生物技術制藥第四章抗體制藥

第一節(jié)概述在免疫學發(fā)展的早期人們應用細菌或其外毒素給動物注射，經一定時期后用體外實驗證明在其血清中存在一種能特異中和外毒素毒性的組分稱之為抗毒素，或能使細菌發(fā)生特異性凝集的組分稱之為凝集素。其后將血清中這種具有特異性反應的組分稱為抗體（antibody,Ab）,而將能刺激機體產生抗體的物質稱之為抗原（antigen,Ag）。由此建立了抗原與抗體的概念。目前一頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點

一.抗體工程與抗體藥物

1890年Behring和北里柴三郎發(fā)現(xiàn)白喉抗毒素,建立了血清療法,開創(chuàng)了抗體制藥。這是在血清中發(fā)現(xiàn)的第一種抗體。這種含有抗體的血清稱之為免疫血清。

1937年Tiselius用電泳法將血清蛋白分離為白蛋白、α、β、γ球蛋白，并證明抗體活性主要存在于γ球蛋白組分。

目前二頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點

抗體是指能與相應抗原特異性結合具有免疫功能的球蛋白。

抗體的產生：機體免疫系統(tǒng)受抗原刺激后，B淋巴細胞被活化增殖和分化為漿細胞，由漿細胞合成和分泌的球蛋白。目前三頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點20世紀60年代發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤是漿細胞癌變形成的惡性增殖性疾病。病人血清中出現(xiàn)同抗體結構類似的球蛋白，統(tǒng)稱為免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。所以Ig是化學結構的概念，而抗體是生物學功能的概念，所有抗體都是Ig，但并非所有Ig都是抗體。。目前四頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點抗體與細菌、病毒或毒素等抗原結合，通過下列3中或其中一種方式綜合和除去有害物質：1.直接使抗原失去活性2.使免疫效應細胞將其吞噬并加以破壞3.使抗原表面弱化從而易于受補體破壞目前五頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig）破傷風毒素目前六頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點免疫球蛋白抗體分子（antibody,Ab）是由漿細胞合成和分泌的，而每一種漿細胞克隆可以產生一種特異的抗體分子，所以血清中的抗體是多種抗體分子的混合物，它們的化學結構是不均一的，而且含量很少，不易純化，是抗體分子結構分析的困難。多發(fā)性骨髓瘤是由漿細胞無限增殖形成的細胞克隆，由于所有瘤細胞的遺傳特性相同，因此它們合成和分泌的蛋白質分子在化學結構上是均一的。這種蛋白分子存在于血液中的稱為骨髓瘤蛋白（meylomaprotein,M）或M蛋白，亦可在尿液中發(fā)現(xiàn)稱為本周蛋白(BenceJones,BJ)。由于骨髓瘤蛋白（M蛋白）是均一性球蛋白分子，并證明本周蛋白（BJ）是Ig分子的L鏈，很容易從患者血液和尿液中分離純化這種蛋白，并可對來自不同患者的標本進行比較分析，使得對Ig分子結構、理化性質、抗原性、生物學活性以及其基因結構等方面的研究者有了重大突破。目前七頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點定義免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）即抗體（antibody，Ab）是血液和組織液中一類糖蛋白，由B細胞接受抗原刺激后增殖分化為漿細胞所產生，使體液免疫的重要效應分子目前八頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點1890年，Behring和北里在德國Koch實驗室從豚鼠體內發(fā)現(xiàn)了第一種抗體：

白喉抗毒素，從而挽救了成千上萬的白喉患兒。從60%死亡率降到26%。獲1901年的第一屆諾貝爾獎Ab的發(fā)現(xiàn)：目前九頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點早在40年代初期Tiselius和Kabat就證實了抗體活性與血清丙種球蛋白組分相關。他們用肺炎球菌多糖免疫家兔，可獲得高效價免疫血清。然后加入相應抗原吸收以除去抗體，將去除抗體的血清進行電泳圖譜分析，發(fā)現(xiàn)丙種球蛋白（γ-G）組分明顯減少，從而證明了抗體活性是存在于丙種球蛋白內。目前十頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點抗體與免疫球蛋白的發(fā)現(xiàn)（1939TiseliusandKabat）ImmuneseraNormalsera

γ球蛋白=丙種球蛋白=抗體分子目前十一頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點免疫球蛋白的存在形式分泌型Ig（secretedIg，sIg）主要存在于血液和組織液中，發(fā)揮各種免疫功能膜型Ig（membraneIg，mIg）位于B細胞膜上，構成B細胞表面的抗原受體目前十二頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點Ig分子基本結構是由四條肽鏈組成的，包括二條較小的輕鏈和二條較大的重鏈，輕鏈與重鏈之間是由二硫鍵連接形成Ig分子單體，分為氨基端（N端），羧基端（C端）。免疫球蛋白的結構N端C端目前十三頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點目前十四頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點重鏈（heavychain，H鏈）450-550個氨基酸殘基組成，分子量50-75KD，含糖數(shù)量不同，4-5個鏈內二硫鍵。根據(jù)H鏈恒定區(qū)抗原性的差異可將其分為5類，μ、γ、α、δ、ε鏈，相應的免疫球蛋白分別稱為：IgM，IgG，IgA，IgD和IgE。同一類Iｇ的鉸鏈區(qū)氨基酸組成和重鏈二硫鍵的數(shù)目、位置也不同，據(jù)此可對同類Iｇ分為不同的亞類：IgG1-IgG4；IgA1,IgA2。重鏈和輕鏈目前十五頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點目前十六頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點輕鏈（lightchain，L鏈）214個氨基酸殘基組成，通常不含碳水化合物，分子量為25KD，有兩個由鏈內二硫鍵組成的環(huán)肽，L鏈可分為：Kappa（κ）與lambda（λ）2個亞型。每一輕鏈上的型別只能屬于兩型別中的某一型別,而不能兩者兼而有之,亦即屬于Kappa型或是Lambda型，而不能有Kappa-Lambda型者。λ鏈恒定區(qū)個別氨基酸的差異可分亞型：λ1－λ4目前十七頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點Kappa型和Lambda型的不同主要表現(xiàn)在氨基酸序列和二硫鏈位置的不同。但是，不同種屬的Kappa型或Lambda型之間有較大的相似性，不同種屬的Kappa/Lambda的比值并不相同，一般Kappa和Lambda型與重鏈配對有同樣的可能性，但從某些種屬基因表達的研究得知，Kappa基因的重排較先發(fā)生于Lambda基因，這可能也是Kappa型出現(xiàn)較多和重鏈配對的另一原因。目前十八頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點κ和λ的比例異?？赡芊从趁庖呦到y(tǒng)的異常。正常人血清中，65%的輕鏈為Kappa型，35%為Lambda型，大約比例為2：1(Kappa/Lambda=1.9±0.36)

