細胞工程第九章轉(zhuǎn)基因動物與生物反應(yīng)器詳解演示文稿

細胞工程第九章轉(zhuǎn)基因動物與生物反應(yīng)器詳解演示文稿目前一頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點1（優(yōu)選）細胞工程第九章轉(zhuǎn)基因動物與生物反應(yīng)器目前二頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點2轉(zhuǎn)GH基因超級小鼠目前三頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點3轉(zhuǎn)基因兔、牛、豬、羊、魚、小鼠……

目前四頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點4新加坡國立大學(xué)生物系轉(zhuǎn)基因斑馬魚1.熒光魚目前五頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點5目前六頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點6目前七頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點72.蜘蛛羊目前八頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點8研究者將高度活躍的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK-C)基因注入老鼠胚胎。基因轉(zhuǎn)化的老鼠在運動時有效利用身體脂肪產(chǎn)生能量，同時避免產(chǎn)生大量乳酸。3.超級老鼠目前九頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點9不怕貓的老鼠。在科學(xué)家展示的照片中，一只褐色老鼠離一只貓不到一英寸，在貓的身邊嗅來嗅去。研究人員確認并移除了老鼠大腦嗅球上的某些感受器，結(jié)果這些老鼠變成了一群無所畏懼的嚙齒動物，在天敵面前轉(zhuǎn)來轉(zhuǎn)去，顯示出極強的好奇心，永遠不知道危險的存在。

4.無所畏懼老鼠目前十頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點10

2003年7月11日由陳系古教授領(lǐng)導(dǎo)的“人類轉(zhuǎn)基因動物模型的制作”課題組歷時5年，研制成功了四種轉(zhuǎn)基因小鼠。其中，熒光鼠為胚胎干細胞、人類基因功能、人體組織工程和克隆器官等研究提供了基礎(chǔ)；患白化病的小鼠轉(zhuǎn)導(dǎo)了酪氨酸酶基因后長出了黑毛；四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)和丙肝核心抗原的轉(zhuǎn)基因小鼠分別傳到第四、第三代，為制備人類丙肝病毒感染的雙基因動物模型提供了父代、母代。目前十一頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點11目前十二頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點12目前十三頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點13目前十四頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點14轉(zhuǎn)基因動物模型優(yōu)勢：可以從整體水平、器官水平、組織水平、分子水平進行多層次、全方位、深入而又系統(tǒng)的綜合研究。目前十五頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點15借助基因工程技術(shù)將外源基因?qū)胧荏w動物染色體內(nèi)，外源基因與動物基因整合后隨細胞的分裂而擴增，在體內(nèi)表達并能穩(wěn)定的移轉(zhuǎn)給后代的動物稱為轉(zhuǎn)基因動物。一、轉(zhuǎn)基因動物（transgeneticanimal）目前十六頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點16目的基因的來源采用限制性內(nèi)切酶，從生物組織中獲取目的基因；通過mRNA合成cDNA；人工合成的DNA片段；目的基因的克隆。目前十七頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點17顯微注射法病毒介導(dǎo)的生物學(xué)方法胚胎干細胞法精子載體法酵母人工染色體載體法其它二、培育轉(zhuǎn)基因動物的方法目前十八頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點181.顯微注射轉(zhuǎn)基因技術(shù)利用顯微操作技術(shù)轉(zhuǎn)移外源基因的方法。此法轉(zhuǎn)入基因長度可達數(shù)百kb；并能隨機地整合在受體體細胞染色體DNA上，因此應(yīng)用范圍廣。目前十九頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點19microinjection目前二十頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點20目前二十一頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點21受精卵顯微注射制備轉(zhuǎn)基因動物的缺點1.外源基因整合至基因組的效率很低，對經(jīng)濟大動物（猴、牛、羊）的整合效率更低；2.隨機整合，轉(zhuǎn)基因整合的位點和拷貝數(shù)無法控制，造成轉(zhuǎn)基因的表達差異很大，篩選高表達轉(zhuǎn)基因動物的工作量很大；3.對經(jīng)濟大動物，由于需要大量的供體和受體，耗時長、費用昂貴，受到很大的限制。目前二十二頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點22將目的基因重組到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上，制成高滴度病毒顆粒，人為感染著床前后的胚胎（也可直接將胚胎與能釋放逆轉(zhuǎn)錄病毒的單層培養(yǎng)細胞共同培養(yǎng)以達到感染目的),獲得轉(zhuǎn)基因動物的方法。

2、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法目前二十三頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點23

