登革病毒實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)(精美自制)

登革病毒的概述

黃病毒科黃病毒屬單股正鏈RNA登革病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4個(gè)血清型形態(tài)結(jié)構(gòu)

球形，直徑37nm～50nm含單股正鏈RNA，長度約11Kb編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白，7種非結(jié)構(gòu)蛋白5’-C-PrM(M)-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3’3’端非編碼區(qū)含高度保守的核苷酸序列宿主范圍3種自然宿主：伊蚊、人、低等靈長動(dòng)物登革病毒成熟顆粒模擬圖目前一頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點(diǎn)普通登革熱：登革熱(denguefever)是由登革熱病毒所引起，由伊蚊傳播的急性傳染病。其臨床特征為突起發(fā)熱，頭痛，全身肌肉、骨骼和關(guān)節(jié)痛，極度疲乏，皮疹，淋巴結(jié)腫大及白細(xì)胞減少，部分病人有出血傾向，病情較輕，通?？勺孕谢謴?fù)。

登革出血熱：

病情較重，致死率高。通常發(fā)生于過去已感染過登革病毒而再次感染其他型別的人，發(fā)病的嚴(yán)重程度與病人血清原來存在的登革病毒抗體密切關(guān)系。登革休克綜合癥：目前二頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點(diǎn)全球形勢DF廣泛分布于有媒介伊蚊存在的熱帶、亞熱帶地域。在東南亞、西太平洋和加勒比海地區(qū)呈現(xiàn)地方性流行。世界衛(wèi)生組織警告登革熱病例正在迅猛增加已威脅到全球三分之一人口的健康安全WHO估計(jì)，全球約25億的人群處于DF的威脅中。全球每年有5000萬人感染登革熱病毒，其中50萬為DHF病例（其中大部份為兒童）。目前全世界還沒有有效的疫苗預(yù)防登革熱。

目前三頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點(diǎn)埃及伊蚊白紋伊蚊在東南亞及海南省，埃及伊蚊是本病的主要媒介。在廣東、廣西，白紋伊蚊是主要媒介。白紋伊蚊孳生于房屋內(nèi)外的淺水及積水中。成蚊白天吸血，嗜人血。傳播媒介目前四頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點(diǎn)流行病學(xué)

患者和隱性感染者是主要傳染源。在流行期間，隱性感染者的數(shù)量可達(dá)全體人群的1/3，可能是最重要的傳染源。主要發(fā)生于市鎮(zhèn)人口集中地區(qū)，發(fā)病與布雷指數(shù)有關(guān)。雨季為發(fā)病高峰季節(jié)。廣東省5~10月流行。其中8、9月份為高峰。有一定的周期性（4－5年）。人與人之間不會(huì)直接經(jīng)過呼吸道、消化道或接觸等傳播。人群易感性和免疫力

人對登革病毒普遍易感，但感染后并非人人發(fā)病。由于對不同型別毒株感染無交叉免疫力，因此可以發(fā)生二次感染。感染一種病毒型產(chǎn)生的免疫對同型病毒免疫力可持續(xù)1～4年，而對異型病毒的免疫則短。目前五頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點(diǎn)登革熱流行與預(yù)防有利于DF流行的因素登革病毒（帶毒蚊、人、獸）輸入輸入地自然氣候輸入地伊蚊密度、屋內(nèi)處積水容器、居民養(yǎng)花、養(yǎng)蓮、建筑工地積水、水缸積水預(yù)防登革熱健康提醒：1.到登革熱流行區(qū)旅游或生活，應(yīng)穿著長袖衣服及長褲，并在外露的皮膚及衣服上涂蚊蟲驅(qū)避藥物；2.如果房間沒有空調(diào)設(shè)備，應(yīng)裝置蚊帳或防蚊網(wǎng)；3.使用家用殺蟲劑殺滅成蚊，并遵照包裝指示使用適當(dāng)?shù)姆至浚?.避免在“花斑蚊”出沒頻繁時(shí)段在樹蔭、草叢、涼亭等戶外陰暗處逗留；5.防止積水，清除伊蚊孳生地；6.盡量避免用清水養(yǎng)植植物；7.對于花瓶等容器，每星期至少清洗、換水一次，勿讓花盆底盤留有積水。把所有用過的罐子及瓶子放進(jìn)有蓋的垃圾桶內(nèi)。目前六頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室確診病例普通登革熱：登革病毒血清特異性IgM抗體陽性，結(jié)合臨床癥狀恢復(fù)期血清特異性IgG抗體比急性期有4倍以上增長從急性病人血清、腦脊液或尸解臟器中分離到病毒或檢測到病毒序列或檢測到病毒抗原登革出血熱：多器官大量出血肝腫大血容比增加20％以上登革休克綜合癥：伴休克目前七頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點(diǎn)登革熱實(shí)驗(yàn)室檢測常規(guī)方法C6/36細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)登革病毒的分離和鑒定血凝抑制試驗(yàn)（HI）補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CF）中和試驗(yàn)（NT）間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）膠體金免疫層析快速診斷試驗(yàn)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(DIBA)RT-PCR熒光PCR

