病毒轉(zhuǎn)基因技術(shù)原理 腺相關(guān)病毒

第一節(jié)腺相關(guān)病毒簡介

生物學(xué)特性致病性與免疫性目前一頁\總數(shù)四十二頁\編于十一點第一部分生物學(xué)特性血清型病毒結(jié)構(gòu)病毒復(fù)制對理化因素的抵抗力目前二頁\總數(shù)四十二頁\編于十一點血清型AAV是從腺病毒的污染物（1965年）、人群或非人靈長類動物等的組織中分離鑒定到的。共鑒定了11個AAV血清型以及108個AAV變株（variants）。通過簽名PCR（signaturePCR）技術(shù)，利用高度保守序列擴增Cap基因的一小段可變區(qū)的DNA序列，以篩檢是否是新的AAV分離株，然后利用PCR技術(shù)獲得新的AAV分離株的Cap或（和）Rep基因的全長序列。在人類、非人靈長類動物、馬、豬、牛、綿羊、山羊和蛇等的不同組織器官，發(fā)現(xiàn)了大量的具有多樣性的AAV的基因組。但新分離的病毒株，尚未進行血清學(xué)分型，通稱為變株。AAV不同血清型和變株的基因組結(jié)構(gòu)相對較為保守，與AAV-2型較為類似，不同血清型的衣殼蛋白結(jié)構(gòu)中表位的差異。50~80%AAV-2抗體在人群中檢測出。目前三頁\總數(shù)四十二頁\編于十一點轉(zhuǎn)導(dǎo)不同組織器官的AAV最優(yōu)血清型

不同血清型在吸附細胞表面能力、病毒受體、胞內(nèi)交通和抗原性等方面具有明顯的區(qū)別，以及針對不同組織和細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率不一致，體現(xiàn)出不同的組織極性（tissuetropisms）目前四頁\總數(shù)四十二頁\編于十一點病毒結(jié)構(gòu)AAV-2