優(yōu)點：受精卵攜帶外源基因的陽性率高外源基因多單拷貝整合操作簡單，避免注射法對卵子的損害宿主范圍廣可同時感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高目前二十四頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點24缺點：容納大小有限(<10-15kb)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的長末端容易甲基化，影響外源基因的表達潛在致癌性,載體復(fù)雜整合率不高,胚胎自我保護機制對其有抗性目前二十五頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點253.胚胎干細胞方法目前二十六頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點26

優(yōu)點：外源基因整合情況的可控性高?？深A(yù)先在細胞水平檢測外源基因的拷貝數(shù)、定位、表達的水平及插入的穩(wěn)定性。外源基因?qū)隕S細胞的方法多樣，細胞鑒定及篩選方便。目前二十七頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點27

缺點：ES細胞系建立及培養(yǎng)困難維持ES細胞的未分化及多向分化潛能不易所得個體為嵌合體目前二十八頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點28目前，胚胎干細胞介導(dǎo)法在小鼠上應(yīng)用比較成熟，在大動物上應(yīng)用較晚。目前二十九頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點294.精子載體導(dǎo)入法目前三十頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點30

5酵母人工染色體載體法（YAC）利用酵母人工染色體(ＹＡＣ)作為載體制作轉(zhuǎn)基因動物的方法。

酵母人工染色體（ＹＡＣ）載體是近年來發(fā)展起來的新型載體,能克隆百萬對堿基的大片段ＤＮＡ。

目前三十一頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點31

優(yōu)點：保證大片段ＤＮＡ的完整性。

保證較長外源片段在轉(zhuǎn)基因動物研究中的整合率提高。

保證了目的基因上下游的側(cè)翼序列的完整性,因而可以消除或減弱基因整合后的位置效應(yīng)。

目前三十二頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點326、體細胞核移植法

將外源基因?qū)氲襟w細胞中，再將該細胞進行培養(yǎng)，選擇其中帶有外源基因的細胞進行擴增，用這種細胞的細胞核進行核移植（把體細胞核植入一個去了核的卵母細胞中，融合并激活），將重組胚進行體外培養(yǎng)或者植入同步化的假孕動物的輸卵管。目前三十三頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點337.其它方法……性腺轉(zhuǎn)基因方法

目前三十四頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點34

總結(jié)：轉(zhuǎn)基因動物的制作方法1、受精卵雄原核顯微注射法2、胚胎干細胞（ES細胞）法3、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法4、精子載體法5、YAC法6、體細胞核移植法目前三十五頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點35顯微注射法病毒介導(dǎo)的生物學(xué)方法胚胎干細胞法精子載體法酵母人工染色體載體法其它基因打靶二、培育轉(zhuǎn)基因動物的方法目前三十六頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點36基因打靶利用細胞脫氧核糖核酸(DNA)可與外源性DNA同源序列發(fā)生同源重組的性質(zhì)，定向改造生物某一基因的技術(shù)。1、基因敲除（geneknockout）2、基因替換（geneknockin）目前三十七頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點37基因敲除（geneknockout），指外源DNA與受體細胞基因組中序列相同或相近的基因發(fā)生同源重組，從而代替受體細胞基因組中的相同/相似的基因序列，整合入受體細胞的基因組中,而獲得的內(nèi)源目的基因缺失或功能喪失的轉(zhuǎn)基因動物。目前三十八頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點38基因替換（geneknockin），指外源DNA與受體基因組中特定的內(nèi)源基因發(fā)生同源重組而相關(guān)的兩個內(nèi)源基因中的一個基因的編碼區(qū)被另一個基因的編碼區(qū)的拷貝所置換的基因動物。目前三十九頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點39基因打靶基因敲除（geneknockout）將基因組特定內(nèi)源基因定點突變基因替換（geneknockin）將基因組特定內(nèi)源基因進行定向重組目前四十頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點40顯微注射法病毒介導(dǎo)的生物學(xué)方法胚胎干細胞法精子載體法酵母人工染色體載體法其它基因打靶二、培育轉(zhuǎn)基因動物的方法目前四十一頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點41三、轉(zhuǎn)基因動物的檢測目前四十二頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點42DNA的提取PCR/RT-PCRSouthern雜交表達產(chǎn)物的檢測（蛋白/下游產(chǎn)物）目前四十三頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點43