目前八頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點(diǎn)標(biāo)本的采集與保存采集對象主要為登革熱疑似病例、臨床診斷病例等，必要時(shí)采集疑似病例的密切接觸者標(biāo)本。根據(jù)采樣時(shí)間確定檢測目的病原學(xué)檢測初次感染：出現(xiàn)登革熱癥狀的前1～2和發(fā)病后的3～5天

再次感染：出現(xiàn)登革熱癥狀的前后1～2天血清學(xué)檢測

初次感染：出現(xiàn)登革熱癥狀1周后可檢測到IgM;2周后可檢測到IgG再次感染：出現(xiàn)登革熱癥狀后1～2天可檢測到IgM和IgG

目前九頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點(diǎn)標(biāo)本的采集與保存蚊媒標(biāo)本主要為埃及伊蚊、白紋伊蚊或其它可疑蚊種，檢測抗原，常用于登革病毒監(jiān)測。采集回來的蚊子置－20℃凍死后，按蚊種及捕獲地點(diǎn)分組，以每組20～50只分裝于螺口凍存管，－70oC冰箱或液氮保存。蚊媒標(biāo)本的檢測目的是登革病毒分離或登革病毒核酸檢測，因此標(biāo)本采集后應(yīng)確保存于超低溫條件下。目前十頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點(diǎn)蚊蟲標(biāo)本研磨程序一組標(biāo)本（50只蚊子）轉(zhuǎn)入1.5ml的eppendorf離心管加入100μl標(biāo)本處理液用小型電動(dòng)研磨器將蚊子磨勻補(bǔ)加900μl標(biāo)本處理液4oC，10000rpm，離心10min標(biāo)本處理液:MEM90ml小牛血清2ml慶大霉素（50μg/ml)100μl兩性霉素B（1000μg/ml）1ml青鏈霉素（1000U/ml）1ml用7.5%碳酸氫鈉溶液調(diào)至PH7.2。用于：登革病毒分離登革病毒核酸檢測剩余的研磨液需保存在-70oC冰箱中以備復(fù)查。注意：研磨過程最好在冰上操作；低溫離心機(jī)4℃目前十一頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點(diǎn)標(biāo)本的采集與保存血液標(biāo)本是登革病毒檢測的主要標(biāo)本，采集5ml為宜，血清、血漿都可，可檢測抗原或抗體。用于抗體檢測的血清標(biāo)本最多可在2～8℃保存一周，長期保存應(yīng)在－20℃以下。用于抗原檢測的血清標(biāo)本應(yīng)保存于－70℃。全血冰凍溶解后會(huì)產(chǎn)生溶血，未分離血清的標(biāo)本應(yīng)避免冰凍保存。目前十二頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點(diǎn)感染登革病毒后的免疫反應(yīng)目前十三頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點(diǎn)采集第二份血的重要性1～7天，70～80％核酸陽性，晚恢復(fù)期血清（14－30天）抗體檢測可進(jìn)一步確認(rèn)可分辨初次和二次感染對于初次感染，晚恢復(fù)期血清可用以型別鑒定目前十四頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點(diǎn)檢測方法的選擇≤5天急性期，3種方法8～13天早恢復(fù)期14～30天晚恢復(fù)期病毒分離7天抗體檢測3小時(shí)病毒核酸檢驗(yàn)2-3小時(shí)血清抗體檢測目前十五頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點(diǎn)登革病毒的分離和鑒定所用樣本急性期血清、血漿、淋巴細(xì)胞尸體組織：尤其是肝、脾、淋巴結(jié)、胸腺蚊子樣本的保存48小時(shí)內(nèi)進(jìn)行病毒分離，可放于4－8℃存放時(shí)間較長，應(yīng)把血清分離出來，－70℃保存，避免凍融淋巴細(xì)胞，抗凝血應(yīng)在幾小時(shí)內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室分離方法：敏感細(xì)胞分離、乳鼠接種分離、蚊蟲接種分離。常用C6/36細(xì)胞進(jìn)行登革病毒分離。鑒定方法：中和試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)、單克隆抗體免疫熒光技術(shù)、PCR技術(shù)。

