抗體工程概述

抗體工程概述第一頁，共67頁。概述概述第二頁，共67頁。講述內(nèi)容1抗原2抗體3多克隆抗體4細胞工程抗體5基因工程抗體6抗體的分離純化與鑒定7抗體的應(yīng)用及免疫學(xué)檢驗技術(shù)第三頁，共67頁。第四頁，共67頁。抗體基本結(jié)構(gòu)第五頁，共67頁。免疫球蛋白的基本結(jié)構(gòu)第六頁，共67頁。第七頁，共67頁。第八頁，共67頁?？贵w攻擊病毒第九頁，共67頁。凝集細菌第十頁，共67頁?？筍ARS的單抗SARS-CoV第十一頁，共67頁?？贵w是對其抗原有極強專一性的魔彈或巡航導(dǎo)彈研究 以免疫轉(zhuǎn)印法檢測

特定抗原醫(yī)療 以毒素連結(jié)抗體攻擊

病變細胞檢驗 以ELISA偵測特定

病原體第十二頁，共67頁?？贵w藥物銷售趨勢圖第十三頁，共67頁。表已批準(zhǔn)上市的治療性單抗2001淋巴瘤CD52人源化抗體Campath2000淋巴瘤CD33人源化抗體化療藥物交聯(lián)物Mylotarg1998移植排斥兔多抗Thymogloblin1998RSV感染RSVF蛋白人源化抗體Synagis1998 乳腺癌HER-2人源化抗體Herceptin19981999炎癥性腸病類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎TNF-α人-鼠嵌合抗體Remicade1998移植排斥CD25人-鼠嵌合抗體Simulect1997淋巴瘤CD20人-鼠嵌合抗體Rituxan1997移植排斥CD25人源化抗體Zenapax1994冠心病血小板受體ⅡbⅢa 人-鼠嵌合FabReoPro1995大腸癌17-1A鼠單抗Panorex1986移植排斥CD3鼠單抗 OKT3批準(zhǔn)日期適應(yīng)癥 靶向抗原抗體種類抗體名稱第十四頁，共67頁。生物技術(shù)生物技術(shù)制藥基因工程藥物（蛋白類藥物）人源化治療性單克隆抗體藥物基因治療技術(shù)現(xiàn)代中藥第十五頁，共67頁。●至2000年底，在美國藥品市場上生物技術(shù)藥物有76種，其中抗體藥物有15種。●2003年治療用單抗銷售總額已超過52億美元。●2006年預(yù)計50-60個治療性單抗上市?！?010年預(yù)計單抗銷售額200億美元?！衩绹颜既騿慰故袌?0%—一支獨秀?！裢耆嗽椿瘑慰宫F(xiàn)有多個處于臨床前階段第十六頁，共67頁?？贵w生成技術(shù)第十七頁，共67頁。Epitope,Antigenicdeterminant抗原決定基●

一個抗原分子上可能有數(shù)個抗原決定基●

每個

抗原決定基

至少誘生一種專一性抗體●蛋白質(zhì)性

抗原決定基

含有六個以上氨基酸第十八頁，共67頁。整體水平抗體生成技術(shù)細胞工程抗體生成技術(shù)基因工程抗體生成技術(shù)多克隆抗體（抗血清）單克隆抗體嵌合抗體、改形抗體“小型化抗體”（單鏈抗體）組合抗體庫技術(shù)噬菌體抗體庫技術(shù)Ig基因轉(zhuǎn)基因小鼠抗體真核表達技術(shù)第十九頁，共67頁。多克隆抗體第二十頁，共67頁。多克隆抗體（polyclonalantibody）指由不同B細胞克隆產(chǎn)生的針對抗原物質(zhì)中多種抗原決定簇的多種抗體混合物。如:免疫血清（含多種特異性抗體）。

實際意義：（1）預(yù)防、治療感染性疾病，如：破傷風(fēng)抗毒素血清抗破傷風(fēng)，胎盤球蛋白抗病毒感染等副作用：超敏反應(yīng)（2）臨床診斷，如：肥達氏反應(yīng)--傷寒、副傷寒缺點：特異性差。第二十一頁，共67頁。傳統(tǒng)抗血清抗原免疫所有抗體混合123412341234脾臟淋巴結(jié)B細胞第二十二頁，共67頁。

