shù)本章主要教學內(nèi)容目前三頁\總數(shù)七十六頁\編于十點第一節(jié)細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法一、光學顯微鏡技術(shù)（lightmicroscopy)

肉眼的分辨率：0.2mm；光鏡分辨率：0.2um；

EM分辨率可達到0.2nm1m=103mm=106um=109nm目前四頁\總數(shù)七十六頁\編于十點目前五頁\總數(shù)七十六頁\編于十點目前六頁\總數(shù)七十六頁\編于十點2、熒光顯微鏡技術(shù)原理與應用

直接熒光標記技術(shù)

間接免疫熒光標記技術(shù)

應用：在光鏡水平用于特異蛋白質(zhì)等生物大分子的定性定位。（FluorescenceMicroscopy）目前七頁\總數(shù)七十六頁\編于十點如:將標記熒光素的純化肌動蛋白顯微注射入培養(yǎng)細胞中，可以看到肌動蛋白分子組裝成肌動蛋白纖維。將可產(chǎn)生熒光的綠色熒光蛋白（GreenFluorescentProtein，GFP）基因與某種蛋白基因融合，在表達這種融合蛋白的細胞中，便可直接觀察到該蛋白的動態(tài)變化。

目前八頁\總數(shù)七十六頁\編于十點（LaserScanningConfocalMicroscopy）物鏡和聚光鏡同時聚焦到同一小點，彼此互相共聚焦。激光束（光源）經(jīng)雙色鏡反射后，通過物鏡匯聚到樣品某一焦點。從焦點發(fā)射的熒光（樣3、激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)原理品一般經(jīng)免疫熒光標記）經(jīng)透鏡匯聚成像，被檢測器檢出。通過樣品其他部位的激光即激光發(fā)出的熒光不會聚焦成像，因而檢測器不能檢出。目前九頁\總數(shù)七十六頁\編于十點排除焦平面以外光的干擾，增強圖像反差和提高分辨率(1.4—1.7倍)，可重構(gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu)。應用：目前十頁\總數(shù)七十六頁\編于十點4、熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)（fluorescenceresonanceenerrgytransfer,FRET）用于檢測活細胞中兩個蛋白質(zhì)分子之間的直接相互作用。供體發(fā)射的熒光與受體發(fā)色團分子的吸收光譜重疊，且兩個探針距離在10nm范圍以內(nèi)時，會發(fā)生一種非放射性的能量轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生FRET現(xiàn)象。目前十一頁\總數(shù)七十六頁\編于十點目前十二頁\總數(shù)七十六頁\編于十點可選擇供體蛋白CFP和受體蛋白YFP分別與兩種目的蛋白融合表達。當這兩個融合蛋白之間的距離在5-10nm的范圍內(nèi)，供體CFP發(fā)出的熒光可被YFP所吸收，并激發(fā)YFP發(fā)出黃色熒光。此時可通過測量CFP熒光強度的損失量來確定這兩個蛋白是否相互作用。兩個蛋白距離越近，CFP所發(fā)出的熒光被YFP接收的量就越多，檢測器所接收到的熒光越少。反之，不會產(chǎn)生FRET效應。目前十三頁\總數(shù)七十六頁\編于十點5、熒光漂白恢復技術(shù)（fluorescencerecoveryafterphotobleaching,FRAP）該技術(shù)起源于20世紀70年代。使用與蛋白質(zhì)或脂質(zhì)耦聯(lián)的親脂性或親水性的熒光分子，如熒光素、綠色熒光蛋白等，檢測活體細胞表面或細胞內(nèi)部的分子運動以及在各種結(jié)構(gòu)上分子動態(tài)變化率的大小。目前十四頁\總數(shù)七十六頁\編于十點高能量激光束照射使特定區(qū)域，該區(qū)域熒光會發(fā)生不可逆淬滅。光漂白區(qū)熒光的恢復可通過非漂白區(qū)的熒光標記分子在膜上或胞質(zhì)中運動至光漂白區(qū)來完成。原理：目前十五頁\總數(shù)七十六頁\編于十點目前十六頁\總數(shù)七十六頁\編于十點

