分子生物學(xué)技術(shù)理論

分子生物學(xué)研究技術(shù)朱國(guó)輝一般認(rèn)為1973年是基因工程誕生的元年。上世紀(jì)40年代——70年代初分子生物學(xué)領(lǐng)域理論上的三大發(fā)現(xiàn)和技術(shù)上的三大發(fā)明對(duì)于基因工程的誕生起到了決定性的作。第一節(jié)基因工程的誕生1944年，AveryO.T.利用肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)1、DNA是遺傳物質(zhì)被證實(shí)理論上的三大發(fā)現(xiàn)40年代，證實(shí)DNA是遺傳物質(zhì)

早在上世紀(jì)20年代，已經(jīng)知道染色體由DNA和組蛋白構(gòu)成，但組成蛋白的氨基酸有20種，而組成DNA的核苷酸只有4種，什么是遺傳物質(zhì)？

1928年，英國(guó)微生物學(xué)家F.Griffith著名的肺炎雙球菌感染小白鼠實(shí)驗(yàn)。

（1）S型：注射小白鼠，死亡。（2）S型，65℃加熱：注射小白鼠，活。（3）R型：注射小白鼠，活。（4）65℃加熱S型+R型：注射小白鼠，死亡。死鼠體內(nèi)得到了S型菌。

40年代，DNA是遺傳物質(zhì)被證實(shí)1944年，美國(guó)洛克菲勒研究所的OswaldAvery等公開(kāi)發(fā)表了改進(jìn)的肺炎雙球菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

（1）S型菌無(wú)細(xì)胞提取物及其純化的DNA都可使R型菌轉(zhuǎn)變成S型菌；（2）經(jīng)DNase處理的S型菌無(wú)細(xì)胞提取物失去了轉(zhuǎn)化作用。（3）經(jīng)胰蛋白酶處理的S型菌無(wú)細(xì)胞提取物仍有轉(zhuǎn)化作用。不僅證實(shí)了DNA是遺傳物質(zhì)，而且證明了DNA可以將一個(gè)細(xì)菌的性狀轉(zhuǎn)給另一個(gè)細(xì)菌，他的工作被稱(chēng)為是現(xiàn)代生物科學(xué)的革命性開(kāi)端。Watson和Crick2、DNA雙螺旋模型的提出50年代，DNA的雙螺旋模型的提出和DNA復(fù)制機(jī)理的闡明

DNA是遺傳物質(zhì)已被證實(shí)，但是DNA是怎樣攜帶并傳遞遺傳信息的？在細(xì)胞增殖過(guò)程中，DNA是怎樣復(fù)制的？因此，對(duì)于DNA結(jié)構(gòu)的研究成為了當(dāng)時(shí)生物學(xué)家研究的熱點(diǎn)。

1953年，F(xiàn)rancisCrick和JamesWatson搜集了力所能及的資料，提出了DNA的雙螺旋模型。隨后，DNA的半保留復(fù)制和半不連續(xù)復(fù)制機(jī)理也被闡明，為基因工程的誕生奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

Nireberg等為代表的一批科學(xué)家3、“中心法則”的提出60年代，確定了遺傳信息的傳遞方式（中心法則）

既然，DNA是遺傳信息的載體，那么它是如何傳遞遺傳信息的呢？遺傳信息又是如何控制生物的表型性狀的呢？以Nireberg等為代表的一批科學(xué)家經(jīng)過(guò)艱苦的努力，確定了遺傳信息以密碼方式傳遞，每三個(gè)核苷酸組成一個(gè)密碼子，代表一個(gè)氨基酸，到1966年，全部破譯了64個(gè)密碼子，并提出了遺傳信息傳遞的“中心法則”。

Smith等分離并純化了限制性核酸內(nèi)切酶HindII，1972年，Boyer等相繼發(fā)現(xiàn)了ＥcoRI一類(lèi)重要的限制性內(nèi)切酶。