Southern印跡雜交技術(shù)是分子生物學(xué)領(lǐng)域中最常用的具體方法之一。其基本原理是：具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下，可按堿基互補的原則形成雙鏈，此雜交過程是高度特異的。Southern印跡雜交是進行基因組DNA特定序列定位的通用方法。一般利用瓊脂糖凝膠電泳分離經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的DNA片段，將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤或者紫外線照射固定，再與相對應(yīng)結(jié)構(gòu)的標記探針進行雜交，用放射自顯影或酶反應(yīng)顯色，從而檢測特定DNA分子的含量。目前四十四頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點441、改良動物品種2、生物制藥3、動物模型4、異體器官移植5、基因治療四、轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用目前四十五頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點45轉(zhuǎn)基因動物的低效性轉(zhuǎn)入基因造成宿主基因突變問題轉(zhuǎn)入基因的表達問題病毒轉(zhuǎn)基因研究存在的問題轉(zhuǎn)基因動物模型與預(yù)期不符問題乳腺生物反應(yīng)器的問題社會問題五、轉(zhuǎn)基因動物研究存在的問題目前四十六頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點46六、細胞轉(zhuǎn)染常用方法目前四十七頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點471.電穿孔法實現(xiàn)外源基因的轉(zhuǎn)移利用脈沖電場提高細胞膜的通透性，從而使外源DNA轉(zhuǎn)移至細胞中。此法簡單、效率較高，廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)細胞的基因轉(zhuǎn)移。目前四十八頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點482.磷酸鈣—DNA共沉淀法基因轉(zhuǎn)移技術(shù)這種方法是受二價金屬離子能促進細胞菌吸收外源DNA的啟發(fā)而發(fā)展起來的。當核酸以磷酸鈣—DNA共沉淀物的形式在時，細胞攝取DNA的能力顯著加強。磷酸鈣DNA復(fù)合物吸附細胞膜被細胞內(nèi)吞。不適用于原代細胞（所需的DNA濃度較高）,操作簡便但重復(fù)性差,有些細胞不適用目前四十九頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點493.脂質(zhì)載體法將需要轉(zhuǎn)移的外源DNA或RNA包裹于脂質(zhì)體內(nèi)，由于脂質(zhì)體具有磷脂雙層結(jié)構(gòu)，與細胞膜類似，因此可以與受體細胞膜融合，從而將外源DNA轉(zhuǎn)入宿主細胞。這種方法轉(zhuǎn)基因效率高。目前五十頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點50目前五十一頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點514.病毒介導(dǎo)的生物學(xué)方法（1）逆轉(zhuǎn)錄病毒（RNA病毒）（2）腺病毒（雙鏈DNA病毒）目前五十二頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點52目前五十三頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點53目前五十四頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點54目前五十五頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點55比利時藍牛目前五十六頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點56動物生物反應(yīng)器目前五十七頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點57

一般把目的片段在器官或組織中表達的轉(zhuǎn)基因動物叫動物生物反應(yīng)器（bioreactor），幾乎任何有生命的器官、組織或其中一部分都可經(jīng)過人為馴化為生物反應(yīng)器,從生產(chǎn)的角度考慮，生物反應(yīng)器選擇的組織和器官要方便產(chǎn)物的獲得，例如，乳腺、膀胱、血液等，由此發(fā)展了動物乳腺生物反應(yīng)器,動物血液生物反應(yīng)器和動物膀胱生物反應(yīng)器等。其中，轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器的研究最為引人注目。目前五十八頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點58一、動物血液生物反應(yīng)器

外源基因在血液中表達的轉(zhuǎn)基因動物叫血液生物反應(yīng)器。大家畜的血液容量較大,利用動物血液生產(chǎn)某些蛋白質(zhì)或多肽等藥物己取得了一定進展。外源基因編碼產(chǎn)物可直接從血清中分離出來,血細胞組分可通過裂解細胞獲得。目前五十九頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點59二、動物膀胱生物反應(yīng)器

外源基因在膀胱中表達的轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器,叫動物膀胱生物反應(yīng)器。膀胱尿乳頭頂端表面可表達一組尿血小板溶素的膜蛋白,這種蛋白在膀胱中表達具有專一性,而且它的基因是高度保守的,將外源基因插入5′端調(diào)控序列中,就可以指導(dǎo)外源基因在尿中表達。目前六十頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點60三、動物乳腺生物反應(yīng)器

動物乳腺生物反應(yīng)器利用哺乳動物乳腺特異性表達的啟動子元件構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物,指導(dǎo)外源基因在乳腺中表達,并從轉(zhuǎn)基因動物的乳液中獲取重組蛋白。目前六十一頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點611.動物乳腺生物反應(yīng)器的制備（1）表達載體的構(gòu)建目前用于表達載體的啟動子調(diào)控元件選用動物乳蛋白基因啟動子元件，主要有四類乳腺定位表達調(diào)控元件：第一類是B2乳球蛋白(BLG)，第二類是酪蛋白基因調(diào)控序列：第三類是乳清酸蛋白(WAP)基因調(diào)控序列；第四類是乳清白蛋白基因調(diào)控序列。目前六十二頁\總數(shù)六十六頁\編于二十一點62（2）目的基因的選擇選擇目的基因的基本要求是，正常情況下濃度低、翻譯后修飾復(fù)雜、其它表達體系