是研究膜蛋白或膜脂流動性的基本實驗技術(shù)之一。

熒光素標記膜蛋白或膜脂，然后用激光束照射細胞表面某一區(qū)域，使被照射區(qū)的熒光淬滅變暗。由于膜的流動性，淬滅區(qū)域的亮度逐漸增加，最后恢復到與周圍的熒光強度相等。根據(jù)熒光恢復的速度可推算出膜蛋白或膜脂擴散速度。目前十七頁\總數(shù)七十六頁\編于十點抗鼠細胞膜蛋白的熒光抗體（顯綠色熒光）和抗人紅細胞蛋白的熒光抗體（顯紅色熒光）分別標記小鼠和人的細胞表面，然后用滅活的仙臺病毒處理使兩種細胞融合。10min后不同顏色的熒光在融合細胞表面開始擴散，40min后已分辨不出融合細胞表面綠色熒光或紅色熒光區(qū)域。證明膜蛋白的流動性目前十八頁\總數(shù)七十六頁\編于十點二、電子顯微鏡技術(shù)透射電鏡（TEM）1)超薄切片技術(shù)2)負染色技術(shù)3)冰凍蝕刻技術(shù)4)真空噴鍍技術(shù)5)電鏡三維重構(gòu)技術(shù)掃描電鏡（Scanningelectronmicroscope，SEM）透射電鏡的基本構(gòu)造透射電鏡主要制樣技術(shù)目前十九頁\總數(shù)七十六頁\編于十點（1）透射電鏡基本構(gòu)造1、透射電鏡（TEM）目前二十頁\總數(shù)七十六頁\編于十點

顯微鏡分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像原理LM200nm可見光玻璃透鏡不要求真空利用樣品對光的吸收形成明暗反差和顏色變化100nm紫外光玻璃透鏡不要求真空TEM0.1nm電子束電磁透鏡要求真空（1.33x10-5～1.33x10-3Pa）利用樣品對電子的散射和透射形成明暗反差（2）電鏡與光鏡的比較目前二十一頁\總數(shù)七十六頁\編于十點電子束穿透力很弱，很難通過細胞、組織切片，樣品須先制備超薄切片。超薄切片厚度：40～50nm制備程序：取材固定脫水浸透包埋切片染色觀察（3）透射電鏡主要制樣技術(shù)1）超薄切片技術(shù)用于透射電鏡（TEM）觀察樣本內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)。目前二十二頁\總數(shù)七十六頁\編于十點目前二十三頁\總數(shù)七十六頁\編于十點戊二醛：是一種化學交聯(lián)劑，滲透速率較四氧化鋨快，能固定蛋白和糖類（特別是糖原）。一般用戊二醛進行前固定。但對大多數(shù)脂類的固定作用不強，樣品僅用戊二醛固定后，其反差不好，最好再用四氧化鋨進行后固定。常用的固定劑：醛類固定劑、四氧化鋨等單一固定劑不能固定細胞內(nèi)所有組分，常需聯(lián)合使用不同固定劑。常采用戊二醛和四氧化鋨雙重固定。四氧化鋨：是一種重金屬化合物，能與不飽和脂肪酸反應，是膜結(jié)構(gòu)最佳固定劑。四氧化鋨在隨后的脫水過程中可被還原形成鋨黑，使樣品反差增強。但四氧化鋨滲透緩慢，對酶活性和抗原活性破壞較大。取材與固定目前二十四頁\總數(shù)七十六頁\編于十點固定好的樣品一般要經(jīng)過濃度遞增的乙醇或丙酮進行脫水。脫水后將樣品包埋在樹脂中，使之獲得一定的硬度、彈性和韌度，這樣才易于切成超薄切片，并使切片能承受電子束轟擊。環(huán)氧樹脂：國產(chǎn)618環(huán)氧樹脂、Epon812等脫水包埋常用的包埋劑為環(huán)氧樹脂和丙烯酸樹脂等丙烯酸樹脂：有LRWhite、LRGold、Lowi-crvls等目前二十五頁\總數(shù)七十六頁\編于十點超薄切片一般收集在金屬載網(wǎng)上進行觀察。常用銅網(wǎng)為200～400目，此外根據(jù)不同的實驗要求還可選用金網(wǎng)、鎳網(wǎng)等。載網(wǎng)上一般包被一層支持膜，以支撐載網(wǎng)上的超薄切片，增加其穩(wěn)定性。最常用的支持膜是Formvar(聚乙烯甲醛)、火棉膠、碳等。包埋好的組織塊需在超薄切片機上用玻璃刀或鉆石刀切成超薄切片。切片目前二十六頁\總數(shù)七十六頁\編于十點生物樣品多數(shù)是由碳、氫、氧、氮等元素組成的，這些元素的原子序數(shù)低，散射電子的能力不強，在電鏡下的反差非常弱，因此通常需用高分子量的金屬鹽來對超薄切片進行染色，由于細胞的不同結(jié)構(gòu)對金屬鹽的親和力不同，因此染色后不同結(jié)構(gòu)對電子的散射能力亦不同，從而增強了細胞結(jié)構(gòu)的反差。常用染色液:醋酸雙氧鈾和鉛染液電鏡觀察染色與觀察目前二十七頁\總數(shù)七十六頁\編于十點大鼠骨髓干細胞的超薄切片（引自G.M.Wrightetal）