1、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用技術(shù)上的三大發(fā)明1967年，世界上又五個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)DNA連接酶，特別是1970年Khorana等發(fā)現(xiàn)的T4DNA連接酶具有更高的連接活性。2、DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用1972年，美國(guó)Stanford大學(xué)的P.Berg等首次成功地實(shí)現(xiàn)了DNA的體外重組；3、載體的發(fā)現(xiàn)及其應(yīng)用1973年，Stanford大學(xué)的Cohen等成功地利用體外重組實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌間性狀的轉(zhuǎn)移。這一年被定為基因工程誕生的元年。3、載體的發(fā)現(xiàn)及其應(yīng)用Cohen等的重組實(shí)驗(yàn)示意圖TcrNerEcoRIEcoRI連接酶TcrNer雙抗重組菌落基因工程發(fā)展史上首次實(shí)現(xiàn)了重組DNA的細(xì)菌轉(zhuǎn)化基因工程研究的基本步驟1、從生物體中分離得到目的基因（或DNA片段）2、在體外，將目的基因插入能自我復(fù)制的載體中得到重組DNA分子。3、將重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞中，并進(jìn)行繁殖。4、選擇得到含有重組DNA分子的細(xì)胞克隆，并進(jìn)行大量繁殖，從而使得目的基因得到擴(kuò)增。5、進(jìn)一步對(duì)獲得的目的基因進(jìn)行研究和利用。比如，序列分析、表達(dá)載體構(gòu)建、原核表達(dá)以及轉(zhuǎn)基因研究和利用等?；蚬こ痰幕玖鞒袒蚍蛛x酶切載體酶切基因和載體連接導(dǎo)入細(xì)菌重組質(zhì)粒繁殖重組克隆的選擇序列分析和基因表達(dá)等研究導(dǎo)入植物細(xì)胞第二章基因操作的工具酶第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用第二節(jié)DNA連接酶及其應(yīng)用第三節(jié)DNA聚合酶及其應(yīng)用Geneticengineeringislargelyanexerciseincarefullycontrolledenzymology.Avarietyofenzymesformthebasictoolkitofthegeneticengineer.

1、限制性核酸內(nèi)切酶的分類(lèi)合命名2、II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性3、限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng)第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶的概念限制性核酸內(nèi)切酶（Restrictionendonucleases）：是一類(lèi)能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中某種特定的核苷酸序列，并能精確特異地切割雙鏈DNA分子的核酸內(nèi)切酶。已經(jīng)從近300中微生物中分離出了500余種限制性核酸內(nèi)切酶。限制性核事酸內(nèi)切酶恰的分類(lèi)1.限劈燕制修飾活附性2.內(nèi)溜切酶的蛋賓白質(zhì)結(jié)構(gòu)3.限尿制輔助因稍子4.切仍割位點(diǎn)5.病特異性挨切割6.基刷因克隆中I型單一多牲功能的然酶3種不糕同亞基ATP、莊Mg2+和S-腺本苷甲硫氨旨酸距特異性何位點(diǎn)10波00bp不是無(wú)用II妙型限制酶搞和修飾里酶分開(kāi)單一成分Mg2+特異性位犁點(diǎn)及其附匹近是非常有用III襖型雙功能女酶2種亞基ATP、蘆Mg2+和S-腺怠苷甲硫氨浴酸特異性位趴點(diǎn)3’端佳24-2貪6bp處是有用限制性貢核酸內(nèi)默切酶的程命名1、寄主菌料屬名的鑰第一個(gè)劃字母和五種名的桿頭兩個(gè)野字母組苦成3個(gè)菊斜體字母的疊略語(yǔ)表脆示酶來(lái)譜源的菌蔑種名稱(chēng)崗，如大筐腸桿菌Esch邊eric脈hiacol陰i表示為Eco,流柳感嗜血陸菌Haem驚ophi滲lus榮infl洞uenz柳ae表示為Hin；2、用一個(gè)話正體字事母表示普菌株的況類(lèi)型，灣比如EcoR、Hind；3、如果一種啊特殊的寄袖主菌株具盈有幾個(gè)不己同的限制潤(rùn)修飾體系盾，則用羅馬壤數(shù)字標(biāo)繡出，比乎如EcoRI、HindIII。II型限面制性核酸粥內(nèi)切酶的刷3大特點(diǎn)1、識(shí)轟別位點(diǎn)扯的特異鉗性每種酶都電有其特定麻的DNA蠢識(shí)別位點(diǎn)，哄通常是默由4、摩5、6罷或7個(gè)測(cè)核苷酸饑組成的鎖特定序列（靶序攪列）。2、識(shí)別堆序列的對(duì)國(guó)稱(chēng)性靶序列通較常具有雙烏重旋轉(zhuǎn)對(duì)庭稱(chēng)的結(jié)構(gòu)吳，即雙礦鏈的核訓(xùn)苷酸順宗序呈回慌文結(jié)構(gòu)狂。3、切割估位點(diǎn)的規(guī)醋范性雙鏈D跳NA被爭(zhēng)酶切后免，分布鋼在兩條鏈上汁的切割齊位點(diǎn)旋曉轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)鑄（可形征成粘性束末端或殊平末端的區(qū)DNA戒分子）輔。與II型朵核酸內(nèi)切開(kāi)酶有關(guān)的擴(kuò)幾個(gè)概念粘性末端cohe荷siveends因酶切甚位點(diǎn)在屯兩條D畜NA單射鏈上不聯(lián)同（對(duì)濱稱(chēng)）酶旨切后形達(dá)成的具貞有互補(bǔ)偵堿基的考單鏈末背端結(jié)構(gòu)林，酶切番產(chǎn)生的字兩個(gè)粘提性末端叼很容易通過(guò)互補(bǔ)返堿基的配喚對(duì)而重新連接起來(lái)。平末險(xiǎn)端Blu河nt捎end因酶切位較點(diǎn)在兩條棕DNA單隆鏈上相同谷，酶切后闊形成的平活齊的末端摟結(jié)構(gòu)，這彈種末端不易重新連接起來(lái)。幾種II擺型限制性勞核酸內(nèi)切澆酶的酶切沾位點(diǎn)PstIProvindenciastuartii164

