生物大分子結(jié)構(gòu)與功能蛋白質(zhì)的柔性結(jié)構(gòu)

第五章：蛋白質(zhì)的柔性結(jié)構(gòu)目前一頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點

天然折疊的蛋白分子往往不是以一種構(gòu)象狀態(tài)存在的。在晶體結(jié)構(gòu)中我們看到的往往僅是一種狀態(tài)的構(gòu)象，它是蛋白質(zhì)分子的一個平均構(gòu)象。實際上，蛋白質(zhì)分子始終是處于一種呼吸的狀態(tài)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中所有的原子都在運動，這些原子的運動通常是隨機的，但有時可以是集合性的運動。這種集合性的運動引起分子中的原子團在相同的方向上產(chǎn)生運動，造成蛋白質(zhì)分子中的側(cè)鏈可以從一種構(gòu)象轉(zhuǎn)化為另一種構(gòu)象。某些環(huán)區(qū)域也并不總是固定在一種單一的構(gòu)象狀態(tài)，螺旋也可以互相產(chǎn)生滑動，完整的結(jié)構(gòu)域之間也可以改變它們的堆積接觸以打開或關(guān)閉結(jié)構(gòu)域之間的距離。通常這些運動都是比較小的，有時小到僅有1/10?

的運動，但有時這種集合性運動可以很大，大到足以具有重要的生物學意義。目前二頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點

這樣大的集合性運動在X-射線晶體學研究中所表現(xiàn)出來的是電子密度的水平低，甚至在某些情況下看不到電子密度的存在。產(chǎn)生這樣的運動的區(qū)域通常在晶體學中被表述為柔性(flexibility)運動或無序(disorder)。核磁共振實驗對于這樣的區(qū)域的測定可以作為一種互補，因為核磁共振實驗可測出這些區(qū)域的各種不同的構(gòu)象，通過理論計算也可以計算出這些分立的或集合性運動這叫作分子動力學模擬。目前三頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點

分子動力學模擬已經(jīng)表明，每一個分立的殘基的集合性運動僅在皮秒(10-12

秒)的時間尺度，而環(huán)區(qū)域的運動在納秒(10-9秒)的尺度。這種運動對于許多蛋白質(zhì)的功能是非常重要的。象電子轉(zhuǎn)移和配基結(jié)合或釋放反應均以這樣的時間尺度發(fā)生，并通常伴隨著蛋白質(zhì)原子的運動。例如，當肌紅蛋白呼吸時，通道在溶劑和被包埋在分子內(nèi)部的結(jié)合部位之間打開，以允許氧原子在納秒的時間尺度范圍與肌紅蛋白結(jié)合或者釋放出來。

除了蛋白質(zhì)中原子小的呼吸運動之外，在分子的功能態(tài)之間也會發(fā)生大的構(gòu)象變化。不同的pH和配基的存在和缺失以及環(huán)境中的微小的變化，往往能夠穩(wěn)定蛋白質(zhì)的不同構(gòu)象態(tài)。這些構(gòu)象變化可以是活性部位的氨基酸側(cè)鏈的構(gòu)象變化到環(huán)區(qū)域的運動等。同時結(jié)構(gòu)域之間的相對取向和寡聚蛋白中四級結(jié)構(gòu)也會發(fā)生變化，這樣的運動通常是與功能相關(guān)的。例如酶的催化，肌肉運動和能量轉(zhuǎn)換等。目前四頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點真核細胞周期的五個相(G0,G1,S,G2和M相)例1：細胞周期調(diào)節(jié)蛋白激酶的構(gòu)象變化在S相，DNA合成，DNA被復制并且染色體翻倍。在M相，有絲分裂父代細胞的二倍化染色體通過有絲分裂的紡錘體分開，這樣每個子代細胞接收到相同組分的染色體。

一個細胞分裂的完整周期是MG1S和G2。通過G1S和G2相，細胞的蛋白質(zhì)合成機器大分子和細胞器被建立起來，同時細胞的體積增大。在有絲分裂時，染色體和細胞質(zhì)被分為兩個相等的部分。此外，還有一個靜止相G0相，發(fā)生在細胞的未分裂狀態(tài)。目前五頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點由cyclin的降解對CDKs的調(diào)節(jié)細胞周期的進程取決于一系列的叫作cyclin依賴的蛋白激酶(cyclin-dependentproteinkinases,CDKs)的連續(xù)激活作用。圖中顯示兩種類型的cyclin-CDK復合物，一種是觸發(fā)S相，另一種觸發(fā)M相。在這兩種情況下CDK的激活需要與cyclin的結(jié)合，它們的非活性依賴于cyclin的降解在脊椎動物的細胞中至少有四種不同CDKs，控制著細胞周期的活動。不同的催化亞基都屬于密切相關(guān)的基因家族，不同的CDK的一個或幾個cyclin分子都是該家族的成員。CDKs作為一個延遲開關(guān)，控制著從G1相到S相從G2相到M相以及所有構(gòu)成細胞周期的其它步驟目前六頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點