傳統(tǒng)抗血清的交叉反應(yīng)專一性反應(yīng)沒有反應(yīng)交叉反應(yīng)+-?123AgA

xyzAgB1’20AgA’123123123第二十三頁，共67頁。單克隆抗體第二十四頁，共67頁?？缮a(chǎn)有用抗體的

淋巴細胞

若與

癌細胞融合，則形成穩(wěn)定而可培養(yǎng)的細胞株。癌細胞可培養(yǎng)生長漿細胞Bcell可分泌抗體融合瘤HybridomaYYYYYYYYYYYYYYYYYY細胞融合兩組染色體混在一起也可以培養(yǎng)生長產(chǎn)生專一性抗體一個Bcell只產(chǎn)生一種抗體第二十五頁，共67頁。

●

一個

B細胞只能生產(chǎn)一種抗體，對付某一

抗原決定基?！?/p>

若有許多抗原決定基，則需許多株

B細胞分別生產(chǎn)許多抗體。BBBYYYY抗原BYB親和力成熟11Y22Y33Y44抗原決定基第二十六頁，共67頁。1234mmmm12341234單抗細胞融合取出脾細胞+癌細胞各抗體分開第二十七頁，共67頁。1234mmmm1234YYYYYYYYY第二十八頁，共67頁。m核酸補救合成m核酸從頭合成核酸氨甲喋呤(A)(-)次黃嘌呤(H)\胸苷(T)TKHGPRT

TK-HGPRT-第二十九頁，共67頁。

抗體-a-b-c-d-a-b-c-d抗原決定基BALB/cabbcd傳統(tǒng)抗體(抗血清)是所有抗體的混和

脾臟產(chǎn)生各種

B細胞免疫前要先把抗原作成乳劑免疫

抗原采血后可得傳統(tǒng)抗血清已建立之小鼠骨髓癌細胞株由脾臟收集B細胞抗原通常有多個抗原決定基免疫后的脾臟約在兩月內(nèi)注射五到八次AgX第三十頁，共67頁。-d細胞融合-a-b-c-dAgXAgX’ELISAHATPEGCellfusionHybridomacells融合瘤細胞（Subcloning）

(確定只有一種細胞)d’dabcdabcd’+++++++-X-d-c-b-a+--dNS-1骨髓癌細胞Bcell脾細胞分株培養(yǎng)篩選篩選單抗傳統(tǒng)抗體(抗血清)試驗專一性對抗原的反應(yīng)無法分辨完全不同d舊有抗原d’新的抗原第三十一頁，共67頁?；蚬こ炭贵w第三十二頁，共67頁。第三十三頁，共67頁。1人一鼠嵌合抗體(ChimericAntibodies)人一鼠嵌合抗體是將鼠源單抗的可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)融合而得到的抗體。第三十四頁，共67頁。

構(gòu)建嵌合抗體的大致過程是，將鼠源單抗的可變區(qū)基因克隆出來，連到包含有人抗體恒定區(qū)基因及表達所需的其它元件(如啟動子、增強子、選擇標(biāo)記等)的表達載體上，在哺乳動物細胞(如骨髓瘤細胞、CHO細胞)中表達。構(gòu)建重組表達載體第三十五頁，共67頁?？寺∈髥慰沟目勺儏^(qū)基因，可從基因組文庫中分離，也可用PCR技術(shù)分離。人抗體恒定區(qū)可根據(jù)需要選擇，不同的恒定區(qū)會帶給嵌合抗體不同功能。為避免人抗體的恒定區(qū)產(chǎn)生不需要的副作用，可通過點突變來修飾調(diào)整其效應(yīng)。

人一鼠嵌合抗體與鼠單抗相比，免疫原性大大降低，利于在人體內(nèi)應(yīng)用，所以目前已制備出上百種抗各種抗原(包括腫瘤相關(guān)抗原)的嵌合抗體。第三十六頁，共67頁。2鼠單抗可變區(qū)的人源化