CTGCAGGACGTCHaemophilusinfluenzaeRd

一個(gè)酶驕單位（U）指：在理想虜?shù)姆磻?yīng)昏條件（差適宜的喚緩沖液衫和反應(yīng)脂溫度，抬通常為衣37℃煎）下，關(guān)50L反應(yīng)鼻體系中完勺全降解1訴g犧D(zhuǎn)N測(cè)A所需要酸的酶量。影響酶活能性的因素艷很多，最裁重要的有勝：A.DNA的俱純度和甲比基化程度B.甘油的瓶含量（芬不超過(guò)興5%）C.反應(yīng)體摧系中的緣瑞離子強(qiáng)擠度D.反應(yīng)體腳系的p垮H值F.反應(yīng)的溫專(zhuān)度條件（通常促為37℃）酶單位的述定義和影抖響酶活性透的因素Buff淋er(求10X)塞2.0LWate食r恨1沉6.5LDNA頌1.0LEnz機(jī)yme猾0線.5LVol卸ume北20.拉0L酶切確反槽應(yīng)的符基拍本步鵝驟＋－電泳紫外分搶析37℃潤(rùn)1h加反應(yīng)液CKMBuff吃er(皂10X)嫁2.核0LWate曾r鑰1柳6.5LDNA露1.0LEnz劣yme坊0鹿.5LVolu叢me饅20羨.0L1.0誕kb1.0筍kb0.4k鋒b0.5王kb0.6信kbCKMTT1、DN凈A連接酶躍作用的特配點(diǎn)2、D訪NA連脖接酶的善反應(yīng)條兆件第二節(jié)稿D臥NA連妙接酶及潛其應(yīng)用DNA連杠接酶作用炕的特點(diǎn)A.連紗接的兩條勵(lì)鏈必須分?jǐn)?shù)別具有頃3′端自塔由羥基（捎-OH）和5賣(mài)′端磷眠酸基團(tuán)麗（-P講），而護(hù)且只有繁這兩個(gè)羊基團(tuán)彼此相鄰脖時(shí)才能濃進(jìn)行連倒接反應(yīng)悅；B.系在羥基解和磷酸仰基團(tuán)間罷形成磷院酸二酯撫鍵是一生種耗能員過(guò)程，因此屈連接反應(yīng)搜必須有能銜量分子的滴參與，通蓋常有兩種能陷量分子便，即A拿TP和驢NAD徹+。OKNODNA連既接反應(yīng)的逝條件連接反醉應(yīng)最佳饞溫度為執(zhí)37℃呼，但是貿(mào)此時(shí)粘痛性末端泥間氫鍵凡結(jié)合不芝夠穩(wěn)定駕，而且戚酶活性混也會(huì)迅擊速降低瞧。比如盜，Ec明oRI賣(mài)粘性涉末端連臟接部位乘只有4清個(gè)堿基豆對(duì)，很糞容易斷筑開(kāi)。所臉以通常在4袋-16℃連接。影響連接熄效率的因釘素有：A.嗽溫度（較最主要盛的因素躲）B.之ATP還的濃度(10M-桑1M)C.連節(jié)接酶濃度底（平末端職較粘性末恒端要求高情）D.瞎反應(yīng)時(shí)相間（通迎常連接駐過(guò)夜）E.插姥入片段和拋載體片段的摩爾比轉(zhuǎn)化4℃過(guò)夜加反應(yīng)液CK-重組菌落CK+粘性末端耗DNA片放段的連接NickNic姑k1、大樣腸桿菌綱DNA潛聚合酶總I2、Kl露enow壞片段第三節(jié)逝DNA磚聚合酶及雙其應(yīng)用大腸桿蘋(píng)菌DN宰A聚合蘋(píng)酶I（E。C盆oliDNA慨po灰lI涉）是K撞orn無(wú)ber執(zhí)gA秋.1古956沃年首先勇從大腸粥桿菌E。Co恰li細(xì)胞中矩分離出販來(lái)的。抓它是一元種多功黎能性的叢酶，包猾括3種不拍同的酶閱活力：5′-盒3′聚合秀酶活性以雙鏈D規(guī)NA為模紫板，催化膨單核苷酸過(guò)結(jié)合到引槐物的3′憤末端，并贏不斷延伸哥。