人的體細胞中調(diào)制DNA復制的CDK2-cyclinA的結(jié)構(gòu)提供了詳細的結(jié)構(gòu)信息以及cyclinA激酶的功能。CyclinA的功能片段的晶體結(jié)構(gòu)于1995年由LouiseJohnson實驗室解出，非活性的CDK2的結(jié)構(gòu)1993年已由Sung-hoKim實驗室解出，活性的cyclinA片段與CDK2復合物的結(jié)構(gòu)也于1995年由NicolaPavletich實驗室解出。通過對這些結(jié)構(gòu)的分析和結(jié)構(gòu)比較，揭示出cyclinA是如何結(jié)合到CDK2上，并如何在CDK2的活性部位引起大的構(gòu)象變化，使CDK2蛋白質(zhì)從一種非活性的狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚誀顟B(tài)的。而在此過程中cyclinA的結(jié)構(gòu)則沒有發(fā)生構(gòu)象變化cyclinA依賴型激酶CDK2的結(jié)構(gòu)cyclinA依賴型激酶CDK2有兩個結(jié)構(gòu)域，N-端結(jié)構(gòu)域由一段α螺旋β折疊片組成，在α螺旋中PSTAIRE的氨基酸順序（紅色）在所有的CDKs蛋白激酶中都是高度保守的；C-端結(jié)構(gòu)域主要由α螺旋組成，并含有一段柔性的環(huán)區(qū)域稱作T-loop

（黃色）環(huán)區(qū)域，含有一個蘇氨酸殘基，在完全活性的酶中該蘇氨酸殘基被磷酸化。目前七頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點CyclinA的結(jié)構(gòu)CyclinA活性片段殘基173-432的結(jié)構(gòu)由兩個非常相似的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。每個結(jié)構(gòu)域都由五段α螺旋組成。該活性片段的作用幾乎與完整的cyclinA分子的作用相同。在所cyclinA中第一個結(jié)構(gòu)域具有十分保守的氨基酸順序被稱作Cyclin-box

，而第二個結(jié)構(gòu)域的氨基酸順序則不相同。因此盡管cyclinA片段的兩個結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)幾乎相同但僅有一個Cyclin-box序列。目前八頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點活性的CDK2藍色和cyclinA復合物的結(jié)構(gòu)在cyclinA-CDK2復合物中，主要是CyclinA與CDK2中的PSTAIRE螺旋和T-loop相互作用，cyclin-box螺旋2-6與CDK2的PSTAIRE深紅色螺旋和T-loop黃色作用。在該復合物中，cyclinA的結(jié)構(gòu)與單個cyclinA是相同的，而CDK2的結(jié)構(gòu)則發(fā)生了很大的構(gòu)象變化，包括PETAIRE螺旋T-loop和ATP的結(jié)合部位（淺紅色）。整個N端結(jié)構(gòu)域相對于C端的結(jié)構(gòu)域的取向發(fā)生了變化，此外PSTAIRE螺旋向CDK2的活性部位靠近并旋轉(zhuǎn)了90°，以便主要的催化殘基Glu51指向裂縫，而不是象在單個的CDK2結(jié)構(gòu)中那樣遠離此裂縫。目前九頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點CDK2與cyclinA結(jié)合的構(gòu)象變化一旦與cyclinA結(jié)合，PSTAIRE螺旋橙色轉(zhuǎn)動90°，并改變位置以使得Glu51變?yōu)橹赶蚧钚圆课弧Ｔ揚STAIRE螺旋的一些主鏈原子由于這種一致性運動位移了8.0?的距離。T-loop發(fā)生了大的位置重排某些環(huán)區(qū)域上的氨基酸殘基的位移可達20?。左圖：在非活性態(tài)，PSTAIRE螺旋紅色的取向使Glu51指向遠離ATP的結(jié)合部位，而T-loop封住了與底物的結(jié)合部位，以阻止蛋白結(jié)合到CDK2上。右圖：在活性的cyclinA-CDK2復合物結(jié)構(gòu)中，PSTAIRE螺旋發(fā)生了重新定向以使得Glu51殘基指向活性部位并與另一個與催化有關(guān)的殘基Lys33形成鹽鍵，T-loop改變了構(gòu)象并與另一個殘基Asp145一起與活性部位中的鎂離子配位，此時底物的結(jié)合部位被打開，蛋白可以結(jié)合底物。cyclin-CDK2復合物可以磷酸化Ser/Thr殘基并進而激活所結(jié)合的蛋白。在自由CDK2T-loop結(jié)構(gòu)中的α螺旋在復合物中變?yōu)橐粭lβ

鏈。目前十頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點cyclin結(jié)合引起CDK2的結(jié)構(gòu)變化(a)活性部位位于N端結(jié)構(gòu)域（藍色）和C端結(jié)構(gòu)域（紫色）之間的裂縫中，在非活性狀態(tài)此活性部位被T-loop所封閉。(b)在活性的cyclin結(jié)合狀態(tài)的CDK2結(jié)構(gòu)中,Tloop的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化,活性部位被打開,Thr160適合于磷酸化.由于cyclinA的結(jié)合所引起的CDK2的構(gòu)象變化,不僅暴露了活性部位的裂縫以使ATP和蛋白底物能夠與之結(jié)合,而且活性部位的殘基發(fā)生了重排,以形成酶的催化作用。此外Thr160被暴露出來，并準備被磷酸化以提高催化活性。簡而言之蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的柔性調(diào)節(jié)了CDK家族的酶活性，因而控制了細胞周期。目前十一頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點StructuralbasisofinhibitionofCDK-cyclincomplexesbyINK4inhibitorsPhilipD.Jeffrey,LilyTong,andNikolaP.PavletichCellularBiochemistryandBiophysicsProgramandHowardHughesMedicalInstitute,MemorialSloan-KetteringCancerCenter,NewYork,NewYork10021,USAGenesDev.200014:3115-3125目前十二頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點Thecyclin-dependentkinases4and6(Cdk4/6)thatdriveprogressionthroughtheG1phaseofthecellcycleplayacentralroleinthecontrolofcellproliferation,andCDKderegulationisafrequenteventincancer.Cdk4/6areregulatedbytheD-typecyclins,whichbindtoCDKsandactivatethekinase,andbytheINK4familyofinhibitors.Thestructurerevealsthatp18-INK4cinhibitstheCDK–cyclincomplexbydistortingtheATPbindingsiteandmisaligningcatalyticresidues.p18INK4calsodistortsthecyclin-bindingsite,withthecyclinremainingboundataninterfacethatissubstantiallyreducedinsize.TheseobservationssupportthemodelthatINK4bindingweakensthecyclin’saffinityfortheCDK.ThisstructurealsoprovidesinsightsintothespecificityoftheD-typecyclinsforCdk4/6.目前十三頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點