Kappa/Lambda的比率對于不同類型的免疫球蛋白略有不同，如IgG的比值為2。這個比率也隨不同年齡階段的人群而有所改變，同時有人種和地區(qū)差異。但對于正常人這個比率基本恒定。在漿細胞瘤中由于一個漿細胞惡性增殖，使Kappa或Lambda含量迅速發(fā)生變化，比率改變，這可以用來鑒別Kappa型或Lambda型骨髓瘤。B細胞在免疫應答中被激活化為漿細胞，每一種漿細胞只分泌一種類型的抗體，即一個型，一個亞型，一個基因型的抗體。正常人免疫球蛋白的重鏈和輕鏈所含氨基酸數(shù)量差別很大，合成時間也不同：合成一條重鏈需十八分鐘，而合成一條輕鏈只需十分鐘。所以正常的免疫球蛋白合成會造成輕鏈過剩，多余的輕鏈運輸?shù)侥I臟，10%被分解，80%重吸收，另外的10%從尿中排出。目前十九頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點在免疫球蛋白合成異常激活時，重鏈和輕鏈的合成速度迅速提高，合成一條重鏈約需2.5min;而合成一條輕鏈需1min，從而使得輕鏈的過剩更加嚴重,尿蛋白排出增加可達到1mg/ml,且都為一個輕鏈型,從而使Kappa/Lambda比率遠大于或小于2。輕鏈的異常表達和臨床?。憾嗫寺≡鲋澈土夹悦庖咔虻鞍自鲋嘲Y多克隆增殖有兩種含義:

a.五種免疫球蛋白含量的全面上升;

b.雖只有一種免疫球蛋白上升但這種免疫球蛋白的Kappa/Lambda的比例正常,為1/2。

以上兩種增殖都是出現(xiàn)輕鏈的增加，可以達到200ug/ml.可用常規(guī)方法檢測，但Kappa/Lambda比值不變。目前二十頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點目前二十一頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點可變區(qū)和恒定區(qū)可變區(qū)（Variableregion，V區(qū)）：

免疫球蛋白輕鏈和重鏈中靠近N端約 110氨基酸序列變化較大的區(qū)域稱為

可變區(qū)。VH和VL可變區(qū)（V區(qū)）位于Ig分子的N端，約占輕鏈的l/2（VL）和重鏈（VH）的1/4或l/5；它決定了抗體與抗原結合的特異性；在VL和VH中某些局部區(qū)域的氨基酸組成與排列具有更高的變化程度，此為高變區(qū)（hypervariableregion,HVR）；高變區(qū)即是抗體與抗原（決定簇）特異性結合的位置，又稱為互補決定區(qū)（complementarity-determiningregion,CDR）；在V區(qū)中非HVR部位的氨基酸組成和排列相對比較保守，稱為骨架區(qū)（frameworkregion）。

目前二十二頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點VH和VL各有3個區(qū)域的氨基酸組成和排列順序高度可變，稱為高變區(qū)（HVR）或互補決定區(qū)（complementarity-determiningregion,CDR）高變區(qū)為抗體與抗原的結合位置，VL和VH的HVR1，HVR2，HVR3又分別稱為CDR1，CDR2，CDR3，其中CDR3具有更高的高變程度，H鏈在與抗原結合中起重要的作用。在V區(qū)中，CDR之外區(qū)域的氨基酸組成和排列順序相對不易變化，稱為骨架區(qū)（frameworkregion,FR）。目前二十三頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點醫(yī)學免疫學上海第二醫(yī)科大學免疫教研室目前二十四頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點目前二十五頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點恒定區(qū)（constantregion，C區(qū)）：靠近C端氨基酸序列相對穩(wěn)定的區(qū)域，L鏈C端1/2處，105個氨基酸，H鏈C端3/4處，331-431個氨基酸。CH和CL在同一種屬動物中是比較恒定的，是制備第二抗體進行標記的重要基礎。不同類IｇCH的長度不一同一種屬的個體，所產生針對不同抗原的同一類別Iｇ，其C區(qū)氨基酸組成和排列順序比較恒定，其免疫原性相同，但V區(qū)不同。目前二十六頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點鉸鏈區(qū)（hingeregion）:

位于CH1和CH2之間，包括重鏈鏈間二硫鍵，含有豐富的脯氨酸（構成膠原纖維的重要成分）。具有柔曲性，不形成螺旋，可以伸展、彎曲和轉動。有利于與不同距離的抗原表位結合，又有利于暴露抗體分子的補體結合點，同時對蛋白酶敏感，Ig被水解易在此區(qū)發(fā)生裂解。易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等酶水解IｇM和IｇE無鉸鏈區(qū)目前二十七頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點Flexibilityofimmunoglobulins目前二十八頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點目前二十九頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點鏈內二硫鍵折疊成球形區(qū)稱為結構域或功能區(qū)（domain），約由110個氨基酸組成。L鏈功能區(qū)：2個，（VL，CL各一個）H鏈功能區(qū)：IgG，IgA，IgD，4個（V區(qū)1個，C區(qū)3個）,IgM，IgE，5個（V區(qū)1個，C區(qū)4個）免疫球蛋白超家族（IｇSF）結構域目前三十頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點免疫球蛋白的功能區(qū)構成:Ig分子每一肽鏈內部由大約110個氨基酸形成一個亞單位，氨基酸的序列具有相似性或同源性，其內由鏈內二硫鍵構成肽環(huán)，稱為功能區(qū)。功能：（1）VL和VH是與抗原結合的部位；

（2）CH和CL具有某些同種異型（allotype）的遺傳標記；

（3）IgG的CH2和IgM的CH3具有補體結合位點→啟動補體經典激活途徑；（4）IgG可通過胎盤；（5）IgG的CH3和IgE的CH4可與多種細胞膜表面的FcR結合，介導不同生物學效應。目前三十一頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點目前三十二頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點免疫球蛋白的基本結構目前三十三頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點J鏈與分泌片

J鏈（joiningchain）：是一富含半胱氨酸的多肽鏈，由漿細胞合成，存在于IgA，IgM中，在其組成和體內轉運中具有一定作用，穩(wěn)定多聚體。

分泌成分（secretorycomponent，SC）：分泌成分是IgA上的一個輔助成分，由粘膜上皮細胞合成，并在IgA二聚體形成后通過二硫鍵連接到免疫球蛋白分子上，分泌至粘膜表面。穩(wěn)定分泌型IgA的結構，對抵抗外分泌液中的蛋白水解酶的降解具有重要作用，使之避免蛋白酶的消化水解。目前三十四頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點目前三十五頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點免疫球蛋白的水解片段鉸鏈區(qū)有蛋白水解酶的酶切位點。木瓜蛋白酶在重鏈間二硫鍵的N端將其裂解成分子量基本相等的三個片段：2個Fab和1個Fc片段。Fab能夠與抗原結合，稱為抗原結合片段（Fab），F(xiàn)c能夠與細胞表面的Fc受體結合。Fc具有免疫原性和抗原性。因它容易形成結晶，故稱為可結晶片段（Fc）。目前三十六頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點胃蛋白酶在重鏈間二硫鍵的羧基端將其裂解成分子量兩個不同的片段：一個由兩個V區(qū)連在一起的大片段F（abˊ）2和一些Fc裂解的小碎片pFcˊ。pFcˊ分子量小，喪失免疫原性。F（abˊ）2片段為雙價，可同時結合兩個抗原表位，發(fā)生凝集和沉淀反應。F（abˊ）2片段廣泛應用于生物制品目前三十七頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點目前三十八頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點重鏈C區(qū)分類輕鏈C區(qū)分型鉸鏈區(qū)氨基酸組成和重鏈二硫鍵分亞類免疫球蛋白的類型：類、亞類、型、亞型CCVV輕鏈C區(qū)N端氨基酸的差異分亞型目前三十九頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點免疫球蛋白的血清型用Ig免疫異種動物、同種異體或在自身體內可激發(fā)機體的特異性免疫應答，產生相應的抗體，用血清學的方法可以測定和分析Ig的抗原性，稱此為Ig的血清型目前四十頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點免疫球蛋白的血清型同種型（isotype）同一種屬每個個體都具有的免疫球蛋白的抗原特異性，其抗原決定簇主要存在于Ig的C區(qū)。為種屬型標志。同種異型（allotype）同一種屬不同個體之間免疫球蛋白也具有的差異性，主要反映在C區(qū)和V區(qū)上的一個或數(shù)個氨基酸的差異。為個體型標志。目前四十一頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點獨特型（idiotype,Id)：同一種屬、同一個體來源的抗體分子，主要由于其CDR區(qū)的氨基酸序列的不同，可顯示不同的免疫原性，稱為獨特型，是每個免疫球蛋白分子所特有的抗原特異性標志。目前四十二頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點目前四十三頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點免疫球蛋白的生物學活性V區(qū)的功能抗體與抗原的特異性結合：刺激抗體產生的物質為抗原，抗體分子只與其相應的抗原發(fā)生結合稱為特異性結合。例如，白喉抗毒素只能中和白喉桿菌外毒素，而不能中和破傷風外毒素，反之亦然。目前四十四頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點中和病毒、外毒素、介導抗原清除目前四十五頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點C區(qū)的功能激活補體 IgM、IgG1~3