5′-張3′外切殊酶活性將雙鏈D媽NA中游鹿離的5′趟末端逐個(gè)靈切去。3′駛-5滾′外切黎酶活性將游離的稈雙鏈或單之鏈DNA如的3′端澇降解。不體過(guò)對(duì)于雙度鏈的降解案可被5′膚-3′的瘦多聚活性冰所抑制。CCGGGCT鴿ATCG吉GACCGGGCTATCGGAPolI+Mg2+ATAGCCTCCGA茶TAGC稱(chēng)CTGGC變TAT對(duì)CGG阿ACCGA疊TAGC益CTGGC校TACCGATAGCCTGGCTATCGGAPolI+Mg2+CCGATAGCCTGGCTAPolI+Mg2+T1、大腸咸桿菌DN背A聚合酶巨I2、K截len脖ow片尋段第三節(jié)藝D瞎NA聚筐合酶及辜其應(yīng)用Klen更ow片段肅的主要用周途Kle摔now歡片段大腸桿蝦菌聚合研酶I困全酶桂經(jīng)枯草折桿菌蛋漸白酶處艦理后產(chǎn)帳生的大體片段酶歉分子，褲它仍然做有5′銷(xiāo)→3′腦的聚合殖酶活性濟(jì)和3′→5青′的診核酸外保切酶活頭性，但必失去了鹽5′→消3′的惱外切酶訴活性。Kle提now氏片段的往主要用咬途修補(bǔ)限魄制性酶爐消化D拜NA形陪成的3只′隱蔽勾末端標(biāo)記DN帳A片段的吼末端cDN莊A克隆繼中第二懲鏈cD周NA的稿合成DNA序鹿列的測(cè)定GAACTT樣AA第三章棕基因克耐隆的載體引矩言畫(huà)（in顛tro訓(xùn)duc鋪tio賭n）第一節(jié)季質(zhì)粒殲載體（p易lasi痕mid室vect右ors）第二節(jié)展噬菌譜體載體（嚴(yán)phag時(shí)eve震ctor葵s）第三節(jié)柱柯斯哪質(zhì)粒載體們（cos辟mid增vect坐ors）第四節(jié)濫人工護(hù)染色體載厘體（B/目Y/HA定C）引言基因克隆律的本質(zhì)是使目短的基因丘在特定但的條件誦下得到擴(kuò)增和斃表達(dá)，而目丑的基因歇本身無(wú)竄法進(jìn)行矮復(fù)制，惡所以就慢必須借矮助于“載體挺”及其“寄主抽細(xì)胞”來(lái)實(shí)現(xiàn)熟。作為基因聞克隆的載嘉體必須具牧備以下特撇性：能在寄主威細(xì)胞中進(jìn)樹(shù)行獨(dú)立的氏復(fù)制和表請(qǐng)達(dá)；具有1-理2個(gè)選擇身標(biāo)記基因銅，如對(duì)抗復(fù)生素的抗庸性基因等揚(yáng)；具備多克鑼隆位點(diǎn)（債MCS）寧，而且可睡攜帶外源境DNA片盆段的長(zhǎng)度獅范圍較寬判。自身分艘子量較躁小，在委寄主細(xì)劃胞中的繞拷貝數(shù)吹高，易養(yǎng)于操作昆和DN夜A的制樣備。Cha晃rac謝ter旦ist吃ics織of啊ve鮮cto封rs里for榴ge倡ne癢clo麻nin具gMCSMarkerForeigngene第三章乳基因克囑隆的載體引益言（i淡ntro授duct墻ion）第一節(jié)許質(zhì)粒載吐體（p熔las腦imi干dv臨ect菌ors賀）第二節(jié)騎噬菌體醋載體（柄pha罷ge壟vec得tor率s）第三節(jié)銹柯斯連質(zhì)粒載體棄（cos男mid燙vect青ors）第四節(jié)響人工染不色體載浮體（B漁/Y/橡HAC腥）第一節(jié)骨質(zhì)粒技載體（pla贏simi互dve章ctor買(mǎi)s）1、質(zhì)粒轉(zhuǎn)載體的生獨(dú)物學(xué)特性2、質(zhì)詢粒載體巴相關(guān)知咽識(shí)介紹1.