20–30nm，基因組為線性、單鏈的DNA分子。正鏈和負鏈的單鏈DNA分子，以同等效率包裝在病毒體衣殼中。基因組全長4679個核苷酸?；蚪M包括兩個ORF，三個啟動子（啟動子以在基因組中處的作圖位置標示，分別為p5、p19和p40啟動子），以及兩末端為145個核苷酸的反向末端重復(fù)序列（invertedterminalrepeat，ITR）目前五頁\總數(shù)四十二頁\編于十一點ITRITR中的前125個核苷酸具有回文結(jié)構(gòu)，其中還存在兩個小的內(nèi)部回文結(jié)構(gòu)，可自身折疊后經(jīng)堿基配對、形成T字形的發(fā)夾結(jié)構(gòu)；剩余的20個核苷酸，保持非配對狀態(tài)，稱為D序列（Dsequence）。ITR中還具有Rep結(jié)合元件（Repbindingelements，RBEs)RBE和RBEˊ，以及一個末端解離位點TRS（terminalresolutionsite）等重要序列。ITR是在AAV生物學(xué)中重要的順式（cis）作用活性元件，在病毒復(fù)制中具有重要作用：在非容許條件下，ITR在病毒復(fù)制的負調(diào)控中起關(guān)鍵作用；在容許條件下，作為病毒基因組復(fù)制的起點和引物。ITR對病毒基因組的包裝、轉(zhuǎn)錄、以及位點特異性的整合，均是必需的。目前六頁\總數(shù)四十二頁\編于十一點左端的ORF（Rep基因）可編碼四個Rep蛋白，即Rep78，Rep68，Rep52和Rep40，均具有螺旋酶和ATP酶活性。較大的Rep蛋白如Rep78和Rep68，由P5啟動子指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，分別由未剪輯和剪輯的轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生，具有鏈和位點特異的核酸內(nèi)切酶活性（切割點在TRS附近）以及位點特異的DNA結(jié)合活性（結(jié)合于RBE）。因此它們是重要的調(diào)節(jié)蛋白，以反式（trans）方式參與調(diào)節(jié)AAV復(fù)制周期的所有階段，如DNA復(fù)制、位點特異性整合、整合病毒基因組的拯救，調(diào)節(jié)病毒和細胞內(nèi)基因表達的啟動子等。較小的Rep蛋白如Rep52和Rep40，由P19啟動子指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，分別由未剪輯和剪輯的轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生，參與單鏈DNA的聚集并包裝入病毒體的衣殼。目前七頁\總數(shù)四十二頁\編于十一點右端的ORF（Cap基因）由P40啟動子指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生兩個轉(zhuǎn)錄物，可編碼三個病毒衣殼蛋白，即VP1，VP2和VP3。這些衣殼蛋白利用共同的ORF，但轉(zhuǎn)錄起始位置不一致。一般而言，VP1、VP2和VP3的分子比是1：1：8/10。構(gòu)成這些病毒體的衣殼蛋白的比例的差異，最有可能會影響病毒的感染性，尤其是VP1含量低的情況下。缺乏VP1的病毒體沒有感染性。目前八頁\總數(shù)四十二頁\編于十一點病毒復(fù)制八個主要步驟：與細胞表面受體黏附或結(jié)合內(nèi)吞（endocytosis）在細胞內(nèi)經(jīng)內(nèi)吞體運輸釋放出內(nèi)吞體進入胞核脫殼并釋放病毒基因組啟動雙鏈DNA的合成整合到細胞染色體或以附加子形式持久表達病毒基因目前九頁\總數(shù)四十二頁\編于十一點不同血清型的AAV感染的細胞類型不同，這取決于不同血清型的AAV靶向細胞表面的受體的差異。而且這也決定了不同血清型的病毒在細胞內(nèi)的不同的運輸途徑AAV病毒的糖苷受體和輔助受體目前十頁\總數(shù)四十二頁\編于十一點AAV病毒基因組的復(fù)制模型左為RFm，右為RFd）

Rep蛋白目前十一頁\總數(shù)四十二頁\編于十一點AAV成功感染細胞后，依據(jù)是否有輔助病毒存在的情況下：裂解階段（lyticstage）和溶原性階段（lysogenicstage）

AAV的復(fù)制周期可以分為兩個階段溶原性階段（lysogenicstage）:在缺乏輔助病毒如AdV、HSV等感染的情況下，AAV幾乎不能復(fù)制，基因表達受到抑制，AAV基因組會整合到染色體q13.4的一個4kb大小的區(qū)域（命名為AAVS1），建立潛伏感染裂解階段（lyticstage）:在輔助病毒如AdV、HSV-1等共同感染的情況下，AAV可以經(jīng)歷核酸復(fù)制、病毒基因表達和病毒體產(chǎn)生等過程，最終形成產(chǎn)毒性感染受到羥基脲、拓撲異構(gòu)酶抑制劑或紫外線照射等處理，在缺乏輔助病毒的情況下，也可以刺激AAV的復(fù)制。AAV的復(fù)制在某些細胞也可以自發(fā)發(fā)生。目前十二頁\總數(shù)四十二頁\編于十一點染色體q13.4的AAVS1位點中最少33bp的序列，包含由8個核苷酸分開的RBE樣和TRS樣序列，對AAV的靶向整合是必須而且充分的條件。位點特異性的整合過程即使是在Rep78和Rep68蛋白理想表達的條件下，未必是完全是位點特異的，大約40-70%的整合發(fā)生在AAVS1位點溶原性階段（lysogenicstage）目前十三頁\總數(shù)四十二頁\編于十一點AdV能提供輔助功能的基因有E1a，E1b55K，E2a，E4orf6和VARNA（viralassociatedRNA）。