目前十六頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點(diǎn)病毒分離1.接種到蚊頭(最敏感)2.接種敏感細(xì)胞：C6/36，BHK21（成本效益最高）3.接種乳鼠鑒定方法：中和試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)、單克隆抗體免疫熒光技術(shù)、PCR技術(shù)。目前十七頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點(diǎn)C6/36細(xì)胞分離登革病毒單層C6/36細(xì)胞的準(zhǔn)備（C6/36細(xì)胞通常28℃培養(yǎng)2～3天后可長成單層，7～10天傳下一代。C6/36細(xì)胞形態(tài)為類圓形，易于貼壁生長，但貼壁不牢。C6/36細(xì)胞是傳代細(xì)胞，理論上可以無限傳代。）

細(xì)胞管法、細(xì)胞板法標(biāo)本的處理

血清標(biāo)本、蚊蟲標(biāo)本和組織標(biāo)本

標(biāo)本接種

接種、吸附、細(xì)胞毒性的處理結(jié)果觀察

每天觀察細(xì)胞生長情況目前十八頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點(diǎn)正常C6/36細(xì)胞（100X）C6/36細(xì)胞接種病人血清第二天時(shí)出現(xiàn)的血清毒性現(xiàn)象（100X）細(xì)胞培養(yǎng)分離登革病毒目前十九頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點(diǎn)登革1型病毒在C6/36細(xì)胞上病變情況（100X）登革2型病毒在C6/36細(xì)胞上病變情況（100X）登革3型病毒在C6/36細(xì)胞上病變情況（100X）登革4型病毒在C6/36細(xì)胞上病變情況（100X）目前二十頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點(diǎn)血凝抑制試驗(yàn)血凝試驗(yàn)血凝抑制試驗(yàn)有血凝素（HA）的病毒能凝集人或動(dòng)物紅細(xì)胞，稱為血凝現(xiàn)象，血凝現(xiàn)象能被相應(yīng)抗體抑制稱為血凝抑制試驗(yàn)，原理是相應(yīng)抗體與病毒結(jié)合后，阻止病毒表面HA與紅細(xì)胞結(jié)合，使原有的血凝反應(yīng)被抑制。過去最常規(guī)的方法，優(yōu)點(diǎn)：敏感容易操作，需要的儀器少，結(jié)果可靠，HI抗體可存在30～45年；缺點(diǎn)：樣本要預(yù)處理，必須雙份血，難以區(qū)分登革病毒感染和其他黃病毒感染（如乙腦病毒、西尼羅病毒等）。目前二十一頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點(diǎn)補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)抗體與抗原反應(yīng)形成復(fù)合物，通過激活補(bǔ)體而介導(dǎo)溶血反應(yīng)，可作為反應(yīng)強(qiáng)度的指示系統(tǒng)。沒有廣泛應(yīng)用，操作較難，可用于檢測現(xiàn)感染，不適用于血清流行病學(xué)研究。目前二十二頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點(diǎn)中和試驗(yàn)（NT）優(yōu)點(diǎn)：最特異和敏感的方法缺點(diǎn)：昂貴，耗時(shí)長，技術(shù)復(fù)雜，不常用目前二十三頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點(diǎn)間接免疫熒光試驗(yàn)抗原抗體熒光標(biāo)記抗抗體原理：缺點(diǎn)：需要熒光顯微鏡，和富有經(jīng)驗(yàn)的試驗(yàn)人員目前二十四頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點(diǎn)快速檢測試劑全血、血清、血漿含所有檢測所需物品儲(chǔ)存溫度(2-30°C)>90%敏感性和特異性15分鐘出結(jié)果可鑒別初次和二次感染25tests目前二十五頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶標(biāo)記登革病毒單抗與登革病毒復(fù)合物人IgM抗體抗人IgM單克隆抗體捕捉法（檢測登革病毒抗體IgM）IgM抗體出現(xiàn)的比IgG早一點(diǎn),約5天后可以查到。初次感染的IgM比二次感染高的多，IgM可持續(xù)2～3個(gè)月診斷意義：IgM陽性不表明現(xiàn)感染，有可能是2～3個(gè)月前感染，在登革尚未地方性流行地區(qū)，可用于臨床檢測和人群監(jiān)測目前二十六頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)間接法(檢測登革病毒抗體IgM或IgG)1.酶標(biāo)板孔上包被登革病毒抗原2.每孔中加血清標(biāo)本稀釋液（如果含登革病毒抗體IgM或IgG即可結(jié)合）3.加HRP標(biāo)記的二抗（抗人IgM或抗人IgG），在適當(dāng)?shù)牡孜镒饔孟鲁尸F(xiàn)顏色反應(yīng)4.肉眼判斷顏色深淺或加終止液后用酶標(biāo)儀讀取每孔不同的吸光值，初步判斷標(biāo)本中抗體的含量IgG非特異，與其它黃病毒有交叉反應(yīng)，不能用于分型，敏感性比HI好，正取代HI目前二十七頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點(diǎn)登革病毒的核酸檢測：PCR檢測與鑒定登革病毒處理流程