Overallstructureofthep18–Cdk6–K-cyclincomplexandcomparisonwithCdk2–cyclinA

Schematicviewofp18–Cdk6–K-cyclin.p18isshowninyellow,Cdk6incyan,K-cyclininpurple.TheTloopandPSTAIREelementsofCdk6arehighlightedinred,andthehelicesofthefirstcyclinrepeatarelabeled.NandCterminiarelabeledwherevisible.Thep18–Cdk6andK-cyclin–Cdk6interfacesdonotoverlapandlieonoppositesidesofthekinase,buryingatotalof4350?2ofsurfacearea.(B)Topviewofthep18–Cdk6–K-cyclincomplex,approximatelyorthogonaltoviewinA.Theankyrinrepeatsofp18arenumbered.ThePSTAIREhelixiscentraltotheCdk6–K-cyclininterface,buttheTlooppacksontheothersideofthekinase.(C)ViewofCdk2–cyclinAcomplexsuperimposedontheClobeofCdk6inthesameorientationasinA.BoththePSTAIREhelixandTloop,inred,packagainstcyclinA.(D)ViewofsuperimposedCdk2–cyclinAcomplexfromsameviewpointasB.目前十四頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點TheCdk6structureinthep18–Cdk6–K-cyclincomplexhasalargenumberofconformationalchangescomparedwiththeactiveconformationofCdk2(Jeffreyetal.1995;Fig.2C,D)orofotherproteinkinases.InthisinactiveCdk6structure,theNandClobesarerotated13°awayfromeachother,resultinginthemisalignmentofATP-bindingresidues.TheN-lobePSTAIREhelix,whichcontainsaninvariantactivesiteresidue(Glu61),isdisplacedby4.5?awayfromtheactivesiteandisrotatedby16°.AC-lobeloop(Tloop,residues162–182),whichcontainsthethreoninethatisphosphorylated(Thr177)onthefullactivationofthekinase(Morgan1995;Russoetal.1996)andthatformspartofthepolypeptidesubstrate-bindingsite(Brownetal.1999),isdisplacedby>30?.Finally,anadditionalloopatthebackofthecatalyticcleft(residues99–102),whichwouldhydrogenbondtoATP,isdisplacedbyseveral?ngstroms.目前十五頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點TheCdk2–cyclinAstructure(Jeffreyetal.1995)showedthatcyclinAbindingtoCdk2causedconformationalandpositionalchangesinthePSTAIREhelixandTloopandthatthesechangesactivatedthekinasebycorrectlyaligningcertainactivesiteresiduesandreorganizingthepolypeptidesubstratebindingsite.Inthep18–Cdk6–K-cyclincomplex,notonlydoestheK-cyclinfailtocarryoutmostoftheseconformationalchangesbutp18causesthemisalignmentofadditionalresiduesinvolvedinATPbindingandcatalysis.目前十六頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點StructureoftheCdk6–K-cyclininterface(A)ThePSTAIREhelixofCdk6isacentralfeatureoftheCdk6–K-cyclininterface.TheviewpointshowncorrespondsapproximatelytothatinB.Threesetsofinteractionsareshown:hydrogenbondsbetweentheCdk6main-chainprecedingthePSTAIREhelixandtheconservedLys–GlupairofK-cyclin(K106,E135);theconservedIle59ofCdk6insertsintoahydrophobicpocketinK-cyclin;residuesattheendofthePSTAIREhelix,oneturnlongerinCdk4andCdk6thaninCdk2,interactwithresiduesontheN-terminalhelixofK-cyclinandmayplayaroleincyclin–CDKspecificity.(B)Surfacerepresentationofp18–Cdk6–K-cyclincomplexillustratingtheminimalinteractionsbetweenK-cyclinandtheCdk6Clobe.p18iscoloredyellow,theCdk6Nlobeiscyan,theCdk6Clobeisblue,andtheK-cyclinispurple.TheonlycontactsbetweenK-cyclinandtheClobeofCdk6arisefrominteractionswiththeN-terminalhelixofK-cyclin.(C)SurfacerepresentationofCdk2–cyclinAintheequivalentorientationasthatinA,showingsignificantlygreaterinteractionsbetweentheClobeoftheCdk2andthecyclinA,givingrisetoamuchmoreextensivecyclin–CDKinterface.目前十七頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點TheATP-bindingsiteofp18–Cdkl6–K-cyclinandCdk2–cyclinA.ActivesiteresiduesimplicatedinATPbindingandcatalysisaredisplacedinthep18–Cdk6–K-cyclincomplexrelativetotheactiveCdk2–cyclinAconformation.Cdk2andCdk6weresuperimposedontheirClobes.Cdk6isshownincyan,p18inyellow,Cdk2ingray.Movementofactivesiteresiduesisindicatedbyredarrows.p18displacestheNloberelativetotheClobe,causingthehydrophobicresidues(Ile19,Val27,Ala41,Leu152)thatsandwichtheadenineringofATPtomovebyupto4.5?.Thep18inhibitoralsodistortstheedgeoftheactivesiteviaPhe82,affectinghydrogenbondinginteractionswiththeedgeoftheATPring.TherelatedshiftofthePSTAIREhelixontheothersideoftheactivesitedisplacesanactivesiteresidue(Glu61).TheTloopofCdk6divergesfromthatofCdk2betweenPhe164andVal181TheINK4-inducedconformationalchangesinCdk6wouldinterferewiththebindingofATPandpolypeptidesubstrateandwouldalsomisalignanyweaklyboundsubstrateswithrespecttophosphotransfer.