HSV-1能提供輔助AAV復(fù)制功能，至少涉及HSV-1的復(fù)制蛋白，包括helicase/primasecomplex(UL5,UL8,和UL52)和DNA結(jié)合蛋白ICP8（UL29）。裂解階段（lyticstage）目前十四頁\總數(shù)四十二頁\編于十一點對環(huán)境理化因素的抵抗力AAV對理化因素如溫度和pH的抵抗力強。對化學(xué)消毒劑如1％的次氯酸鈉、2％戊二醛、0.25％十二烷基硫酸鈉等敏感。目前十五頁\總數(shù)四十二頁\編于十一點第二部分致病性與免疫性

約80%的人群的血清抗AAV抗體陽性，這些抗體針對的血清型是AAV-1，2，3和AAV-5型。但針對AAV在人群自然感染史的認識非常少，且未發(fā)現(xiàn)這些感染導(dǎo)致臨床典型的病理改變或疾病。目前十六頁\總數(shù)四十二頁\編于十一點蛋白表達型腺相關(guān)病毒載體

基因打靶型腺相關(guān)病毒載體rAAV的純化和定量三成分包裝系統(tǒng)

自我互補型AAV載體（self-complementaryAAVvector，scAAV）反式剪接型AAV載體（trans-splicingAAVvector,tsAAV）衣殼蛋白修飾型AAV載體第二節(jié)腺相關(guān)病毒載體

轉(zhuǎn)基因技術(shù)原理目前十七頁\總數(shù)四十二頁\編于十一點第一部分蛋白表達型腺相關(guān)病毒載體三成分包裝系統(tǒng)

:重組AAV病毒體（rAAV，ssAAV,Sigle-strandedAAV）的組裝，必須依賴于三種成分，即：轉(zhuǎn)移載體，由轉(zhuǎn)基因表達讀框以及兩側(cè)的野生型AAV的ITR區(qū)組成；AAV的cap和rep編碼序列；輔助病毒功能建立了各種各樣的方法和細胞培養(yǎng)系統(tǒng)以制備rAAV，并且這些方法和培養(yǎng)系統(tǒng)還在不斷完善之中目前最常使用的rAAV載體系統(tǒng)是二(或三)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293法(two/threeplasmidtransfectionofadherentHEK293cells)，包括rAAV轉(zhuǎn)移載體，rAAV輔助質(zhì)粒和(或)輔助病毒質(zhì)粒三部分目前十八頁\總數(shù)四十二頁\編于十一點三成分包裝系統(tǒng)

:rAAV轉(zhuǎn)移載體僅保留野生型AAV基因組中決定其復(fù)制、包裝和整合必須的順式作用元件——基因組兩端的ITR序列；全部去掉rep

和cap基因及其控制序列，用外源基因及其控制序列代替。實際包裝外源基因的上限僅為4.4kb。rAAV輔助質(zhì)粒是克隆的ITR缺失的野生型AAV的基因組，以反式方式提供rep

和cap基因編碼蛋白的功能。目的在于病毒包裝過程中，避免野生型AAV病毒的形成。AdV輔助病毒質(zhì)粒，包括其起輔助功能的基因E2a，E4orf6和VARNA。E1a和E1b55K可由HEK293細胞提供。第一部分蛋白表達型腺相關(guān)病毒載體目前十九頁\總數(shù)四十二頁\編于十一點三成分包裝系統(tǒng)優(yōu)點:三成分包裝系統(tǒng)不足:快速、有效，避免了輔助病毒的使用當(dāng)rAAV用于心臟、肝臟和骨骼肌等器官時，制備大量的rAAV耗時、耗力