盡管嵌合抗體的免疫原性已降低很多，但有時它仍可能引發(fā)較強的免疫反應(yīng)。為了進一步降低抗體的鼠源成分，發(fā)展出CDR移植技術(shù)。CDR移植即把鼠抗體的CDR序列移植到人抗體的可變區(qū)內(nèi)，所得到的抗體稱CDR移植抗體或改型抗體，也就是人源化抗體。

第三十七頁，共67頁。第三十八頁，共67頁。經(jīng)過CDR移植，抗體的免疫原性極低，而其抗原結(jié)合能力保持不變，結(jié)合半抗原及全抗原(如細胞表面受體、病毒等)的改形抗體都已有報道，到現(xiàn)在已有數(shù)百種人源化抗體。（美國正式上市的11種治療性單抗中多數(shù)是改型抗體）第三十九頁，共67頁。人源化抗體的構(gòu)建可用全合成法或定點突變法。全合成法是以人抗體序列為骨架，以鼠抗體的CDR置換人抗體的CDR，將整個可變區(qū)序列的兩條鏈分解成若干片段，并使相鄰的片段具有彼此互補的粘性末端。合成所有DNA片段，每組片段分別退火，然后逐組連接成完整的可變區(qū)基因，插入質(zhì)粒中，進一步即可用于構(gòu)建和表達改形抗體。

第四十頁，共67頁。

定點突變法是將人的可變區(qū)基因克隆，根據(jù)鼠抗體的CDR序列合成幾種突變引物，用定點突變的方法將人的可變區(qū)基因的CDR序列變?yōu)槭罂贵w的CDR序列，然后表達出改型抗體。

研究表明，在構(gòu)建改形抗體時，簡單地進行CDR替換并不能保證抗體具有好的親和力，因此在構(gòu)建時還必需包括對影響抗原結(jié)合位點的空間結(jié)構(gòu)的框架序列進行操作。第四十一頁，共67頁。小分子抗體包括Fab、Fv或ScFv、單域抗體及最小識別單位等幾種。小分子抗體有很多優(yōu)點:

可以用細菌發(fā)酵生產(chǎn)，成本低;分子小，穿透力強;不含F(xiàn)c，沒有Fc帶來的效應(yīng);在體內(nèi)循環(huán)的半衰期短，易清除，利于解毒排出;易于與毒素或酶基因連接，便于直接獲得免疫毒素或酶標(biāo)抗體等。

3小分子抗體第四十二頁，共67頁。FvScFv單區(qū)抗體最小識別單位Fab第四十三頁，共67頁。由完整的輕鏈和Fd組成，大小為完整分子的1/3。

把Fab與細菌的前導(dǎo)肽相連，在前導(dǎo)肽的作用下Fab進入質(zhì)周腔，裝配折疊后，它具有結(jié)合抗原的活性。(1)Fab第四十四頁，共67頁。

Fv、ScFv的大小約為全分子的1/6。(2)Fv或ScFv

FvScFv連接肽第四十五頁，共67頁。

Fv由VH與VL構(gòu)成，由于其結(jié)合是非共價結(jié)合，故Fv不穩(wěn)定。在VH與VL之間加上一段連接肽，把VH與VL連成一條單鏈，得到ScFv，即單鏈抗體。

連接肽的長度在10-15個氨基酸左右，不宜太長或太短，它應(yīng)具有柔軟性，側(cè)鏈少，抗原性弱等特點。常用的連接肽是(GGGGS)3。

第四十六頁，共67頁。

單鏈抗體的構(gòu)建在已知親本DNA序列時可用完全人工合成法;在具備親本單抗可變區(qū)的cDNA克隆時，可用定點突變法在其兩端造成適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶位點，與人工合成的連接肽編碼序列連接，組裝到表達載體中;如果從雜交瘤細胞系構(gòu)建單鏈抗體，可用PCR方法擴增可變區(qū)基因，再組裝到適當(dāng)?shù)谋磉_載體上。第四十七頁，共67頁。