激活補體經典途徑

凝聚的IgA或IgG4

激活補體替代途徑細胞親嗜性（IｇG和IｇE）調理作用（opsonization）：抗體IgG的Fc段與中性粒細胞上的IgGFc受體結合，從而增強吞噬細胞的吞噬作用ADCC(抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用):具有殺傷活性的細胞如NK細胞通過其表面表達的Fc受體識別結合于靶抗原上的抗體Fc段，直接殺傷靶抗原；介導I型超敏反應穿過胎盤和粘膜目前四十六頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點目前四十七頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點目前四十八頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點IgG類抗體與靶細胞表面抗原特異性結合，效應細胞（NK細胞、巨噬細胞、中性粒細胞）借助所表達的IgGFcR與靶細胞表面IgG的Fc段結合，從而直接殺傷靶細胞。目前四十九頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點五類免疫球蛋白的特性與功能目前五十頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點五類免疫球蛋白的特性與功能IgG血清中含量最高，約占血清Ig總量的80%4個亞類（IgG1，IgG2，IgG3和IgG4）出生后3個月開始合成，3~5歲接近成人水平半衰期最長（20－23天），親和力高，是再次免疫應答的效應分子，是最重要的抗感染性抗體通過胎盤（是唯一能夠通過胎盤的抗體：新生兒抗感染中發(fā)揮重要作用）目前五十一頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點生物學活性：通過胎盤（新生兒抗感染）；激活補體（裂解細胞）；

調理作用（促進吞噬）；介導ADCC（細胞毒作用）。實際意義：

a.抗感染；

b.自身抗體自身免疫??；

c.介導變態(tài)反應(II、III型)；

d.封閉抗體腫瘤細胞逃逸；

e.親合層析法IgG純化；

f.免疫學檢測。

目前五十二頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點五類免疫球蛋白的特性與功能IgM分子量最大（五聚體結構），又稱巨球蛋白，有10個抗原結合點。占血清Ig含量的5～10%膜性IgM（serfaceIgM，sIgM）是單體結構，它是B細胞抗原受體（BCR）是在個體發(fā)育過程和免疫應答過程中出現(xiàn)最早的抗體（可用于感染的早期診斷），臍帶血或新生兒血清中IgM水平升高表明胎兒有宮內感染是天然血型抗體。半衰期:5天

血清中特異性IgM水平增高提示有近期感染初次免疫應答的主要效應分子。目前五十三頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點目前五十四頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點五類免疫球蛋白的特性與功能IgA有兩型：血清IgA（單體）和分泌型IgA（二聚體）分泌型IgA是人體外分泌液中的主要抗體。由黏膜相關淋巴組織（MALT）產生，對防御病原微生物入侵起重要作用，是局部反應性抗體。新生兒sIgA合成不足嬰兒可從母乳中獲得半衰期:6天；占血清Ig含量的5～15%；聚合IgA激活補體替代途徑。目前五十五頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點五類免疫球蛋白的特性與功能IgD

血清IgD含量極低。膜性IgD存在于成熟B細胞表面，因此，它是成熟B細胞的主要標志。它也是B細胞抗原受體（BCR）；占血清Ig含量的1%；半衰期:3天。IgE血清中含量最低的抗體(占Ig的0.002%)，半衰期:3天；呼吸道和胃腸道漿細胞產生。能與肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面的IgE-Fc受體結合，介導Ⅰ型超敏反應。與抗寄生蟲感染有關，過敏性疾病和某些寄生蟲感染患者血清中特異性IgE水平增高。目前五十六頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點人工制備抗體多克隆抗體（polyclonalantibodies,pAb）：第一代抗體，是指由多克隆B細胞群產生的、針對多種抗原決定簇的混合抗體。單克隆抗體（monoclonalantibodies,mAb）：第二代抗體，是指由一個B雜交瘤細胞活化、增殖、分化產生的子代細胞克隆分泌的、針對一個抗原決定簇的抗體?；蚬こ炭贵w（geneticallyengineeringantibodies）：第三代抗體目前五十七頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點

多克隆抗體：病原微生物含有多種抗原決定簇的抗原物質，因此這些抗體制劑也是多種抗體的混合物，故稱多克隆抗體。早期采用的抗體藥物主要為多克隆抗體，雖然其在治療多種急性中毒中仍發(fā)揮重要的作用，但是多克隆抗體存在非均一性、異質性、不穩(wěn)定性等缺點。目前五十八頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點目前五十九頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點1975年Kohler和Milstein首先利用B淋巴細胞雜交瘤技術制備出單克隆抗體（monoclonalantibodyMcAb）。單克隆抗體具有高度特異性、均一性、來源穩(wěn)定、可大量生產等特點，為抗體制備和應用提供了全新的手段，還促進了基礎和臨床醫(yī)學的發(fā)展。目前六十頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點

單克隆抗體作為抗體制劑，在臨床上主要用與疾病的診斷和治療。單克隆抗體檢測與某些疾病有關的抗原，輔助臨床診斷。用放射性核素標記單克隆抗體進行腫瘤顯像，做免疫定位診斷。目前六十一頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點

單克隆抗體用于臨床治療，CD3單克隆抗體作為免疫抑制劑對器官移植免疫排斥有抑制作用。以單克隆抗體作為載體的藥物對腫瘤進行定向治療。目前六十二頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點McAb在免疫導向療法中存在的問題(障礙):

A,McAb均是鼠源性抗體,應用于人體內可產生人抗鼠抗體(HAMA),加速了排斥反應,在人體內的半衰期只有5~6h,維持有效藥物作用靶組織時間;

B,完整的抗體分子的相對分子質量過大,難以穿透實體腫瘤組織,達不到有效的治療濃度.

需要解決的問題:

A,降低McAb的免疫源性;

B,降低McAb的相對分子質量.

解決問題的方法或途徑—基因工程技術

1984年報道了人—鼠嵌合抗體,之后制備出了改型抗體,單鏈抗體,單域抗體,最小識別單位等多種類型,基本上消除了抗體的鼠源性(免疫源性),相對分子質量只有完整抗體分子的1/80~1/3.

目前六十三頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點二、抗體藥物的特異性單克隆抗體針對特定的單一抗原表位，具有高度的特異性，這是抗體藥物發(fā)揮治療作用的重要基礎。對于抗腫瘤抗體藥物的研究表明，其特異性主要表現(xiàn)在1.與相關抗原的特異性結合2.對腫瘤靶細胞的選擇性殺傷3.在動物體內呈靶向性分布4.對相關的腫瘤顯示更強的療效目前六十四頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點三、抗體藥物的主要研究方向1.研究新的分子靶點2.免疫檢測技術的研發(fā)3.抗體的人源化4.抗體藥物分子的小型化5.具有抗體功能的融合蛋白目前六十五頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點生物制藥：迎接抗體藥物的黃金時代

抗體藥物具有靶向性，直接與目標特異結合，這一特點在其他藥物很難實現(xiàn)；同時藥物副作用小，在臨床上具有廣闊的應用前景，目前主要用于腫瘤、自身免疫等疾病的治療。近十一年來，全球抗體藥物市場經歷了一個快速發(fā)展的階段，總銷售額從1997年的3.1億美元增長到2008年的400億美元，復合增長率高達55%，而且增長勢頭還在持續(xù)，市場遠未飽和。很大一部分抗體藥物都已邁入重磅炸彈行列，在2008年全球15大藥品中，抗體藥物占據(jù)了1/3，且排名仍在上升。（2010資料）目前六十六頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點第二節(jié)單克隆抗體及其制備