采用大規(guī)模懸浮細胞培養(yǎng)技術(shù)可克服這一障礙，并研制了三種替代的方法第一部分蛋白表達型腺相關(guān)病毒載體目前二十頁\總數(shù)四十二頁\編于十一點三成分包裝系統(tǒng)的大規(guī)模懸浮細胞培養(yǎng)技術(shù):采用重組桿狀病毒表達系統(tǒng)BEVS（baculovirusexpressionvectorsystem），提供三種成分并感染昆蟲細胞或利用包含cap和rep的穩(wěn)定包裝昆蟲細胞系；包含cap和rep的穩(wěn)定包裝哺乳動物細胞系，并通過感染AdV提供輔助功能；利用哺乳動物細胞系和重組HSV-1提供cap和rep，rAAV和輔助功能。第一部分蛋白表達型腺相關(guān)病毒載體目前二十一頁\總數(shù)四十二頁\編于十一點策略2constructedAdhelperplasmidsthatarecotransfectedontoE1a/E1b-expressing293cellsalongwithaplasmidthatexpressestherepandcapgenesandavectorplasmid60°C,30minForty-eighttoseventy-twohoursaftertransfectionAdisinactivatedbyheattreatment目前二十二頁\總數(shù)四十二頁\編于十一點目前二十三頁\總數(shù)四十二頁\編于十一點自我互補型AAV載體（self-complementaryAAVvector，scAAV）重組AAV（ssAAV）進入細胞后，在啟動蛋白表達之前，重要的限速步驟是單鏈基因組需要轉(zhuǎn)換成為雙鏈基因組。McCarty等缺失了rAAV的一個ITR區(qū)的TRS（△trs），阻止其突變末端參與復(fù)制的啟動，最終形成一個呈現(xiàn)串聯(lián)的、單鏈的反向重復(fù)的基因組，其兩端是野生型的ITR，但中間一個是突變型的ITR。脫出衣殼后，將以中間突變的ITR為基礎(chǔ)折疊形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，形成自我互補的雙鏈，因此，在組織或體外實驗中可以快速和高效表達。這種類型的scAAV的包裝能力僅為ssAAV的一半，大約2.3kb。最近的進展是利用scAAV表達小干擾RNA(siRNA，small-interferenceRNA)。第一部分蛋白表達型腺相關(guān)病毒載體目前二十四頁\總數(shù)四十二頁\編于十一點自我互補型AAV載體（self-complementaryAAVvector，scAAV）由于ssAAV和scAAV載體的包裝容量均有限，限制了在基因治療領(lǐng)域的應(yīng)用。第一部分蛋白表達型腺相關(guān)病毒載體目前二十五頁\總數(shù)四十二頁\編于十一點反式剪接型AAV載體（trans-splicingAAVvector,tsAAV）單鏈線性AAVDNA的自由末端以頭-尾相接的形式經(jīng)分子間內(nèi)重組形成的串聯(lián)的二聚體（concatemers），介導(dǎo)AAV在特定組織(如肌肉)中的非整合性長效表達。利用此原理，將一個較大的外源基因拆分成兩個部分，分別包括剪接供體位點SD（splicedonorsites）和剪接受體位點SA（spliceacceptorsites），建立兩個不同的rAAV載體或不同亞型的ITR雜交載體，即反式剪接型AAV載體；共感染靶細胞后，可以指導(dǎo)兩個外源基因片段形成首尾拼接的異二聚體、經(jīng)正確剪接后形成完整的基因而獲得表達。該型載體可克服包裝容量的限制，可達9kb，并成功在肺臟、肌肉和視網(wǎng)膜等表達。第一部分蛋白表達型腺相關(guān)病毒載體目前二十六頁\總數(shù)四十二頁\編于十一點自我互補型AAV載體（self-complementaryAAVvector，scAAV）總體而言，反式剪接型AAV載體較ssAAV低效。第一部分蛋白表達型腺相關(guān)病毒載體目前二十七頁\總數(shù)四十二頁\編于十一點衣殼蛋白修飾型AAV載體