目前二十八頁\總數(shù)七十六頁\編于十點染色背景，襯托出樣品的精細結(jié)構(gòu)。Examplesofnegtivelystainedandmetal-shadowedspecimens.Electronmicrographsofatobaccorattlevirusafternegtivestainingwithpotassiumphosphotungstate(a)orshadowcastingwithchromium(b).2）負染色技術(shù)常用染色劑：2％磷鎢酸水溶液（Negativestaining）目前二十九頁\總數(shù)七十六頁\編于十點家蠶細小病毒負染色電鏡照片(病毒直徑20nm)（陳立華、翟中和）

目前三十頁\總數(shù)七十六頁\編于十點制備過程簡單，只需將樣品制成懸液，直接滴于載網(wǎng)上，然后用重金屬物質(zhì)染液染色。即可在EM下觀察。重金屬物質(zhì)散射電子的能力較樣品本身強，電鏡下兩者顯示出明顯的明暗對比，樣品呈亮色，而其周圍的背景將呈暗色，這樣樣品表面的微細結(jié)構(gòu)就被襯托出來。常用染色劑：2％磷鎢酸水溶液目前三十一頁\總數(shù)七十六頁\編于十點真空噴鍍一般在噴鍍儀中進行，將鉑、鉻、金等重金屬在高真空條件下加熱，使其蒸發(fā)，蒸發(fā)出來的金屬粒子以一定的角度斜向噴鍍于樣品表面，這樣凸出的樣品表面將比周圍背景優(yōu)先包被一層金屬薄膜，二者之間的反差加大，樣品輪廓清晰地顯示出來。單方向噴鍍，樣品向著金屬發(fā)射源一面沉積金屬粒子較多，而背側(cè)面較少，形成投影。增強樣品反差，樣品富立體感。旋轉(zhuǎn)噴鍍，可使樣品表面的金屬薄膜均勻一致。3）真空噴鍍技術(shù)目前三十二頁\總數(shù)七十六頁\編于十點a）快速冷凍b）低溫斷裂c）蝕刻d）復型主要用來觀察膜斷裂面的蛋白質(zhì)顆粒和膜表面結(jié)構(gòu)。4）冰凍蝕刻技術(shù)（Freezeetching）目前三十三頁\總數(shù)七十六頁\編于十點樣品在低溫下迅速冷凍（液氮或液氦中）和低溫下，結(jié)構(gòu)“脆弱”部位（膜脂雙分子層疏水端）斷裂，顯示出膜脂中的蛋白質(zhì)顆粒，真空中冰升華，進一步增強“浮雕”式蝕刻效果，鉑金噴鍍形成凹凸電子反差，真空噴鍍碳膜，樣品再經(jīng)消化液消化，收集復型膜在電鏡下觀察。目前三十四頁\總數(shù)七十六頁\編于十點2、掃描電鏡（SEM）CO2臨界點干燥法防止主要觀察樣品表面的形貌特征。應用原理溫度以上使CO2以氣態(tài)形式逸去。