目前十八頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點ThedifferenceswithrespecttoCdk2–cyclinAarisefromcontactsattheCterminusofthePSTAIREhelixcausedbyathreeresidueinsertioninCdk6(residues70–72)resultinginoneadditionalhelicalturnof3.10type.ThelongerPSTAIREhelixofCdk6wouldcollidewiththeN-terminalhelixofcyclinA(Thr70andPhe71ofCdk6wouldclashwithMet189andTyr185ofcyclinA).ThelongerCdk6PSTAIREhelixisaccommodatedinK-cyclinbyasmallshiftoftheN-terminalhelixrelativetocyclinAandbythesubstitutionofsmalleraminoacids(Asn24ofK-cyclininsteadofTyr185ofcyclinA).ThisresultsincontactsbetweenThr70andPhe71intheCdk6insertionandAsn24,Ile28,andPhe32ofK-cyclin.目前十九頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點ThestructureofCdk6inthep18–Cdk6–K-cyclincomplexdiffersfromthestructureofcyclinA-activatedCdk2intheorientationoftheNandClobesofthekinaseandinthepositionsofthePSTAIREhelixandTloop.ComparedtotheCdk2–cyclinAcomplex,thekinaseNandClobesofthep18–Cdk6–K-cyclincomplexarerotatedby13°aboutanaxisthatpassesthroughthebackofthecatalyticcleftandisapproximatelyperpendiculartotheplaneoftheATPthatwouldbindthere.TherotationoftheNlobeandthePSTAIREhelixawayfromtheClobeisalsoassociatedwiththeTloopnotadoptingtheconformationneededforsubstratebindingandkinaseactivity.IntheCdk2–cyclinAcomplex,theTloopmakesmultiplecontactswiththePSTAIREhelix,thecyclin,andotherpartsoftheClobe.Asthesecontactswouldnotbepossibleinp18–Cdk6–K-cyclinbecauseofthemisalignmentofthelobesandPSTAIREhelix.目前二十頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點DespitetheoverallsimilaritiesintheNlobe-cyclininteractionsbetweentheinhibitedp18–Cdk6–K-cyclincomplexandtheactiveCdk2–cyclinAcomplex,thereisalargedifferenceinthepositionandorientationofthecyclinrelativetothekinaseClobe.WhenthetwocomplexesarecomparedbysuperimposingtheirCDKClobes,K-cyclinisrotatedby≈40°,anditscenterofgravityisshiftedby15?relativetocyclinA.ThisiscausedinpartbytherotationbetweenthekinaseNandClobesinp18–Cdk6–K-cyclinandinpartbytherotationofthePSTAIREhelixrelativetotheNlobe.TheshiftinK-cyclinleadstoalackofsignificantcontactsbetweenK-cyclinandtheClobeandTloopofCdk6(Fig.4B).IntheCdk2–cyclinAcomplex,thereareextensivecontactsbetweenthefirstcyclinrepeatandtheTloopandbetweentheN-terminalhelixandotherpartsoftheCdk2Clobe(Fig.4C;Jeffreyetal.1995).IntheinhibitedCdk6–K-cyclincomplex,therearenocontactswiththeTloopandonlyafewminorcontactswiththeClobe.目前二十一頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點ConformationofCdk6SchematicrepresentationofthedifferentconformationsoftheCDK.CDKsundergoextensiveconformationalchangesonbindingofactivatingorinhibitingsubunits.ThemajordeterminantsofactivityarethepositionsandconformationofthePSTAIREhelixandTloop,aswellastherelativedispositionofthekinaseNandClobes.ThePSTAIREhelixadoptsapositionfurtherawayfromthecatalyticcleftininactiveCDKs(labeledas‘out’)thaninactiveCDKs(‘in’).ThePSTAIREhelixconformationcorrelateswiththelocationofaconservedactivesiteresidue(Cdk2,Glu51;Cdk6,Glu61)eitherinsideoroutsidethecatalyticcleft.目前二十二頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點例二：肽與鈣調(diào)蛋白(Calmodulin)的結(jié)合鈣調(diào)蛋白是一個含有148個氨基酸殘基的鈣結(jié)合蛋白，它與鈣依賴性的信號通道的過程有關(guān)。鈣調(diào)蛋白可結(jié)合到多種蛋白中，像激酶鈣泵蛋白，以及一些運動性蛋白等，以調(diào)節(jié)這些蛋白的活性。這些蛋白的鈣調(diào)蛋白結(jié)合區(qū)域大約由20個相鄰的殘基組成，雖然它們的氨基酸順序變化很大，但它們都有形成α螺旋的強烈傾向，單個的和與多肽結(jié)合的鈣調(diào)蛋白的結(jié)構(gòu)表明，多肽的結(jié)合引起了鈣調(diào)蛋白分子中大的構(gòu)象變化。Calmodulin(CaM)(anabbreviationforCALcium-MODULatedproteIN)isacalcium-bindingproteinexpressedinalleukaryotic