交叉包裝型AAV載體（cross-packagingAAVvector）：利用同一AAV載體的基因組包裝入不同血清型的衣殼，便于直接比較不同的血清型以及在體內(nèi)的組織極性的差異，為了利用不同衣殼的組織極性而有目的改造。鑲嵌型載體（mosaicvectors）：將不同血清型的衣殼按照不同比例混合。嵌合型病毒體（chimericvirions）：將不同血清型的VP蛋白重新聯(lián)合形成。第一部分蛋白表達型腺相關(guān)病毒載體目前二十八頁\總數(shù)四十二頁\編于十一點衣殼蛋白修飾型AAV載體

免疫逃避載體：分子進化方法如DNA洗牌（DNAshuffling）和易錯PCR（error-pronePCR）等技術(shù)構(gòu)成的突變衣殼蛋白庫，然后直接進行定向篩選抵抗中和抗體、或具有特定受體親和性、或細胞嗜性的rAAV，或者經(jīng)位點導(dǎo)向的突變（site-directedmutagenesis）、特異肽端插入（peptideinsertion）和化學(xué)接合（chemicalconjugation）等方法細胞靶向特異性AAV載體(targetspecificAAVvector)：利用不同細胞表面的特定受體，對AAV衣殼蛋白進行插入突變或缺失，導(dǎo)致配體改變組織特異性AAV載體（tissue-specificAAVvector：利用特定組織細胞表達的啟動子，以實現(xiàn)靶向特定組織如肌肉、肺臟和腫瘤等第一部分蛋白表達型腺相關(guān)病毒載體目前二十九頁\總數(shù)四十二頁\編于十一點第二部分基因打靶型腺相關(guān)病毒載體野生型AAV-2在Rep的作用下，定點整合于人19號染色體的AAVSl位點。重組AAV不含rep基因，定點整合的可能性極度下降。可以通過高MOI感染以及對細胞敏感的血清型的衣殼包裝，可能增加AAV的單鏈DNA入核并與細胞染色體發(fā)生重組的幾率?；虼虬行虯AV載體依賴于DNA的雙鏈斷裂(doublestrandbreak，DSB)，AAV可通過同源重組修復(fù)DNA雙鏈可介導(dǎo)包括插入、缺失、點突變等多種遺傳修飾的細胞內(nèi)的基因打靶。因此，基因打靶型AAV載體重點在于設(shè)計，載體序列與染色體靶基因序列的同源臂的匹配長度，將載體上待突變的基因放在中央。3~5%的感染細胞可以發(fā)生整合，顯著高于轉(zhuǎn)染或電穿孔方式獲得的基因打靶頻率，且在打靶中AAV介導(dǎo)的基因表達可以長期持續(xù)、并具有高度的保真性。目前三十頁\總數(shù)四十二頁\編于十一點rAAV載體應(yīng)用于基因校正、基因阻斷治療疾病或生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因家畜、用于農(nóng)業(yè)和研究的大型動物等具有無可比擬的優(yōu)勢，如：介導(dǎo)的基因打靶的效率高達1％、高于質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染或電轉(zhuǎn)化，宿主范圍廣泛，可利用的多種亞型等。主要缺陷是大約10％仍是隨機整合、具有潛在的致死或致癌效應(yīng)。研究顯示可采用成體干細胞并在體外篩選特異打靶克隆用于疾病治療。第二部分基因打靶型腺相關(guān)病毒載體目前三十一頁\總數(shù)四十二頁\編于十一點策略3細胞內(nèi)整合表達目前三十二頁\總數(shù)四十二頁\編于十一點

純化（三種方法）離子交換色譜法（IEXchromatography）：原理是依據(jù)在某一PH條件下，不同血清型的AAV的衣殼蛋白的電荷不同，因而，可以利用這一技術(shù)將不同的血清型的AAV分離純化.優(yōu)勢:具有快速、規(guī)?；⒖芍貜?fù)性以及適用于不同血清型病毒純化的。缺點:在于需要摸索鹽和PH濃度，以利于AAV病毒顆粒結(jié)合于IEX離子柱，而且這些條件依據(jù)不同的血清型而有所變化；另外常需要多步驟才能獲得高純度的rAAV。第三部分純化和定量目前三十三頁\總數(shù)四十二頁\編于十一點