單鏈抗體最常用的表達體系是大腸桿菌，有2種方式:一是表達為包涵或非包涵體的不溶蛋白。產(chǎn)量高，可達細菌蛋白總量的5%-20%，但需進行變性復(fù)性，使其形成正確的立體結(jié)構(gòu)，恢復(fù)抗體活性;二是分泌型表達，將細菌的信號肽序列與單鏈抗體的氨基端相連，單鏈抗體分子就可分泌到質(zhì)周腔和細菌體外，進行折疊后成為有活性的分子。但產(chǎn)量不及前者，一般實驗室培養(yǎng)條件下每升細菌的產(chǎn)量僅在數(shù)毫克左右。第四十八頁，共67頁。即為VH，約為完整分子的1/12。它只由一個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，故稱單域抗體。單域抗體盡管親和力有所降低，但仍保持著原單抗的特異性。(3)單域抗體VH第四十九頁，共67頁。約為完整分子的1/80-1/70大小，一般由一個CDR構(gòu)成，它也保持著抗體的特異性。(4)最小識別單位CDR第五十頁，共67頁。4雙特異抗體和多價抗體

雙鏈抗體（Diabody）一詞最早由Hollinger等于1993年創(chuàng)造。乃是一種小分子的雙價雙特異性抗體片段。

第五十一頁，共67頁。

雙特異性抗體(bispecificantibody,BSAb)是指能同時識別2種抗原的抗體。1種為對應(yīng)腫瘤相關(guān)抗原。另1種為對應(yīng)效應(yīng)成分。

即能結(jié)合靶腫瘤細胞又能結(jié)合高細胞毒性的效應(yīng)細胞,將效應(yīng)細胞富集在腫瘤周圍,而且可以模擬天然配體的作用,與細胞表面引發(fā)分子結(jié)合,激活效應(yīng)細胞,實現(xiàn)對腫瘤細胞的殺傷和裂解。第五十二頁，共67頁。

Hollinger等巧妙地將Ａ抗原抗體的輕鏈可變區(qū)基因(VLA)與抗Ｂ抗原抗體的重鏈可變區(qū)(VHB)通過短肽連接子連接;同樣地,將VHA與VLB連接,將兩組嵌合基因置于雙順反子的表達質(zhì)粒中,構(gòu)建成雙鏈抗體的表達質(zhì)粒,目前報道的表達質(zhì)粒均為雙順反子。表達后,VLAVHB與VHAVLB交叉連結(jié),形成雙特異性抗體。第五十三頁，共67頁。第五十四頁，共67頁。所以雙特異性抗體與既往腫瘤免疫治療相比,除了能特異性識別腫瘤細胞外,還能將循環(huán)血液中的免疫效應(yīng)細胞再導(dǎo)向至腫瘤細胞處,從而使效應(yīng)細胞的抗腫瘤活性增強,發(fā)揮免疫導(dǎo)向作用,這是腫瘤治療的新突破。第五十五頁，共67頁。第五十六頁，共67頁。

抗體庫技術(shù)是用基因工程方法把人或其他動物的全部抗體的輕、重鏈可變區(qū)基因克隆出來，在原核載體上表達，然后篩選出所需的特異基因和抗體。

PCR技術(shù);免疫球蛋白Fab片段在大腸桿菌中的成功表達;

噬菌體表面展示文庫技術(shù)。5抗體庫技術(shù)第五十七頁，共67頁。

初期的抗體庫技術(shù)是從淋巴細胞中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA或直接用總DNA為模板，用PCR技術(shù)建立輕、重鏈文庫，在大腸桿菌中表達后篩選。

第五十八頁，共67頁。它是在PCR技術(shù)和PhageDisplay的基礎(chǔ)上實現(xiàn)的。其過程是把用PCR法得到的抗體基因插入絲狀噬菌體的DNA，與噬菌體外殼蛋白的基因相連，在輔助噬菌體的幫助下，噬菌粒包裝成絲狀噬菌體，抗體分子通過與PⅢ或PⅧ相連，在噬菌體表面的一端或分散分布，然后可直接對噬菌體表面的抗體分子進行篩選。噬菌體抗體庫技術(shù)第五十九頁，共67頁。

1990年McCafferty等成功地建立了噬菌體表面展示系統(tǒng)，通過將抗溶菌酶單鏈抗體基因克隆于fd噬菌體基因3的下游，使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌體表面，利用親和層析