cells.Itcanbindtoandregulateanumberofdifferentproteintargets,therebyaffectingmanydifferentcellularfunction.目前二十三頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點CaMmediatesprocessessuchasinflammation,metabolism,apoptosis,smoothmusclecontraction,intracellularmovement,short-termandlong-termmemory,nervegrowthandtheimmuneresponse.CaMisexpressedinmanycelltypesandcanhavedifferentsubcellularlocations,includingthecytoplasm,withinorganelles,orassociatedwiththeplasmaororganellemembranes.ManyoftheproteinsthatCaMbindsareunabletobindcalciumthemselves,andassuchuseCaMasacalciumsensorandsignaltransducer.CaMcanalsomakeuseofthecalciumstoresintheendoplasmicreticulum,andthesarcoplasmicreticulum肌漿網(wǎng).CaMundergoesaconformationalchangeuponbindingtocalcium,whichenablesittobindtospecificproteinsforaspecificresponse.CaMcanbinduptofourcalciumions,andcanundergopost-translationalmodifications,suchasphosphorylation,acetylation,methylationandproteolyticcleavage,eachofwhichhaspotentialtomodulateitsactions.Calmodulincanalsobindtoedemafactortoxinfromtheanthrax炭疽bacteria.目前二十四頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點與肽結(jié)合的鈣調(diào)蛋白的構(gòu)象變化(a)在自由狀態(tài)下鈣調(diào)蛋白是一個由兩個結(jié)構(gòu)域（紅色和綠色）組成的啞鈴狀分子。每個結(jié)構(gòu)域都有兩個與鈣結(jié)合的EF手（EF-hand）

(b)在結(jié)合肽的狀態(tài)，α

螺旋連接子α-helixlinker已被切開，分子的兩端緊靠在一起，并形成一個致密的球狀復合物。每個結(jié)構(gòu)域的內(nèi)核結(jié)構(gòu)基本上沒有變化，結(jié)合肽形成一段α螺旋，每個結(jié)構(gòu)域內(nèi)含有兩個EF手，每個EF手結(jié)合一個鈣離子。這兩個結(jié)構(gòu)域顯然在空間上是互相靠近的，并在α

螺旋連接子的兩端分開。當鈣調(diào)蛋白與它的配基結(jié)合時實際上僅有5個基團改變了構(gòu)象。這是α螺旋連接子中的5個保守殘基，這5個殘基發(fā)生了解旋并形成一個環(huán)區(qū)域，雖然在此環(huán)區(qū)域之后仍是一個α螺旋，但其方向發(fā)生了很大的變化。第二個螺旋以完全不同的取向與第一個螺旋靠近多肽，構(gòu)象如此小的局部變化引起了如此大的結(jié)構(gòu)域之間的變化，這是由配基引起蛋白變化的最大的一種蛋白。目前二十五頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點Thereare4helix-loop-helix(EF-hand)motifs目前二十六頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點Uponbindingofsometargetsequencestocalmodulin,thetwodomainscometogethertoformahydrophobicchannelCalmodulinisonlyactivewhenallfoursitesarefilled.

ThebindingofthefourCa++ionsiscooperative

目前二十七頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點Mechanism:CalciumisboundviatheuseoftheEFhandmotif,whichsuppliesanelectronegativeenvironmentforioncoordination.Aftercalciumbinding,hydrophobic

methylgroupsfrommethionineresiduesbecomeexposedontheproteinviaconformationalchange.Thispresentshydrophobicsurfaces,whichcaninturnbindtoBasicAmphiphilic兩性的Helices(BAAhelices)onthetargetprotein.Thesehelicescontaincomplementaryhydrophobicregions.TheflexibilityofCalmodulin'shingedregionallowsthemoleculeto"wraparound"itstarget.Thispropertyallowsittotightlybindtoawiderangeofdifferenttargetproteins.

目前二十八頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點CalmodulinwrapsaroundatargetdomainofsomeproteinsonlyafterbindingCa++.Otherproteinshaveboundcalmodulinaspartoftheirquaternarystructure,evenintheabsenceofCa++.Ineithercase,aconformationalchangeinducedbybindingofCa++tocalmodulinalterstheactivityofthetargetprotein.目前二十九頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點CAMishighlyconservedacrossalleukaryotes目前三十頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點Onceinthecytosol,theCa++typicallybindstoasmallprotein,calmodulin.Once

fourCa++bindtocalmodulin,itactivatesspecificproteinsinsidethecell,sucharecertainproteinkinases.目前三十一頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點目前三十二頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點Ca2+-independentbindingofcalmodulintoitstargetproteins

bycontrast,usesaconsensussequence(IQxxxRGxxxR)calledanIQmotif.SomeproteinsbindcalmodulinthroughtheirIQmotifsatlowconcentrationsofCa2+.AsubsequentincreaseintheCa2+concentrationinducesaconformationalchangeintheboundcalmodulin,regulatingtheactivityofthetargetprotein.

HowdoesCalmodulinbindtoproteins?目前三十三頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點AtransformationofthecorrespondingIQ12regionofscallopmusclemyosin-II.Martin&Bayley,2002.