引起樣品變形的表面張力問題。常用液態(tài)CO2浸透樣品，然后在臨界目前三十五頁\總數(shù)七十六頁\編于十點成像立體感強，一般掃描電鏡分辨率為3nm。近年來研制的低壓高分辨掃描電鏡其分辨率可達0.7nm，可用于觀察核孔復合體等更精細結(jié)構(gòu)。目前三十六頁\總數(shù)七十六頁\編于十點目前三十七頁\總數(shù)七十六頁\編于十點瘧疾破壞的兩個紅細胞目前三十八頁\總數(shù)七十六頁\編于十點目前三十九頁\總數(shù)七十六頁\編于十點ScanningTunnelingMicroscope,STM80年代發(fā)展起來的檢測樣品微觀結(jié)構(gòu)的儀器包括：STM、AFM、磁力顯微鏡、摩擦力顯微鏡等。掃描探針與樣品接觸或達到很近距離時，即產(chǎn)生彼此間相互作用力，如量子力學中的隧道效應（隧道電流）、原子間作用力、磁力、摩擦力等，并在計算機顯示出來，從而反映出樣品表面形貌信息、電特性或磁特性等。原理裝置掃描的壓電陶瓷、逼近裝置、電子學反饋控制系統(tǒng)和數(shù)據(jù)采集、處理、顯示系統(tǒng)。三、掃描遂道顯微鏡目前四十頁\總數(shù)七十六頁\編于十點1）可對晶體或非晶體成像，無需復雜計算，且分辨本領(lǐng)高（側(cè)分辨率為0.1～0.2nm，縱分辨率可達0.01nm）。2）可實時得到樣品表面三維圖象，可測量厚度信息。3）可在真空、大氣、液體等多種條件下工作；非破壞性測量。4）可連續(xù)成像，進行動態(tài)觀察。特點納米生物學研究領(lǐng)域中的重要工具,在原子水平上揭示樣本表面的結(jié)構(gòu)。用途目前四十一頁\總數(shù)七十六頁\編于十點

離心分離技術(shù)

細胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖與脂類等的顯示方法

特異蛋白抗原的定位與定性

細胞內(nèi)特異核酸的定位與定性

放射自顯影技術(shù)

定量細胞化學分析技術(shù)第二節(jié)細胞組分的分析方法目前四十二頁\總數(shù)七十六頁\編于十點一、離心分離技術(shù)用于分離細胞器與生物大分子及其復合物。①破碎細胞：低滲勻漿、超聲波破碎、研磨等。②差速離心：利用不同離心速度分離密度不同的細胞組分。③密度梯度離心：精細組分或生物大分子的分離。用途基本操作過程目前四十三頁\總數(shù)七十六頁\編于十點目前四十四頁\總數(shù)七十六頁\編于十點二、細胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖與脂類等的顯示方法利用一些顯色劑與所檢測物質(zhì)中一些特殊基團特異性結(jié)合的特性，通過顯色劑在細胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質(zhì)在細胞中的分布和含量。原理目前四十五頁\總數(shù)七十六頁\編于十點顯示DNA分布福爾根染色（FeulgenStain）酸水解可除去RNA，僅保留DNA，并除去DNA上的嘌呤，使脫氧核糖的醛基暴露，所暴露的自由醛基與schiff試劑反應呈紫紅色。目前四十六頁\總數(shù)七十六頁\編于十點PAS反應可確定多糖存在。原理是利用schiff試劑與醛基之間的反應，但其醛基來自碘酸氧化多糖的1、2-乙二醇基。四氧化鋨與不飽和脂肪酸反應呈黑色，用以證明脂肪滴存在。糖類顯色反應脂類顯色反應目前四十七頁\總數(shù)七十六頁\編于十點氮汞試劑與組織中的蛋白質(zhì)側(cè)鏈上的酪氨酸殘基反應呈紅色。檢測方法有多種氫氧化重氮與酪氨酸、色氨酸和組氨酸，形成有色復合物。可用硫醇鹽共價鍵的試劑進行檢測。如檢測堿性磷酸酶可用格莫瑞（Gomori）方法。蛋白質(zhì)顯色反應米倫（Millon）反應重氮反應蛋白質(zhì)-SH檢測酶檢測目前四十八頁\總數(shù)七十六頁\編于十點三、特異蛋白抗原的定位與定性快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限。免疫鐵蛋白技術(shù)免疫酶標技術(shù)免疫膠體金技術(shù)應用：通過對分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動態(tài)；胞內(nèi)酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等。免疫熒光技術(shù)免疫電鏡技術(shù)目前四十九頁\總數(shù)七十六頁\編于十點目前五十頁\總數(shù)七十六頁\編于十點四、細胞內(nèi)特異核酸的定位與定性光鏡水平的原位雜交技術(shù)