單克隆抗體是將抗體產生細胞與具有無限增殖能力的骨髓瘤細胞相融合，通過有限稀釋法及克隆化使雜交瘤細胞成為純一的單克隆細胞系而產生的。由于這種抗體是針對一個抗原決定簇的抗體，又是由單一的B淋巴細胞克隆產生的，所以稱為單克隆抗體。目前六十七頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點免疫學基礎人體和動物都有免疫系統(tǒng)，包括特異性免疫和非特異性免疫，其中特異性免疫又分為體液免疫和細胞免疫。非特異性免疫主要是由宿主的屏障結構（皮膚、黏膜、血腦屏障、血胎屏障），吞噬細胞（白細胞的一種）的吞噬功能，正常組織和體液中的抗菌物質（不直接殺死病原體，但能配合免疫細胞、抗體或其他防御因子使它們發(fā)揮較強的免疫功能，如補體、干擾素。）以及炎癥反應（存在于紅細胞、白細胞和血小板等細胞和組織重點組胺和5-羥色胺在機體感染病原體而引起炎癥反應時，可使炎癥部位的毛細血管迅速擴張，血流量增加，毛細血管通透性增強，大量淋巴細胞從毛細血管穿越進入炎癥區(qū)）等所組成。目前六十八頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點當機體受到抗原刺激時，體內的抗原特異性淋巴細胞識別抗原，然后被活化，發(fā)生一系列的增殖和分化等變化，最終表現(xiàn)出一定的體液免疫或細胞免疫。細胞免疫主要是指機體受到異己物質抗原的刺激后，一類小淋巴細胞—依賴胸腺的T細胞發(fā)生增生，分化，直接攻擊靶細胞或間接地釋放一些淋巴因子從而使機體達到免疫的過程。而體液免疫是當機體受到抗原刺激后，來源于骨髓的小淋巴細胞—B淋巴細胞進行增生和分化為漿細胞，進而合成各種免疫球蛋白（抗體），然后在體液中發(fā)揮免疫作用的過程。目前六十九頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點淋巴系統(tǒng)是循環(huán)系統(tǒng)的一部分，由淋巴管和產生淋巴細胞和生成抗體的淋巴器官（淋巴結、扁桃體、脾、胸腺和消化管內的各種淋巴組織）組成。要制備單克隆抗體首先要獲得相應的抗原，再用抗原免疫動物。雜交瘤技術是動物細胞的一種融合技術。B淋巴細胞雖然可以被外來的抗原所激活并產生相應單一、均勻的特異性抗體，但卻無法在體外進行繁殖和傳代；骨髓瘤癌變細胞在體外具有很強的繁殖能力，將二者進行融合，制成雜交瘤細胞，就可以在體外持續(xù)分泌出成分單一的特異抗體，即單克隆抗體。目前七十頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點目前七十一頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點

一、抗原與動物免疫制備特定抗原的單克隆抗體，首先要制備用于免疫的適當抗原，再用抗原進行動物免疫。有的抗原可以用化學合成：地高辛多數(shù)抗原物為混合物須經免疫、篩選、克隆化。目前七十二頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點

為使雜交瘤細胞穩(wěn)定，采用與骨髓瘤細胞供體同一品系的動物進行免疫。目前常用的骨髓瘤細胞系多來自BALB/c小鼠和LOU大鼠，因此免疫動物也采用相應的品系，BALB/c小鼠最為常用。 在選擇動物時應考慮動物品系的免疫應該基因對抗原免疫應答的影響，比如BALB/c小鼠對抗原不能產生很好地免疫應答時，應該用其他品系小鼠或大鼠。目前七十三頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點

免疫的方法采用體內免疫法和體外免疫法。 體內免疫法適用于免疫原性強、抗原量較多的情況下，一般用8～12周齡雌性鼠，由靜脈直接注入抗原，可追加免疫，在B淋巴細胞受到可靠的最大限度的刺激后，迅速增殖、分裂，當增殖率最高時收集B淋巴細胞。

顆粒性抗原（如細菌細胞抗原）的免疫原性強，可不加佐劑，直接注入腹腔107個細胞進行初次免疫，間隔1～3周，再追加免疫1～2次。目前七十四頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點

可溶性抗原按每只小鼠10～100μg抗原與弗氏完全佐劑等量混合后注入腹腔內，進行初次免疫，間隔2～4周，再用不加佐劑原抗原追加免疫1～2次。

一般在采脾細胞前3日由靜脈注射最后一次抗原（刺激B淋巴細胞迅速分裂）。目前七十五頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點

脾內免疫法即在麻醉下直接將0.1～0.2ml抗原注入脾臟進行免疫。 該法可提高小鼠對抗原的免疫反應性，節(jié)省抗原用量（細胞抗原只需105個，可溶性抗原只需10μg）。 然而，該法產生IgM類抗體居多，最好用作在常規(guī)免疫基礎上的追加免疫。目前七十六頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點

體外免疫法用于不能采用體內免疫的情況下，如制備人源性單克隆抗體；或在抗原的免疫原性極弱，能引起免疫抑制時使用。 優(yōu)點：所需抗原少、免疫期短，干擾因素少，但融合后產生的雜交瘤不夠穩(wěn)定。

目前七十七頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點

體外免疫法基本方法：用4～8周齡BALB/c小鼠的脾臟制成單細胞懸液，再加入適當抗原使其濃度達0.5～5μg/ml,在5%CO

37°C下培養(yǎng)4～5天,再分離脾細胞,進行細胞融合。o2目前七十八頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點二、細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)1.骨髓瘤細胞的選擇 應盡可能選擇自身不合成或至少不分泌任何免疫球蛋白分子或片段的骨髓瘤細胞作為親本細胞。細胞必須處于良好的生長狀態(tài)，對數(shù)生長期最好。還必須具備融合率高、所產生的雜交瘤細胞分泌抗體的能力強且長期穩(wěn)定等特點。

2.免疫脾細胞懸液的制備 取經免疫的小鼠，摘除眼球放血，將小鼠處死，無菌摘取脾臟，研磨制取脾淋巴細胞懸液，洗滌調整細胞濃度。目前七十九頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點3.細胞融合的方法：

脾細胞（1×108）

骨髓瘤細胞（2×107）混合聚乙二醇（PEG）誘導下融合，2分鐘，然后用培養(yǎng)液將融合液緩慢稀釋。

PEG相對分子量4000，濃度為50%，二甲基亞砜增加融合率。目前八十頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點關于PEG相對分子量和濃度越大，其促融率越高，但其黏度和對細胞的毒性也越大，常用范圍濃度10%-60%，分子量400-6000，最佳范圍濃度40%-50%，分子量4000。為提高融合率可加入二甲基亞砜，以提高細胞接觸的緊密性。但由于二者都對細胞有毒性，要嚴格控制作用時間和用量。目前八十一頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點4、融合結果： 細胞融合后可產生多種融合，產生脾-脾、脾-瘤、瘤-瘤融合細胞。 為獲得目的細胞將融合后的細胞立即（未融合細胞壁雜交細胞繁殖更快，能將融合細胞淘汰）轉入選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 常用HAT培養(yǎng)基（用次黃嘌呤H、氨基喋呤A、胸腺嘧啶T配成）。氨基喋呤能阻斷DNA合成的主要途徑，瘤-瘤融合細胞和瘤細胞因不能合成DNA而死亡。脾-脾融合細胞和未融合的瘤細胞在培養(yǎng)幾天后也迅速死亡，而雜交瘤細胞則可以存活（利用HGPRT，用H和T合成DNA）。目前八十二頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點脾細胞在一般情況下不能連續(xù)培養(yǎng)。骨髓瘤細胞都是次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（HGPRT）缺乏株，不能利用H和T合成DNA,而脾細胞中有這種酶，所以只有脾-瘤細胞才能在HAT選擇培養(yǎng)基上生長。目前八十三頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點5、培養(yǎng)方法： 將融合的細胞懸浮于HAT培養(yǎng)基中，加入到96孔板內，根據(jù)情況2-3天換液一次，每次吸去二分之一到三分之二培養(yǎng)液，再加入等量新鮮培養(yǎng)液。7-14天改用HT培養(yǎng)液，14天以后用普通的RPMI1640完全培養(yǎng)液，從融合后8~9天就可篩選出產生抗體的陽性克隆。 因為雜交瘤數(shù)量很少，多半不易存活，所以通常要加入飼養(yǎng)細胞才能使其繁殖，常用小鼠腹腔巨噬細胞、脾細胞和胸腺細胞。（作用：能釋放某些生長刺激因子，并能滿足雜交瘤細胞對細胞密度的依賴性。）目前八十四頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點