目前三十四頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點Diseasestatescharacterizedbyunregulatedgrowth,suchascancer,arecorrelatedwithelevatedlevelsofCa++-boundCaMSomeAnti-calmodulinDrugsCAM’shydrophobicsurfacecanbinddifferentaromaticmolecules目前三十五頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點Calmodulin1(phosphorylasekinase)isaproteinthatinhumansisencodedbytheCALM1

gene.Calmodulin1isthearchetypeofthefamilyofcalcium-modulated(calmodulin)proteinsofwhichnearly20membershavebeenfound.Theyareidentifiedbytheiroccurrenceinthecytosoloronmembranesfacingthecytosolandbyahighaffinityforcalcium.Calmodulincontains148aminoacidsandhas4calcium-bindingmotifs.Itsfunctionsincluderolesingrowthandthecellcycleaswellasinsignaltransductionandthesynthesisandreleaseofneurotransmitters.Calmodulin1hasbeenshowntointeractwithAKAP9,3TRPV1,4Androgenreceptor,5IQGAP167andPPEF1Calmodulin2

(phosphorylasekinase)isaproteinthatinhumansisencodedbytheCALM2

gene,CALM2hasbeenshowntointeractwithAKAP9Calmodulin3(phosphorylasekinase)isaproteinthatinhumansisencodedbytheCALM3

gene

Calmodulin-likeprotein1Calmodulin-likeprotein2Calmodulin-likeprotein3Calmodulin-likeprotein4Calmodulin-likeprotein5Calmodulin-likeprotein6

目前三十六頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點例三：Serpin抑制絲氨酸蛋白酶的作用

α1抗胰蛋白酶屬于在血漿中發(fā)現(xiàn)的絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的成員，統(tǒng)稱叫作Serpin。該家族的其它成員是抗凝血酶(antithrombin)和血漿酶原激活子抑制劑(PlasminogenActivatorInhibitor,PAI)，兩者都是血液凝集連鎖反應的調(diào)節(jié)子。所有的Serpin分子都是同源的，且都有非常相似的三維結(jié)構(gòu)。這些Serpin分子在各種不同狀態(tài)下的一般折疊是相同的，但是柔性環(huán)區(qū)域的位置則變化很大。目前三十七頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點卵白蛋白的Serpin折疊由三個反平行的β

折疊AB和C構(gòu)成。紅色區(qū)域是Serpin相應的活性部位，該部分像一個結(jié)構(gòu)的把手一樣穿出卵白蛋白，可把非切斷形式的卵白蛋白結(jié)構(gòu)考慮為規(guī)范的Serpin的結(jié)構(gòu)。β

折疊片A(β-sheetA)有五段β

鏈，柔性的環(huán)區(qū)域起始于β折疊片A的鏈5的末端，然后形成一段位于分子頂端的α螺旋，并靠近β

折疊片C的邊緣，最終在β折疊片B的起始鏈結(jié)束。目前三十八頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點三種狀態(tài)下活性部位環(huán)區(qū)域紅色的圖解活性形式下，環(huán)區(qū)域從分子的主要部分穿出，與絲氨酸蛋白酶的活性部位發(fā)生作用(b)作為抑制蛋白酶的結(jié)果，Serpin分子在環(huán)區(qū)域的活性部位的尖端被切斷，被切斷的形式中環(huán)區(qū)域的N端把它自己插入到β5和β15之間，并在β折疊片的中部形成一條長的β

鏈（紅色）。(c)在最穩(wěn)定的狀態(tài)（潛伏態(tài)），該形式是無活性的。環(huán)區(qū)域的N端部分形成一個被插入的β

鏈，其余的殘基在β

折疊片的另一端形成一個環(huán)區(qū)域。進一步說，在環(huán)區(qū)域中沒有任何α螺旋延伸到分子主體的外部，以準備插入到凝血酶的活性部位。目前三十九頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點活性形式到隱性形式(latentform)的轉(zhuǎn)變包含了結(jié)構(gòu)中由一個環(huán)轉(zhuǎn)變?yōu)橐欢伍L的β

鏈插入到β折疊片的中間。為了使得這種結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變得以實現(xiàn)，在β