純化（三種方法）受體特異性的親和純化（Receptor-specificaffinitypurification）：Heparansulfateproteoglycan(HSPG)是AAV-2感染細胞的受體，因此肝素親和色譜分析法（Heparinaffinitychromatography）利用AAV-2和細胞特定受體結(jié)合這一特點，進行AAV-2的純化，可獲得高滴度和高純度的純化產(chǎn)物并可以用于臨床試驗，這也是rAAV-2在臨床試驗中作為使用最廣的原因之一。依據(jù)同樣原理，mucin被作為親和配體以純化AAV-5。缺點是不同的血清型的受體不同，因此，適用范圍較窄。第三部分純化和定量目前三十四頁\總數(shù)四十二頁\編于十一點

純化（三種方法）AVB葡聚糖凝膠親和色譜法：以AAV衣殼中高度保守的表位為基礎(chǔ)，制備的單鏈抗體（14kDa）并在酵母中表達純化后鉸鏈到葡聚糖凝膠，以純化AAV的多個血清型（如AAV-1，2，3，5和8）。

第三部分純化和定量目前三十五頁\總數(shù)四十二頁\編于十一點定量采用含Rep/cap基因的細胞并接種于96孔細胞培養(yǎng)板，用AdV輔助病毒感染后，系列稀釋的rAAV接種并用TCID50計算終點滴度，同時聯(lián)合作為標準檢查病毒基因滴度的qRT-PCR技術(shù)?；虿捎胷HSV表達Rep/cap基因作為輔助病毒的方法，可選用更多的細胞類型用于定量。第三部分純化和定量目前三十六頁\總數(shù)四十二頁\編于十一點具有復(fù)制能力的rcAAV(replication-competentAAV)需要對終產(chǎn)物檢測是否具有復(fù)制能力的rcAAV(replication-competentAAV)，這通常是由于載體與細胞系或輔助質(zhì)粒中存在互補序列造成，可影響病毒載體的表達。常將rAAV制備物稀釋后感染293細胞（或其它缺乏AAV基因的合適細胞），并在輔助病毒存在情況下作用48或72h，僅其中的rcAAV才能復(fù)制，收集細胞，凍融后的產(chǎn)物重復(fù)感染293細胞2次以上，用針對AAV的ITR區(qū)和rep基因的引物進行qRT-PCR檢測。第三部分純化和定量目前三十七頁\總數(shù)四十二頁\編于十一點第三節(jié)腺相關(guān)病毒載體的醫(yī)學(xué)應(yīng)用

生物醫(yī)學(xué)的各種基礎(chǔ)研究基因治療病毒學(xué)和分子生物學(xué)體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移和表達研究rAAV載體的構(gòu)建、生產(chǎn)和功能評價，臨床前研究，人體臨床試驗，離體細胞水平的臨床前和臨床研究腫瘤治療rAAV載體的生物分布和應(yīng)用途徑與細胞和基因治療等的相關(guān)研究目前三十八頁\總數(shù)四十二頁\編于十一點rAAV載體的DNA在細胞內(nèi)常存在于染色體外，而且在體內(nèi)持續(xù)存在的時間較長，可以持久表達外源基因目前三十九頁\總數(shù)四十二頁\編于十一點基因治療單基因遺傳病腫瘤神經(jīng)系統(tǒng)疾病視網(wǎng)膜疾病心血管疾?。ㄐ乃ィ╆P(guān)節(jié)炎慢性紊亂傳染性疾病

目前四十頁\總數(shù)四十二頁\編于十一點目前四十一頁\總數(shù)四十二頁\編于十一點Glybera(alipogenetiparvovec)becamethefirstg