三、篩選陽性克隆與克隆化

對于最后存活的細胞要進行篩選，看其是否是想要得到的能產生單克隆抗體的融合細胞，篩選方法應微量、快速、特異、敏感、簡便并能一次檢測大批標本。

目前八十五頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點

篩選陽性克隆常用檢測方法有免疫酶技術、免疫熒光技術、放射免疫技術等。 應根據(jù)實驗室條件及抗原的情況選擇合適的方法。

免疫酶技術因為不需要進行放射性標記，操作簡便，又適用于大批標本的檢測，廣泛采用，通過引入生物素-親和素等放大系統(tǒng)可進一步提高靈敏度。

免疫酶技術、放射免疫技術均可適用于可溶性抗原和顆粒性抗原的抗體檢測。

免疫熒光技術適用于細胞抗原的抗體檢測，特別是制備以檢測患者活檢組織標本為目的抗體時，不僅能篩選抗體，還能對所識別的抗原進行定位判定。

目前八十六頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點ELISA用于破傷風抗體的篩選目前八十七頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點AboutELISAELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測定(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)的簡稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術。此項技術自70年代初問世以來，發(fā)展十分迅速，目前已被廣泛用于生物學和醫(yī)學科學的許多領域。ELISA是以免疫學反應為基礎，將抗原、抗體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合起來的一種敏感性很高的試驗技術。由于抗原、抗體的反應在一種固相載體——聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應物，從而保證試驗結果的特異性與穩(wěn)定性。目前八十八頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結果，使測定方法達到很高的敏感度。目前八十九頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點About克隆化克隆化是指單個細胞通過無性繁殖而獲得細胞集團的整個培養(yǎng)過程。這種群體細胞的生物學特性和功能完全相同。常用方法：有限稀釋法和軟瓊脂培養(yǎng)法目前九十頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點有限稀釋法把雜交瘤細胞懸液稀釋后，加入到96孔板中，理論上每孔一個細胞，第一次克隆化時用HT培養(yǎng)液，以后的克隆化可以用不含HT的RPMI1640培養(yǎng)液。由于單個細胞難以存活，克隆化時需要加入飼養(yǎng)細胞輔助其生長。目前九十一頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點軟瓊脂培養(yǎng)法在培養(yǎng)液中加入0.5%左右的瓊脂糖凝膠，細胞分裂后形成小球樣團塊，由于培養(yǎng)基是半固體狀態(tài)，可用毛細管將小球吸出，團塊經打碎后，移入96孔板繼續(xù)培養(yǎng)。該方法可以吸出大量克隆細胞進行培養(yǎng)，克隆化很容易成功。目前九十二頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點篩選出來的陽性克隆可能含有不分泌抗體的細胞或有多株分泌抗體的細胞，同時，剛融合的細胞不穩(wěn)定，染色體易丟失，因此應盡早進行克隆化。融合后的雜交瘤細胞要經過三次克隆化才能達到100%的陽性克隆。目前九十三頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點四、雜交瘤細胞與抗體性狀的鑒定雜交瘤細胞鑒定：染色體分析、抗體穩(wěn)定性分析、外源因子檢查。染色體分析可作為雜交瘤細胞鑒定的客觀指標，并有助于了解雜交瘤細胞分泌抗體的能力。染色體數(shù)目較多又比較集中的雜交瘤細胞能分泌高效價的抗體。目前九十四頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點單抗：進行Ig類和亞類鑒定（生物特性差異大）用羊或兔抗Ig不同類或亞類抗體，進行免疫擴散或ELISA鑒定。單抗：進行親和力測定（為正確選擇單抗提供依據(jù)）相對親和力測定和親和常數(shù)測定根據(jù)需要不同，應該進行單抗的特異性、純度和識別抗原的相對分子質量等測定。目前九十五頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點對抗體根據(jù)需要不同，進行下面測定純度含量測定一般用SDS或層析法活性測定測效價識別抗原位點測定特異性、交叉反應性測定目前九十六頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點五、單克隆抗體的大量制備方法主要有兩種：動物體內誘生法和體外培養(yǎng)法。1、體內誘生法，可獲的5～20mg/ml抗體在接種前1-2周，先給小鼠腹腔注射0.5毫升的降植烷（或液體石蠟）（破壞腹腔內膜，建立雜交瘤細胞良好的增殖環(huán)境），然后接種1×106個雜交瘤細胞，待生成腹水后再抽取，離心去細胞沉淀，取上清夜凍存。

操作簡便，所得單抗量多且效價高，可有效保存雜交瘤細胞株和分離污染了雜菌的雜交瘤細胞，目前多采用該法生產制備單抗。缺點在于，小鼠腹水中混有多種雜蛋白，增加了純化難度。目前九十七頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點2、體外培養(yǎng)法，體外培養(yǎng)法可獲的10μg/ml抗體采用RPMI1640培養(yǎng)液+10%~20%小牛血清。由于含有血清，總蛋白可達100mg/ml以上，難以分離純化小牛血清容易發(fā)生支原體感染，并且批次質量差異大近年來發(fā)展了無血清培養(yǎng)法，利用白蛋白、胰島素、轉鐵蛋白、乙醇胺等混合物代替小牛血清，減少污染，并有利于單抗的純化，但產量不高。目前常用培養(yǎng)方式有兩種，懸浮培養(yǎng)和細胞固定化培養(yǎng)利用懸浮培養(yǎng)代替靜止培養(yǎng)，增加了細胞生長空間，提高了單抗產量，單抗可達400μg/ml。目前九十八頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點六、單克隆抗體的純化先明確單克隆抗體的免疫球蛋白的類和亞類，并根據(jù)用途綜合選定純化方法。用于體外診斷試劑，IgG采用沉淀處理結合親和層析，IgM沉淀處理結合凝膠過濾。體內診斷試劑或治療用藥，應去除內毒素、核酸、病毒等微量的污染，必須經親和層析和陰離子交換層析。

目前九十九頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點體內誘生法單克隆抗體的純化方法1、澄清和沉淀處理：先1000克離心力離心5min，去除沉淀，再20000克高速離心30min，去除殘留的小顆粒物質，再用0.2微米的微孔濾膜過濾，除去污染的細菌、支原體和脂質，最后用飽和硫酸銨沉淀抗體。2、分離：主要分離方法有凝膠過濾、陰離子交換層析、親和層析等。凝膠過濾用于IgG、IgM類單抗的分離純化，能去除污染的微量雜蛋白，抗體純度達95%以上陰離子交換層析用于IgG類的分離純化。親和層析適用于IgM類的純化，多用蛋白A親和層析，收獲的抗體純度很高，但也有極微量的雜蛋白。目前一百頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點第三節(jié)基因工程抗體及其制備目前一百零一頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點Ig分子是由三個不連鎖的Igκ、Igλ和IgH基因所編碼。Igκ、Igλ和IgH基因定位于不同的染色體上：編碼多肽鏈 基因符號（人）基因染色體定位 人小鼠κ輕鏈 Igκ 2 6λ輕鏈 Igλ 22 16重鏈 IgH 14 12