折疊片中的相鄰的β

鏈首先必須要被分開以允許新的β鏈的插入，這牽涉到在一個穩(wěn)定的β

折疊片中的兩條相鄰的β鏈之間的氫鍵的斷裂和分子內(nèi)部的疏水堆積的接觸相互作用的改變。當新的β

鏈插入以后，形成新的氫鍵和疏水堆積相互作用，這種在β

結(jié)構(gòu)中的主要變化，在serpin結(jié)構(gòu)被測定之前，是人們所預料不到的，在許多其它的系統(tǒng)中也沒有觀察到這種現(xiàn)象。肺氣腫(emphysema)的發(fā)生常常是與serpin抗胰蛋白酶的專一性突變相關(guān)的。突變的serpin分子在肝內(nèi)產(chǎn)生聚集，引起血漿中的抗胰蛋白酶的缺乏，進而造成肺中的彈性蛋白(elastin)纖維被彈性蛋白酶的酶解的增加。研究表明serpin在胞內(nèi)聚集的形成，是由于突變的抗胰蛋白酶的折疊速度極慢，導致折疊中間物的累積形成聚集。這是不完全折疊或錯誤折疊的分子導致病變或嚴重疾病的一個例子。通過對這些由蛋白質(zhì)分子的折疊和錯誤折疊過程的了解，人們可以進行相應的藥物設(shè)計去治療這些疾病。目前四十頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點例四：分子的R態(tài)和T態(tài)間的別構(gòu)蛋白效應子分子開關(guān)早在1963年J.Monod,J.-P.Changeaux和F.Jacob就提出了別構(gòu)控制的理論。該別構(gòu)控制的理論提供了對于象酶的反饋抑制配基與蛋白的協(xié)同性結(jié)、氧與血紅蛋白的結(jié)合等的分子間相互作用的理論依據(jù)。別構(gòu)理論有下列主要的特性：由別構(gòu)效應子分子作用造成的協(xié)同底物結(jié)合和蛋白活性修飾與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的兩個或多個構(gòu)象態(tài)相關(guān)，底物和效應子在蛋白質(zhì)的不同部位上結(jié)合，因此兩者沒有立體化學的關(guān)系，因而被稱之為別構(gòu)（不同的形狀）。別構(gòu)理論預測出這些蛋白是由幾個對稱排列的亞基組成的，兩種態(tài)之間是由于亞基的排列不同和它們之間的鍵的數(shù)目不同。一種態(tài)是亞基由強鍵所限制，這樣就不能滿足與底物結(jié)合所需要的結(jié)構(gòu)變化，與底物的結(jié)合能力弱，稱作Tense(T)態(tài)，另外一種態(tài)與之相反稱作Relaxed(R)態(tài)。目前四十一頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點一致性模型(concertedmodel)的模型，進一步假定分子的對稱是守恒的，因此所有的亞基的活性要么是同等地低或者是同等地高，即所有的結(jié)構(gòu)變化是一致的。連續(xù)模型(sequentialmodel)。該模型認為在結(jié)構(gòu)中每個亞基可獨立地在底物的結(jié)合部位變化，它的三級結(jié)構(gòu)在此模型中亞基與它的結(jié)合配基的三級結(jié)構(gòu)變化改變了這個亞基和與它相鄰的亞基的相互作用，進而導致另一個亞基的活性部位的變化。例如由配基對酶的結(jié)合引起酶的構(gòu)象變化使酶由非活性狀態(tài)變?yōu)橛谢钚?。別構(gòu)效應模型目前四十二頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點磷酸果糖激酶(Phosphofructokinase,PFK)的別構(gòu)效應磷酸果糖激酶是糖酵解路徑中的一個關(guān)鍵的調(diào)節(jié)酶，它使葡萄糖分解以產(chǎn)生ATP。該酶催化糖酵解路徑中果糖-6-磷酸,F6P

的ATP磷酸化生成果糖-1,6-二磷酸的前期步驟。磷酸果糖激酶可被糖酵解途徑中最后一步所產(chǎn)生的產(chǎn)物-磷酸烯醇丙酮鹽酸(phosphoenolpyruvate,PEP)所抑制，也可被PEP的類似物，例如2-磷酸羥乙酸鹽(phosphoglycolate)所抑制一個四聚體的大腸桿菌的PFK的每個亞由320個氨基酸組成，排列為兩個結(jié)構(gòu)域：一個大結(jié)構(gòu)域一個小結(jié)構(gòu)域這兩個結(jié)構(gòu)域都有一個α/β

結(jié)構(gòu)。從多肽鏈的氨端到羧端，螺旋被標記為從A到M，β

鏈標記為1到11。底物和效應子分子的結(jié)合部位以灰色標記。一個亞基的效應子部位通過螺旋F和鏈6之間的6-F環(huán)連接到二體的另一個亞基的活性部位。亞基被配對連接為兩個二體。目前四十三頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點磷酸果糖激酶的四級結(jié)構(gòu)及其相互作用(a)四個亞基配對排列為兩個二體A-B(藍色)和C-D(紅色或綠色)，二體內(nèi)的亞基相互用緊密，而兩個二體之間互相緊密地堆積在一起。在R態(tài)和T態(tài)時的二體堆積相互作用有差異，在R態(tài)(紅色表示的C-D二體)和T態(tài)(綠色)下二體的相對取向轉(zhuǎn)動了7°。(b)在T態(tài)，二體緊密地堆積在一起并，且在兩條β

鏈之間有直接的氫鍵，兩條β鏈一條來自于A-B二體(藍色)，另一條來自于C-D二體(綠色)，氫鍵以黃色表示。(c)在R態(tài)，二體被分開在兩條β鏈之間形成了一個裂縫，縫內(nèi)由水分子所充滿(紅色)這些水分子在二體之間形成氫鍵水橋，把來自于兩個二體的兩條β

鏈連接起來。目前四十四頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點磷酸果糖激酶活性部位的構(gòu)象變化(a)在活性R態(tài)底物果糖-6-磷酸,F6P(紅色)與小α