（同位素標記或熒光素標記的探針）電鏡水平的原位雜交技術(shù)

（生物素標記的探針與抗生物素抗體相連的膠體金標記結(jié)合）

PCR技術(shù)目前五十一頁\總數(shù)七十六頁\編于十點五、放射自顯影技術(shù)原理：利用同位素的放射自顯影，對細胞內(nèi)生物大分子進行定性、定位與半定量研究。應用：實現(xiàn)對細胞內(nèi)生物大分子進行動態(tài)和追蹤研究。

步驟：前體物摻入細胞（標記：持續(xù)標記和脈沖標記）；放射自顯影。目前五十二頁\總數(shù)七十六頁\編于十點鴨瘟病毒感染雞胚成纖維細胞24小時后，用3H－尿嘧啶核苷脈沖標記10分鐘的電鏡放射自顯影圖片。在病毒大量復制與裝配的宿主細胞中，核仁（Nu）依然存在，并保持其轉(zhuǎn)錄功能

SG：

銀顆粒；

N：

細胞核；

Nu：

核仁；

C：

細胞質(zhì)。

目前五十三頁\總數(shù)七十六頁\編于十點六、定量細胞化學分析技術(shù)細胞顯微分光光度術(shù)（Microspectrophotometry）利用細胞內(nèi)某些物質(zhì)對特異光譜的吸收，測定這些物質(zhì)（如核酸與蛋白質(zhì)等）在細胞內(nèi)的含量。包括：紫外光顯微分光光度測定法可見光顯微分光光度測定法目前五十四頁\總數(shù)七十六頁\編于十點流式細胞儀（FlowCytometry）①用于定量測定細胞中的DNA、RNA或某一特異蛋白的含量；②測定細胞群體中不同時相細胞的數(shù)量；③從細胞群體中分離某些特異染色的細胞； ④分離DNA含量不同的中期染色體。主要應用：目前五十五頁\總數(shù)七十六頁\編于十點目前五十六頁\總數(shù)七十六頁\編于十點細胞的培養(yǎng)細胞工程第三節(jié)細胞培養(yǎng)、細胞工程與顯微操作技術(shù)目前五十七頁\總數(shù)七十六頁\編于十點一、細胞的培養(yǎng)類型：原代培養(yǎng)細胞（primaryculturecell）繼代培養(yǎng)細胞（sub-culturecell）細胞株（cellstrain）:正常二倍體，接觸抑制（是指細胞在生長過程中達到相互接觸時停止分裂的現(xiàn)象）細胞系（cellline）：亞二倍體，接觸抑制喪失動物細胞培養(yǎng)目前五十八頁\總數(shù)七十六頁\編于十點

首先從健康動物取出組織塊，剪碎，用胰酶或膠原酶與EDTA（螯合劑）等將細胞連接處消化分散，給予良好的營養(yǎng)液與無菌的培養(yǎng)環(huán)境（接近體溫與體內(nèi)pH）,在培養(yǎng)瓶中進行靜止或慢速轉(zhuǎn)動培養(yǎng)。不論用何種培養(yǎng)液，一般都要加一定量的小牛血清，這樣才有利于細胞的貼壁生長與分裂。