目前一百零二頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點編碼一條Ig多肽鏈的基因是由在胚系中多個分隔的DNA片段（基因片段）經重排而形成的。1965年Dreyer和Bennet首先提出假說，認為Ig的V區(qū)和C區(qū)是由分隔存在的基因所編碼，在淋巴細胞發(fā)育過程中這兩個基因發(fā)生易位而重排在一起。1976年日本學者利根川進應用DNA重組技術證實了這一假說。利根川進由此獲得1987年醫(yī)學和生理學諾貝爾獎。目前一百零三頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點基因工程抗體研究目的雜交瘤單抗為鼠源性，應用于人體產生人抗鼠抗體及毒副作用。對鼠源性的單抗進行基因加工和改造。目的一是降低鼠源單克隆抗體分子的免疫原性。通過置換C區(qū)，保留CDR區(qū)，先后研制了多種人源化的單抗，如人-鼠嵌合抗體、改形抗體等。二是降低抗體的相對分子質量，增加組織的透過性。由于抗體的主要功能是特異性地結合抗原，那么只克隆出V區(qū)基因，并使其表達，就可以實現(xiàn)抗體主要功能，則編碼的抗體分子的相對分子質量會很小。已研制出多種類型的小分子基因工程抗體，如單鏈抗體、單域抗體等。目前一百零四頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點目前一百零五頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點基因工程抗體的優(yōu)點：1.最大成度降低抗體的鼠源性，降低甚至消除人體對抗體的排斥反應2.分子較小，穿透力強，更易到達病灶的核心部位3.可以根據(jù)治療的需要，制備多種用途的新型抗體4.可以采用原核細胞、真核細胞或動植物等多種表達系統(tǒng)大量生產，大大降低成本。目前一百零六頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點一、人鼠嵌合抗體

抗原抗體結合功能<—抗體可變區(qū)（V）同種性免疫源性<—抗體穩(wěn)定區(qū)（C）在基因水平上將鼠源單抗的H和L鏈可變區(qū)基因分離出來，分別與人Ig的H和L鏈的穩(wěn)定區(qū)（C）基因連接成人-鼠嵌合抗體的H和L鏈基因，再共轉染骨髓瘤細胞，就能表達完整人-鼠嵌合抗體。目前一百零七頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點嵌合抗體(Chimericantibodies)

鼠IgV區(qū)基因+人IgC區(qū)基因→拼接成重組Ig基因→鼠-人嵌合抗體，降低單抗中的鼠源蛋白的免疫原性，MouseIgGHumanIgGMouse-humanchimericIgG目前一百零八頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點Pr鼠VH人CHPr鼠VL人CL免疫球蛋白基因載體的構建H鏈嵌合載體L鏈嵌合載體共轉染細胞啟動子人-鼠嵌合抗體基因工程改造策略目前一百零九頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點鼠VH鼠VL人CL人CH抗體分泌細胞人-鼠嵌合基因工程抗體保持了鼠源性單抗的抗原結合特異性，但對人體的免疫原性大幅度下降目前一百一十頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點二、改形抗體（CDR移植抗體） Ig分子中參與構成抗原結合部位的區(qū)域是H和L鏈V區(qū)中的互補決定區(qū)（CDR區(qū)），而不是整個可變區(qū)。H和L鏈各有三個CDR，其它部分稱框架區(qū)。

用鼠源單抗的CDR序列替換人Ig分子中CDR序列，則可使人的Ig分子具有鼠源單抗的抗原結合特異性。而由于抗體分子中鼠源部分所占比例很小，可消除對人的免疫原性。這種改形體又稱為CDR移植抗體。目前一百一十一頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點CDR序列CDR序列鼠單克隆抗體人抗體人源化抗體（改型抗體）圖4鼠單克隆V區(qū)人源化（CDR移植）最大問題是抗體的親和力下降，甚至喪失活性原因：人Ig分子的框架區(qū)中一些氨基酸與鼠Ig的CDR區(qū)不協(xié)調。方法：突變或同源性。目前一百一十二頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點

基因工程小分子抗體僅表達鼠源單抗的V區(qū)片段，相對分子量為原抗體的1/80～1/3。即保留CDR區(qū)，而Ig分子中的C區(qū)不表達。小分子抗體類型有：①Fab片段抗體；②Fv抗體；③單鏈抗體；④單域抗體；⑤最小識別單位三、小分子抗體目前一百一十三頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點FvScFv單域抗體最小識別單位Fab目前一百一十四頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點

由完整的輕鏈和Fd組成，大小為完整分子的1/3。

把Fab與細菌的前導肽相連，在前導肽的作用下Fab進入質周腔，裝配折疊后，它具有結合抗原的活性。(1)Fab目前一百一十五頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點

水解酶如胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等將IgG的重鏈在鉸鏈區(qū)的C端裂解，獲得兩個完全相同的抗原結合片段，即Fab。Fab之間保留有鉸鏈區(qū)和二硫鍵，具有完整的雙價抗體活性，相對分子量減少了1/3，在人體內產生的抗鼠蛋白的排斥反應相應地降低到30%，由于仍然保持抗體分子的立體構型，在人體仍然很穩(wěn)定，成為小分子抗體的雛形，成為Fab抗體。

目前一百一十六頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點免疫球蛋白基因載體的構建H鏈表達載體L鏈表達載體共轉染細胞PrVHCH1PrVLCLFab抗體分子的制備Fabantibodymolecule目前一百一十七頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點抗體分泌細胞VHVLCL-S-S-CH1Fab抗體分子的制備目前一百一十八頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點

Fv、ScFv的大小約為全分子的1/6。(2)Fv或ScFv

FvScFv連接肽Fv抗體是含有抗體重鏈可變區(qū)、輕鏈可變區(qū)并具有全部抗原結合位點的最小抗體片段。目前一百一十九頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點分別構建載體L鏈表達載體H鏈表達載體共轉染細胞PrVHPrVLFv[二硫鍵穩(wěn)定的Fv(disulfide-stabilizedFv,ds-Fv)]小分子抗體的制備a.ds-Fv目前一百二十頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點抗體分泌細胞VHVL-S-S-Fv小分子抗體的制備disulfide-stabilizedFv,ds-Fv目前一百二十一頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點8mol/L的尿素可將Fv分離為VH和VL，并且二者又可快速重新結合成高親和力的Fv。該事實證明：Ig分子結構中的可變區(qū)是作為完整區(qū)域存在的，不依賴于抗體的其他肽段能正確折疊。X-ray表明，F(xiàn)v的VH和VL的C端位于分子表面并遠離抗原結合位點，而其N端掩蔽在分子內部并靠近抗原結合位點，VH和VL的CDR區(qū)共同構成了抗原結合位點，決定了抗體的特異性。Fv的發(fā)現(xiàn)推動了抗體的體外重組技術的發(fā)展。體外表達的高產量、天然活性的Fv為蛋白均一的小分子。重組技術制備的Fv抗體又推動了對抗體結構和功能的分析及抗體的改建，為Fv抗體的臨床應用奠定了基礎。Fv由VH與VL構成，由于其結合是非共價結合，故Fv不穩(wěn)定。目前一百二十二頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點

在VH與VL之間加上一段連接肽，把VH與VL連成一條單鏈，得到ScFv，即單鏈抗體，是具有親代抗體全部抗原結合特異性的最小功能結構單元。

連接肽的長度在10-15個氨基酸左右，不宜太長或太短，它應具有柔軟性，側鏈少，抗原性弱等特點。常用的連接肽是(GGGGS)3。既連接VH與VL，又保持一定的靈活性，使VH與VL的功能區(qū)間在折疊后仍可配對。