血清（細(xì)胞上清或組織研磨液）病毒RNA提取cDNA的合成登革病毒型特異引物PCR擴(kuò)增凝膠電泳，結(jié)果判斷用QIAampViralRNAKit或者RocheViralRNAKit提取病毒RNA

根據(jù)PCR特異性產(chǎn)物片段大小進(jìn)行判斷

目前二十八頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點(diǎn)RT-PCR檢測登革病毒基因與分型

登革熱診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS216-2008）型別引物名稱引物序列（5’－3’）擴(kuò)增片段通用引物D1TGAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCGD2TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC511bp1型登革病毒D1TGAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG482bpTS1CGTCTCAGTGATCCGGGGG2型登革病毒D1TGAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG119bpTS2CGCCAGAAGGGCCATGAACAG3型登革病毒D1TGAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG290bpTS3TAACATCATCATGAGACAGAGC4型登革病毒D1TGAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG392bpTS4CTCTGTTGTCTTAAACAAGAGA目前二十九頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點(diǎn)500bp500bp通用引物PCR結(jié)果分型引物PCR結(jié)果

MIⅡⅢⅣ

MIⅡⅢⅣ通用產(chǎn)物：511bp分型產(chǎn)物：

Ⅰ：482bp，Ⅱ：119bp，Ⅲ：290bp，Ⅳ：392bp目前三十頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點(diǎn)RealtimePCR檢測登革病毒處理流程血清（細(xì)胞上清或組織研磨液）病毒RNA提取cDNA的合成RealtimePCR結(jié)果判斷用QIAampViralRNAKit或RocheViralRNAKit提取病毒RNA

登革病毒是RNA病毒，PCR前先進(jìn)行RT

根據(jù)RealtimePCR后軟件分析得到的擴(kuò)增曲線進(jìn)行判斷

引物與探針的特異性是反應(yīng)成功與否的關(guān)鍵因素

目前三十一頁\總數(shù)三十六頁\編于十二點(diǎn)登革病毒檢測用引物與探針

登革熱診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS216-2008）登革病毒通用引物

Den-FP：5’GCATATTGACGCTGGGAGAGA3’Den-RP：5’G