動物原代細胞培養(yǎng)步驟目前五十九頁\總數(shù)七十六頁\編于十點原代細胞（primarycell）傳代細胞（sub-culturecell）將肌體取出的細胞或組織進行實效培養(yǎng)。實效培養(yǎng)的細胞大約增殖10代左右，這樣的細胞稱為原代細胞。

原代培養(yǎng)的細胞繼續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)稱為傳代培養(yǎng)。用于傳代培養(yǎng)的稱為傳代細胞。目前六十頁\總數(shù)七十六頁\編于十點

原代細胞一般傳至10代左右就不易傳下去了，細胞生長出現(xiàn)停滯，大部分細胞衰老死亡，但有極少數(shù)細胞可能渡過“危機”而傳下去。這些存活的細胞一般又可順利地傳代40-50次，并且仍保持原來染色體的二倍體數(shù)量及接觸抑制的行為，這種傳代細胞稱為細胞株。細胞株（cellstrain）：目前六十一頁\總數(shù)七十六頁\編于十點

由能進行無限次傳代培養(yǎng)的細胞群稱為細胞系。細胞系細胞與體內(nèi)原來的細胞比，其形態(tài)、結(jié)構(gòu)、遺傳上存在不同程度的變異。細胞系（cellline）：

細胞系細胞的特點是染色體明顯改變，一般呈亞二倍體或非整倍體，接觸抑制喪失，容易傳代培養(yǎng)。如Hela細胞系、BHK21細胞系、CHO細胞系等。目前六十二頁\總數(shù)七十六頁\編于十點Hela細胞（左）、CHO細胞（右）的培養(yǎng)目前六十三頁\總數(shù)七十六頁\編于十點1、貼附型細胞（1）成纖維細胞型細胞

細胞長梭形,核圓位中央,胞質(zhì)常外伸2-3個長短突起,多數(shù)細胞排列疏散,有較大細胞間隙,有時也相互平行排列，成群細胞呈放射狀、旋渦狀等形式。目前六十四頁\總數(shù)七十六頁\編于十點（2）上皮型細胞

類似上皮細胞而故名。細胞扁平狀，排列較規(guī)則，貼壁后呈三角形及不規(guī)則扁平多角形，中央有偏圓形核，生長時彼此緊密連接成單層細胞，相互擁擠呈現(xiàn)“鋪路石塊狀”，局部可形成單層上皮“膜片組織”。目前六十五頁\總數(shù)七十六頁\編于十點（3）游走型細胞

在支持物分散生長，一般不連接成片形成群落；細胞質(zhì)常伸出偽足和突起；在培養(yǎng)皿壁上生長位置不固定，呈活躍的游走和變形運動，速度快且方向不規(guī)則；細胞內(nèi)易出現(xiàn)色暗吞噬顆粒；細胞外形不規(guī)則且多變，細胞密度增大連接成片時，形狀類似成纖維細胞型或上皮細胞型。目前六十六頁\總數(shù)七十六頁\編于十點（4）多形型細胞

常見形式：神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞。

細胞多形不規(guī)則。其不規(guī)則形態(tài)不象成纖維細胞那樣由胞質(zhì)突起所致，而是一般分胞體和胞突兩部分，胞突細長，胞體多形不規(guī)則。目前六十七頁\總數(shù)七十六頁\編于十點目前六十八頁\總數(shù)七十六頁\編于十點2、非貼附型細胞

細胞體外生長時不貼壁，在懸浮培養(yǎng)液中生長而故名，又稱懸浮型細胞。細胞呈球形。常見形式：血液白細胞、淋巴組織細胞、某些腫瘤細胞、雜交細胞、轉(zhuǎn)化細胞系等。培養(yǎng)時，細胞密度大，培養(yǎng)效率高，操作方便，易于大規(guī)模生產(chǎn)。目前六十九頁\總數(shù)七十六頁\編于十點

（1）單倍體細胞培養(yǎng)：用花藥在人工培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)?？梢詮男℃咦樱ㄐ坌陨臣毎┲苯影l(fā)育成胚狀體，然后長成單倍體植株；也可通過愈傷組織誘導分化出芽和根，最終長成植株。

（2）原生質(zhì)體培養(yǎng)（二倍