目前一百二十三頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點

單鏈抗體大多在大腸桿菌中表達，有三種形式：①直接在細胞質中表達；②與其它菌體融合表達融合蛋白；③分泌表達具有功能的單鏈抗體。目前一百二十四頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點單鏈抗體的優(yōu)點：1.可去除非特異性反應的競爭性表面蛋白，腫瘤顯象背景更加清晰性。2.分子小，僅為完整單體Ig的1/6，易滲透腫瘤組織中增加藥物治療濃度，可用于腫瘤的診斷和治療。3.免疫源性小，可消除人抗鼠的排異反應。4.在體內循環(huán)的半衰期短，易清除，利于解毒排出;5.為單鏈，易于分子改造，與毒素或酶基因拼接成免疫毒素或酶標抗體等，便于直接殺傷靶細胞。6.可在原核系統(tǒng)表達，易于基因工程操作；可由大腸桿菌發(fā)酵，進行批量生產。目前一百二十五頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點單鏈抗體的缺點：1.穩(wěn)定性低。scFv分子內VH和VL間相互作用力較弱，不足以完全抵消分子間作用力，故易凝聚成scFv二聚體和多聚體。2.功能單一，僅能與一種抗原特異性結合3.親和力低，穩(wěn)定性差，體內清除過快。單鏈抗體的不足限制了它在生物學、醫(yī)學及疾病的診治方面的廣泛應用，近年來，發(fā)展了結合性能良好的scFv多聚體，并取得了突破性進展。目前一百二十六頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點

單域抗體即為VH，約為完整分子的1/12。它只由一個結構域構成，故稱單域抗體（singledomainantibody，sdAb），又稱納米抗體（nanobody）或重鏈抗體（heavychainantibody，hcAb），是從駱駝科動物和鯊魚的血清中分離出的一種抗體。單域抗體盡管親和力有所降低，但仍保持著原單抗的特異性。

(3)單域抗體VH為抗體的分子構建提供了一個新方法。基于單域抗體的一系列優(yōu)點，在免疫實驗、診斷與治療中，它將發(fā)揮超乎想象的巨大功能。目前一百二十七頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點

約為完整分子的1/80-1/70大小，一般由一個CDR構成，它也保持著抗體的特異性。(4)分子識別單位CDRCDR區(qū)基因編碼蛋白能模擬抗體結合活性，稱其為分子識別單位（MRU），CDR片段為抗體結合抗原的最小片段?？乖禺愋越Y合能力主要由CDR3決定，所構建的CDR3小肽段在體內、體外仍具有抗原結合能力和一定親和力。然而，這些小抗體片段不能取代完整可變區(qū)的作用，并且親和力極低，在實際應用中有很大的局限。目前一百二十八頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點第四節(jié)多功能抗體及其制備一、雙功能抗體二、多功能抗體三、抗體融合蛋白目前一百二十九頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點

雙鏈抗體（Diabody）一詞最早由Hollinger等于1993年創(chuàng)造。乃是一種小分子的雙價雙特異性抗體片段。

一、雙功能抗體目前一百三十頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點將A抗原抗體重鏈的可變區(qū)與B抗原抗體輕鏈的可變區(qū)通過短肽鏈接構建成雙鏈抗體的表達質粒，表達后形成雙特異性抗體。連接肽長度5~10個aa為宜目前一百三十一頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點

雙功能抗體就是雙特性單鏈抗體

雙特異性單鏈抗體(bispecificsingle-chainFvs,bisFvs)是一種非天然性抗體，將不同來源的兩條高特異性、高親和力的scFv組合成的具有兩種不同抗原結合特征的新型抗體。bisFvs由于具有獨特的與兩個抗原位點結合的能力，具有廣闊的應用前景，如導向藥物載體，效應細胞識別、連接，免疫阻斷抗體，免疫診斷試劑等，特別是用于腫瘤的診斷和治療。目前一百三十二頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點雙功能抗體構建方法：⒈化學交聯(lián)法 共價連接.關鍵是選擇具有一定的柔韌性，但不影響兩端scFv復性、結合特征的適當連接肽。⒉生物學方法 非共價二聚體。也可通過分泌性原核表達系統(tǒng)，可直接獲得有功能的bisFvs分子。⒊基因工程法 獲得二聚化bisFvs分子。目前一百三十三頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點雙功能抗體的優(yōu)點：一個臂識別腫瘤細胞表面抗原，包括腫瘤相關抗原、癌基因產物、特殊的白細胞分化抗原、病毒蛋白抗原、特異性受體等，并有效結合；另一個臂可識別免疫效應細胞及分子。目前一百三十四頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點即scFv的多聚體，二聚體、三聚體、三聚體等。多聚體之間的轉換只依賴連接肽長度的變化，形成了多價、多效能、高親和力的新型小分子抗體。多功能抗體克服了scFv在體內清除過快的不足。二、多功能抗體目前一百三十五頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點多功能抗體具有高親和力性能，可同時與細胞膜上相鄰的多個靶抗原結合。影響結合有兩個因素：Fv分子的排列方向（VH-VL是VL-VH結合性能的10~20倍）細胞表面靶抗原結合位點方向的一致性（保證了多價Fv分子可同時與之進行高親和性結合）與腫瘤細胞表面抗原的多價結合有利于腫瘤的影像分析及治療。目前一百三十六頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點有應用價值的scFv多聚體特征：能高選擇性、高親和性地同靶抗原或腫瘤相關抗原結合在血循環(huán)中，與效應細胞或細胞毒觸發(fā)分子有較低親和力應為人源化抗體，最大限度地減少人抗鼠蛋白的排斥反應，使重復給藥不受限制分子應大小適中，既能滲透到腫瘤組織內部，又能保證適當?shù)臏魰r間。目前一百三十七頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點三、抗體融合蛋白

抗體融合蛋白廣義屬雙功能抗體。類型：①配基-配基型融合蛋白；②配基-Ig型嵌合蛋白；③配基-Fv型融合蛋白；④受體-Fv型融合蛋白；⑤酶-抗體型融合蛋白； 酶-抗體型融合蛋白，在藥物治療中有廣闊的前景，它可在靶向位置上將前體藥物轉化成有效的藥物，從而避免了對正常組織的損害，稱抗體介導的酶前體藥物治療（ADEPT）。