質(zhì)蓬粒載體滾的生物旋學(xué)特性（1）質(zhì)粒是一種廣泛濾從在于細(xì)篇菌細(xì)胞中染色體以外的能自主的復(fù)池制的裸露的環(huán)狀雙塑鏈DN辣A分子，贏比病毒郊更簡(jiǎn)單輝。在霉嬸菌、藍(lán)扯藻、酵儉母和一犁些動(dòng)植惠物細(xì)胞交中也發(fā)皮現(xiàn)了質(zhì)愚粒，目籃前對(duì)細(xì)怖菌的質(zhì)刻粒研究很得比較聰深入，埋特別是虧大腸桿創(chuàng)菌的質(zhì)微粒。1.質(zhì)粒斜載體的生罰物學(xué)特性（2）質(zhì)粒的川大小差異很大，最小資的只有缸1kb褲,只能編碼中等蛙大小的2抓-3種蛋螞白質(zhì)分子頂，最大的鼻達(dá)到200谷kb。（3）質(zhì)粒的生足存在寄主聰細(xì)胞中“友好讓”地“借居”，離開(kāi)被了寄主納它本身給無(wú)法復(fù)辨制，它漿可以賦穗予窩寄岸主一些走非染色殊體控制畢的遺傳軋性狀，喜以利于勒寄主的生包存。比寬如，對(duì)里抗菌素鋤的抗性姓，對(duì)重盼金屬的抗性孤等。1.質(zhì)粒仍載體的生趙物學(xué)特性（4）質(zhì)粒的弓復(fù)制類(lèi)禍型一種質(zhì)粒思在宿主細(xì)拴胞中存在倘的數(shù)目稱(chēng)熊為該質(zhì)粒耀的拷貝數(shù)。據(jù)拷筋貝數(shù)將遮質(zhì)粒分役為兩種沖復(fù)制型款：“嚴(yán)緊型鋪”質(zhì)粒（sti面gent物pla帆smid側(cè)）,拷貝數(shù)為扁1-3；“松弛薦型”質(zhì)粒（蘋(píng)rel澡axe豎dp煎las不mid飾）,拷貝數(shù)為副10-6昏0。不過(guò)，震即使是同蓮一質(zhì)粒，霞其拷貝數(shù)蹤蝶在不同的君寄主細(xì)胞撓間也可能庸有很大的啊變化。（5）質(zhì)粒的不惜親和性兩種親緣宋關(guān)系密切持的不同質(zhì)遺粒不能在鍬同一宿主轟細(xì)胞中穩(wěn)辱定共存。1.質(zhì)咸粒載體耕的生物良學(xué)特性（6）質(zhì)粒的宅存在形耳式有超螺旋朗、開(kāi)環(huán)雙野螺旋和線寬狀雙螺旋碗三種，雙螺旋共價(jià)閉合環(huán)（超螺旋）開(kāi)環(huán)雙螺旋（一個(gè)裂口）線狀雙螺旋（兩個(gè)裂口）第一節(jié)牢質(zhì)粒載其體（pla丟simi稿dve懶ctor優(yōu)s）1、質(zhì)炕粒載體榨的生物晶學(xué)特性2、質(zhì)閥粒載體湖相關(guān)知叉識(shí)介紹質(zhì)粒：是一種爬裸露的助雙鏈閉喚環(huán)DN聾A分子土，它們沖在寄主踢細(xì)胞中賺能夠獨(dú)阻立地自厚我復(fù)制共從而得希到不斷腎的繁殖新。作為露基因工偽程載體淹，質(zhì)粒脾至少應(yīng)高該具備復(fù)制的補(bǔ)起始區(qū)暖、選擇專(zhuān)標(biāo)記基痕因區(qū)、暢多克隆惑位點(diǎn)等部分。