螺旋(橙色)上精氨酸殘基Arg162形成鹽橋，此鹽橋啟動底物與酶的結(jié)合。(b)在非活性的T態(tài)，螺旋被部分地解旋并改變了取向。Arg162遠離底物的結(jié)合部位，一個負電荷的谷氨酸殘基Glu161指向底物分子的磷酸結(jié)合部位，Glu161的負電荷與F6P磷酸基團之間的斥力阻止了結(jié)合導致了親和力。與活性R態(tài)相比下降了數(shù)千倍。目前四十五頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點Monod的理論：四聚體的酶以平衡的形式存在于催化活性的R態(tài)和非活性的T態(tài)之間。在這兩種態(tài)中亞基的三級結(jié)構(gòu)有差異，與分子的四級結(jié)構(gòu)的差異也密切相關(guān)。底物F6P偏好地與R態(tài)結(jié)合因此將此平衡向位移到R態(tài)，由于一致性的機理，一個F6P與第一個亞基的結(jié)合提供了使另外三個亞基向R態(tài)的平衡，因此具有了F6P結(jié)合和催化的協(xié)同性。ATP與兩種態(tài)都可結(jié)合，所以不會使平衡產(chǎn)生位移，因此也就沒有ATP結(jié)合的協(xié)同性。抑制劑PEP偏好地與T態(tài)形式的分子的效應子結(jié)合部位結(jié)合，結(jié)果平衡被推向非活性的一邊；相反激活子ADP偏好地與R態(tài)形式的效應子結(jié)合部位結(jié)合，導致平衡被推向活性的R態(tài)一邊。目前四十六頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點1酶由四個相同的亞基組成，每個亞基有一個與配基的結(jié)合位點2亞基能夠打開和關(guān)閉兩個處于平衡的固有的構(gòu)象態(tài)R態(tài)和T態(tài)3在每個四體分子中的這些態(tài)之間的轉(zhuǎn)換是一致的，即每個分子中的四個亞基處于相同的狀態(tài)或者R態(tài)或者T態(tài)4兩態(tài)對ATP有著相同的親和性，但對底物F6P別構(gòu)效應子ADP和抑制劑PEP的親和性則不同，由于這些親和性的差異，配基結(jié)合能夠使R態(tài)和T態(tài)之間平衡產(chǎn)生位移，朝哪個方向位移取決于與什么樣的配基結(jié)合。作業(yè)：磷酸果糖激酶(Phosphofructokinase,PFK)和底物復合物的結(jié)構(gòu)并闡明其功能目前四十七頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能1,Somefundamentalconcepts2,thestructureandfunctionofmyoglobinandhemoglobin目前四十八頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點Amoleculeboundreversiblybyaproteiniscalledaligand.Aligandmaybeanykindofmolecule,includinganotherprotein.Aligandbindsatasiteontheproteincalledthebindingsite,whichiscomplementarytotheligandinsize,shape,charge,andhydrophobicorhydrophiliccharacter.Themoleculesacteduponbyenzymesarecalledreactionsubstratesratherthanligands,andtheligand-bindingsiteiscalledcatalyticsiteoractivesiteThebindingofaproteinandligandisoftencoupledtoaconformationalchangeintheproteinthatmakesthebindingsitemorecomplementarytotheligand,permittingtighterbinding.Thestructuraladaptationthatoccursbetweenproteinandligandiscalledinduced(誘導契合）.目前四十九頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點KahasunitsofM-1,ahighervalueofKacorrespondstoahigheraffinityoftheLigandfortheprotein目前五十頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點目前五十一頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點目前五十二頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點Kdisequivalenttothemolarconcentrationofligandatwhichhalfoftheavailableligandbindingsitesareoccupied.Theproteinissaidtohavereachedhalf-saturationwithrespecttoligandbiending目前五十三頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點目前五十四頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點Thefamilyofglobin(珠蛋白):肌紅蛋白:myoglobin-oxygenstorageprotein血紅蛋白:hemoglobin-oxygentransportprotein

(twocopiesofeachαglobinandβglobinincomplexwith4hemes)目前五十五頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點Roleoftheglobinsinoxygentransportandstorage.hemoglobinmyoglobin目前五十六頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點Heme(血紅素）目前五十七頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點ThestructuresofporphyrinsHemeisfoundinanumberofoxygen-transportingproteins,suchastheCytochromesthatparticipateinoxidation-reductionreaction目前五十八頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點Myoglobin目前五十九頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點ThestructureofmyoglobinMyoglobin(Mr16,700)isasinglepolypeptideof153aminoacideresidueswithonemoleculeofheme.Thepolypeptideismadeupof8αhelicalsegmentsconnectedbyBends.About78%oftheaminoacideresiduesarefoundintheseαhelices.8αhelicalsegmentsarenamedA-HHis93(HisF8)coordinatedtotheHemegroupThebendsaredesignatedAB,CD,EF,FGThehemeisboundinapocketmadeupLargelyofEandFhelices,althoughAminoresiduesfromothersegmentsofTheproeinalsoparticipate目前六十頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點目前六十一頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點Thestructureofmyoglobin目前六十二頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點目前六十三頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點Thestructureofmyoglobin目前六十四頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點OxygenbindstohemewiththeO2axisatanangle,abindingconformationreadilyaccommodatedbymyoglobin.(b)CarbonmonoxidebindstofreehemewiththeCOaxisperpendiculartotheplaneoftheporphyrinring.Whenbindingtothehemeinmyoglobin,COisforcedtoadoptaslightanglebecausetheperpendiculararrangementisstericallyblockedbyHisE7,thedistalHis.ThiseffectweakensthebindingofCOtomyoglobin.(c)Anotherview(derivedfromPDBID1MBO),showingthearrangementofkeyaminoacidresiduesaroundthehemeofmyoglobin.TheboundO2ishydrogen-bondedtothedistalHis,HisE7(His64),furtherfacilitatingthebindingofO2.目前六十五頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點DynamicsofoxygenreleasebymyoglobinThebendingofO2tothehemeinmyoglobindependsonmolecularmotion,or“breath”inproteinstructure.OnemajorrouteisprovidedByrotationofthesidechainofdistalHis(His64).Therate-limitingprocessinoxygenreleaseistheopeningofapathwayfortheO2moleculetoescapefromthehemepocket.Oxygenmayspendtime"rattlinginitscage"-andperhapsbeingrecaptured-beforethetertiarystructureofthemyoglobinshiftsenoughtoletitescape

目前六十六頁\總數(shù)一百一十二頁\編于二十點HemoglobinHemoglobin(Mr64,500)isatetramericproteinContainingfourhemegroups,oneassociatedwitheachpolypeptidechain.AdulthemoglobincontainsTwotypesofglobin,twocchains(141residues)andtwoβchains(146residues).Fewerthanhalfoftheaminoacideresiduesin