目前一百三十八頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點構建抗體融合蛋白的基本原則構建抗體融合蛋白的基本原則：刪除第一個蛋白的終止密碼子，接上帶終止密碼子的第二個蛋白基因，實現(xiàn)兩個基因共表達。構建抗體融合蛋白的關鍵問題：兩個蛋白間的接頭序列連接肽。3~5個aa可滿足大部分融合蛋白的正確折疊要求，而加入一段有疏水性和伸展性的較長肽鏈可緩解兩種蛋白相互干擾。目前一百三十九頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點融合蛋白基因的表達真核細胞中表達：能夠將抗體多肽正確折疊復性和糖基化，省去了繁瑣的體外復性和純化步驟，但產量低。原核細胞中表達（分兩種形式）：分泌到菌體外，成為有活性的可溶性融合蛋白以胞內包含體形式存在，需溶解包含體重新折疊成為有活性的蛋白質目前一百四十頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點CTLA4-IgCTLA4Ig是通過基因重組產生的CTLA4（細胞溶解性T淋巴細胞相關抗原cDN，又名CD152）分子胞外功能區(qū)與免疫球蛋白IgG恒定區(qū)相結合的融合蛋白,與B7分子具有高度的親合力（其親和力約為CD28的20倍），可以和CD28競爭結合APC（抗原提呈細胞）上的B7家族分子CD80(B71)和CD86(B72)，阻斷CD28與B7的信號傳導通路，抑制T細胞對抗原識別第二信號的產生，導致T細胞的免疫失能，誘導對特異性抗原的免疫耐受，從而發(fā)揮免疫抑制效應.目前一百四十一頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點CTLA4Ig是目前所發(fā)現(xiàn)的一種高效、無毒并兼有免疫抑制和誘導免疫耐受的生物免疫抑制劑，對移植排斥的防治和一些難治性自身免疫性疾病的治療具有廣闊的臨床應用前景。應用于胰腺移植，心臟移植。自身免疫性糖尿病治療目前一百四十二頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點自身免疫性糖尿病治療自身免疫性糖尿病的發(fā)病被認為是由于遺傳易感性和環(huán)境因素（如微生物、化學物質、機體營養(yǎng)狀況）等共同作用，使機體免疫自穩(wěn)機制失衡，引起自身免疫損傷。而導致“自相殘殺”的“罪魁禍首”就是T細胞的異常活化以及由此產生的自身反應性T細胞，從而產生一系列“六親不認”的自身抗體（如抗胰島細胞自身抗體、胰島素自身抗體、熱休克蛋白－60自身抗體），導致胰島素分泌減少及血糖升高，并最終出現(xiàn)臨床糖尿病癥狀。由此看來，自身免疫性糖尿病作為一種T細胞依賴的自身免疫病，遏制住其發(fā)病環(huán)節(jié)中的“始作俑者”—T細胞活化，就相當于扼住了自身免疫性糖尿病的咽喉。北京大學醫(yī)學部免疫學系謝蜀生教授一直在從事這方面的研究。他認為，T細胞活化除了需要有第一活化信號（由T細胞表面的抗原識別受體與抗原提呈細胞表面的抗原肽結合產生）外，還必須有第二活化信號（由抗原提呈細胞表面的共刺激分子與T細胞表面相應的配體結合產生）的存在，只要阻斷第二活化信號的產生就可以有效地防止T細胞的活化。目前一百四十三頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點自身免疫性糖尿病治療研究發(fā)現(xiàn)，T細胞表面還有一種CTLA4分子，它與它的“鄰居”CD28分子的結構很類似，也能夠與“鑰匙”B7分子結合，但CTLA4分子和B7分子結合后卻無法開啟T細胞活化的閘門。顯而易見，這種競爭性結合的后果將阻斷CD28的共刺激效應，抑制T細胞的活化?？茖W家們根據(jù)這一原理構建了一種CTLA4－Ig融合蛋白，利用它與B7分子高親和力（其親和力是CD28分子的20多倍）的特性，專門用來保護“第二把鎖”CD28分子不被“鑰匙”B7分子開啟，從而使T細胞無法活化，進入無能狀態(tài)。CTLA4－Ig融合蛋白就是針對自身免疫性糖尿病的靈丹妙藥？目前一百四十四頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點自身免疫性糖尿病治療進一步的研究發(fā)現(xiàn)，CTLA4－Ig融合蛋白單獨阻斷CD28－B7共刺激途徑誘導產生的T細胞無能狀態(tài)在一定條件下可以逆轉。更重要的是T細胞還存在一些非CD28分子依賴的活化途徑，也就是說仍將有少量T細胞依然能夠得以活化，并進一步分化為效應T細胞來“作祟”。（怎么辦？）研究發(fā)現(xiàn)，在T細胞表面存在一種Fas分子，如果把它也看作一把鎖的話，那么它也有與其對應的一把鑰匙，科學家把這把“鑰匙”稱為FasL。當“鑰匙”插入“鎖孔”后，F(xiàn)as就會與FasL相互作用，啟動一系列分子水平的變化，不過其結果并非使T細胞活化，而是誘導T細胞凋亡，有效抑制T細胞的應答。如果人為地提供外源性的FasL，促進已活化的T細胞凋亡，就可以使在CTLA4－Ig融合蛋白作用后仍然能夠活化的T細胞無處可逃。目前一百四十五頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點自身免疫性糖尿病治療謝蜀生教授正是看到了這一點，提出把阻斷T細胞活化的共刺激效應與誘導已活化T細胞凋亡這兩種方法結合起來的設想，希望能夠更徹底地阻斷T細胞的異?；罨?。為此，他們構建了一種功能獨特的雙功能分子——新型的CTLA4－FasL融合分子，在兩個不同層次上，設置了阻止T細胞活化和應答的屏障，有效防止T細胞介導的自身免疫病的發(fā)生。在實踐中，研究人員還發(fā)現(xiàn)，CTLA4與FasL的共同作用并非1＋1＝2那么簡單，兩者還具有明顯的累加協(xié)同效應，也就是說1＋1＞2，比如阻斷CD28提供的共刺激效應可以使T細胞對凋亡作用更為敏感。應用轉基因技術在實驗小鼠體內表達出CTLA4－FasL融合分子后，發(fā)現(xiàn)自身免疫性糖尿病的發(fā)病率由80％驟然降為13％，血糖和胰島素水平也基本維持正常。目前一百四十六頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點第五節(jié)抗體工程

抗體的研制經歷了從多克隆抗體、單克隆抗體到基因工程抗體的三個階段。：①以1890年發(fā)現(xiàn)的白喉抗毒素為代表，用抗原免疫動物獲得多克隆抗體；②以1975年雜交瘤技術獲得單克隆抗體為代表；③以1994年基因工程抗體為代表；目前一百四十七頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點基因工程抗體完全用基因工程技術制備人源性抗體，利用基因轉移和表達技術，通過細菌發(fā)酵或轉基因動物、植物大規(guī)模生產抗體，進而發(fā)展成抗體工程。基因工程抗體技術主要包括2部分；①對已有的單克隆抗體進行改造，包括單克隆抗體的人源化（嵌合抗體、人源化抗體）、小分子抗體（Fab，ScFv，dsFv，diabody，minibody等）以及抗體融合蛋白的制備；②通過抗體庫的構建，使得抗體不需抗原免疫即可篩選并克隆新的單克隆抗體。目前一百四十八頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點抗體庫技術噬菌體抗體庫技術是近10年來發(fā)展起來的一項新技術,可不經免疫制備抗體，又可實現(xiàn)完全人源化，在理論上可以研制任何一種具有高特異性的抗體，使抗體工程的設想成為現(xiàn)實。該技術的建立是基因工程抗體研究領域的一次質的飛躍，是繼多克隆抗體、單克隆抗體之后的第3代抗體，它為重組抗體的設計、篩選及生產方面的不斷革新及改進提供了高效可靠的方法，極大地推動了重組抗體在科研、檢測、臨床診斷及治療等方面的應用。目前一百四十九頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點抗體庫技術產生的三項技術基礎

抗體庫技術是用基因工程方法把人或其他動物的全部抗體的輕、重鏈可變區(qū)基因克隆出來，在原核載體上表達，然后篩選出所需的特異基因和抗體。該技術的發(fā)展主要依賴于以下3項技術的突破：PCR技術，使人們可以用一組引物克隆出全套免疫球蛋白的可變區(qū)基因免疫球蛋白Fab片段在大腸桿菌中的成功表達噬菌體表面展示技術（PhageDisplay）目前一百五十頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點

初期的抗體庫技術是從淋巴細胞中提取總RNA，反轉錄成cDNA或直接用總DNA為模板，用PCR技術建立輕、重鏈文庫，在大腸桿菌中表達后篩選。

目前一百五十一頁\總數(shù)一百九十五頁\編于二十點噬菌體抗體庫技術噬菌體抗體庫技術是抗體工程領域的最重要進展，使抗體工程進入了一個全新的時期。利用基因工程的方法克隆全套抗體可變區(qū)基因并在噬菌體表面表達，得到多樣性噬菌體抗體的集合即噬菌體抗體庫，通過“吸附-洗脫