多克隆昂位點(diǎn)：克隆載元體中的餅一段用帆于插入鑰外源D錫NA片嬸段的特磚定區(qū)域近，由一緩系列的蘆緊密相晚連的限霸制性內(nèi)城切酶位唱點(diǎn)組成旬，而且糟每個(gè)限貨制性內(nèi)注切酶位鴉點(diǎn)應(yīng)該鄉(xiāng)豐在整個(gè)最載體中清是唯一亮的。選擇標(biāo)嗓記基因凝：在基因述工程中緞的一類(lèi)津用于選柿擇轉(zhuǎn)化膨細(xì)胞（郊菌）的鋼抗性基露因，通鍋常是一顯些抗生造素抗性史基因，尚比如對(duì)傅氨芐青沿霉素、贈(zèng)四環(huán)素仍、氯霉服素、卡耳那霉素松以及潮臘霉素等塔具有抗山性的基缸因。這處樣，通佳過(guò)在培蘋(píng)養(yǎng)基中兔加入特晚定的抗臭生素就輔可以選帶自得到割轉(zhuǎn)化的爪細(xì)胞（紋菌）。（1）-互補(bǔ)(alph貍a-co扮mpl潤(rùn)eme扔nta打tio毒n)大腸桿領(lǐng)菌-半作乳糖苷將酶可以和其偷底物X-Ga泊l相互作用醉并且釋放繭出一種藍(lán)琴色物質(zhì)，愈當(dāng)該酶的-片裂段和-片摟段分開(kāi)時(shí)閘就失去渣了這種擋顯色的皆功能。蒸通常將臭編碼該鄰酶-片段的LacZ基因插騎入到載突體的多問(wèn)克隆位居點(diǎn)的側(cè)暮翼序列墾中，而牙在一些察人工構(gòu)默建的大刪腸桿菌朱株系中涌卻只能卵編碼產(chǎn)崖生該酶織的片段。這樣一座來(lái)，含有牌功能性完步整的LacZ基因的呆載體導(dǎo)騰入到這殿類(lèi)寄主掃細(xì)胞中仔時(shí)，載觸體編碼鎖的-片段就能和村寄主編俘碼的片段發(fā)生互補(bǔ)劣并具有了貢對(duì)底物X殖-gal陰的作用功訂能（發(fā)生揚(yáng)顯色反應(yīng)催），這種忙現(xiàn)象被成終為是alph坑a-co麗mpl倒eme找nta捧tio蛇n.2.質(zhì)意粒載體相屬關(guān)知識(shí)介化紹所以含插有這類(lèi)翻載體的魄菌落就闊很容易妙在含有翁底物X-Ga勇l和誘導(dǎo)兔物IPTG的平板上邪分辨出來(lái)插。因?yàn)檫@固類(lèi)菌落中釋放出歪的藍(lán)色物植質(zhì)可以果將整個(gè)倚菌落染擁成藍(lán)色挎，非常臉容易辨燦別。2.質(zhì)匯粒載體相既關(guān)知識(shí)介浴紹（2）P笑BR32望2Thi堵si譽(yù)so忠ne鳴of債theear森lie壯stgen印era挪lp菠urp幟ose捕cl施oni栽ng培vec冠tor請(qǐng)st濟(jì)ob罰ed衣eve灘lop糕ed.初It掌is缸a4363戰(zhàn)bpplas歲mid讓with瞇two峰ant喊ibio宜tic吐resi伏stan家ceg澇enes休,fo洋ramp擁ici垮lli磚nandtet濃rac倦ycl莊ine.Th眼ere梳are宅seve球raluni綿que殲re趴str朝ict斯ion努si濁t(yī)es.pB崗R322門(mén)gen歡eral頭lyd半oes即not泳give柏suc梢ha眾high友yie豪ldo練fpl至asmi欄dDN瓦Aas摧mod抖ern雙vect父ors途such主as瓦pUC,祝pGE攏Man駁dpB問(wèn)lues李crip殃t2.罪質(zhì)粒載枯體相關(guān)怖知識(shí)介蜂紹pBR3224363連接加反應(yīng)液TetorAmpTet+AmpCK+2.質(zhì)皂粒載體相煎關(guān)知識(shí)介房誠(chéng)紹思考題什么是限轉(zhuǎn)制性核酸荷內(nèi)切酶，釣它們是怎守樣命名的搞？II型限霉制性核酸模內(nèi)切酶的仔基本特性舅有哪些？什么是粘茂性末端、隸平末端？酶的單矩位是怎需樣定義驅(qū)的，影搶響酶活聾性的因阿素有哪杏些？DNA連烘接酶的作平用特點(diǎn)有她哪些？大腸桿菌物DNA聚昨合酶I泛有哪些不粘同的酶活妹力特性，創(chuàng)各有何利蓮用價(jià)值。Klen競(jìng)ow片段備和大腸桿濱菌DNA露聚合酶I俱有何異同畢？基因克隆戰(zhàn)的載體必朋須具備哪發(fā)些特性？質(zhì)粒載加體的生堆物學(xué)特吐性有哪燈些？第四章旬PCR技思術(shù)PCR搜技術(shù)簡(jiǎn)弊史PCR襯的原理PCR的憂反應(yīng)體系言和方法1989羅年美國(guó)《裹Scie之nce》扇雜志列P認(rèn)CR為撇十余項(xiàng)重殼大科學(xué)發(fā)稈明之首,保比喻19后89年為熄PCR爆串炸年,M控ulli窮s榮獲1嚼993年射度諾貝爾囑化學(xué)獎(jiǎng)。PCR技劍術(shù)簡(jiǎn)史DNA的哨復(fù)制核酸體撤外擴(kuò)增蛛的設(shè)想聚合酶畫(huà)鏈反應(yīng)累的發(fā)明1971年，Khorana提出：經(jīng)過(guò)DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過(guò)程便可克隆tRNA基因。但由于測(cè)序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以，Khorana的設(shè)想被人們遺忘了……PCR按技術(shù)簡(jiǎn)柱史DNA血的復(fù)制核酸體外占擴(kuò)增的設(shè)帥想聚合酶該鏈反應(yīng)接的發(fā)明1985年，美國(guó)PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制最初采用E-coliDNA聚合酶進(jìn)行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過(guò)程耗時(shí)，費(fèi)力，且易出錯(cuò)耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺(tái)PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀1993年，Mullis等因此項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）PCR的捏基本原理PCR反創(chuàng)應(yīng)條件PCR腰過(guò)程PCR貌的特點(diǎn)適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1劇~3步25~功30輪目的DN諸A片段擴(kuò)增10稱(chēng)0萬(wàn)倍以伏上DNA雙狠螺旋DNA濫單鏈與引物復(fù)對(duì)性DNA變通性形成2條騾單鏈子鏈延丙伸DNA加始倍PCR激的基本岸原理PCR反史應(yīng)條件PCR過(guò)湯程PCR的致特點(diǎn)1234522557294時(shí)間（m