遺傳病基因診斷

基因診斷目前一頁\總數(shù)九十頁\編于七點主要內(nèi)容一、基因診斷概念二、基因診斷基本原理及常用技術(shù)

1、核酸分子雜交

2、探針標(biāo)記

3、PCR技術(shù)

4、DNA測序

5、DNA微陣列（DNA芯片）三、基因診斷方法四、基因診斷-------遺傳病產(chǎn)前診斷目前二頁\總數(shù)九十頁\編于七點一、基因診斷概念傳統(tǒng)診斷法:

表現(xiàn)型推測基因型?；蛟\斷法:

基因型推知表現(xiàn)型。檢測核酸分析特定基因判斷基因型。

基因診斷特征:1.檢測DNA不受被檢測來源的限制。2.癥狀前診斷成為可能。3.對遺傳病可進行分子水平再分類----遺傳異質(zhì)性的分子水平闡明。目前三頁\總數(shù)九十頁\編于七點二、基因診斷基本原理及常用技術(shù)1、核酸分子雜交雙鏈DNA變性

單鏈復(fù)性雜種DNA

加熱,強酸,探針強堿,變性劑探針:

一段與待測DNA或RNA互補的核苷酸序列,作為工作狀態(tài)的探針必須是單鏈。常用探針種類:

基因組DNA,cDNA,人工合成的寡核苷酸。目前四頁\總數(shù)九十頁\編于七點制備待測核酸樣品分離、變性、轉(zhuǎn)移、固化DNA片段雜交加入標(biāo)記核酸探針檢測雜交信號標(biāo)記核酸探針預(yù)雜交制備核酸探針漂洗去除未參與雜交的標(biāo)記探針核酸分子雜交操作程序目前五頁\總數(shù)九十頁\編于七點（1）斑點雜交

（Dotblottinghybridization）主要用于基因缺失和拷貝數(shù)改變。應(yīng)用：1）混合樣品DNA鑒定2）基因缺失檢測3）基因表達分析ASO探針（等位基因特異性寡核苷酸）----檢測已知點突變。目前六頁\總數(shù)九十頁\編于七點目前七頁\總數(shù)九十頁\編于七點1975年Southern建立的檢測DNA技術(shù)?；蚪MDNA限制酶消化凝膠電泳分離變性轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(尼龍膜)固定預(yù)雜交探針雜交洗膜放射自顯影分析雜交片段的大小及密度?？蓹z測:①DNA片段的缺失,插入,重排等。②改變限制酶酶切位點的點突變。③DNA擴增等拷貝數(shù)改變。④RFLP等多態(tài)性。（2）Southern印跡雜交目前八頁\總數(shù)九十頁\編于七點目前九頁\總數(shù)九十頁\編于七點目前十頁\總數(shù)九十頁\編于七點檢測RNA的分子雜交技術(shù)提取組織總RNAoligodTmRNA含甲醛的

瓊脂糖凝膠電泳分離轉(zhuǎn)移預(yù)雜交探針雜交洗膜放射自顯影。

檢測特異mRNA大小和表達量。（3）Northern印跡雜交目前十一頁\總數(shù)九十頁\編于七點目前十二頁\總數(shù)九十頁\編于七點目前十三頁\總數(shù)九十頁\編于七點染色體標(biāo)本上，組織切片上分子雜交原位雜交----3H標(biāo)記探針FISH-----熒光素或生物素標(biāo)記應(yīng)用于基因定位，染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)異常診斷。組織切片上的FISH----mRNA水平表達及一些病原體感染診斷。（4）原位雜交及熒光原位雜交

（Flurescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH）目前十四頁\總數(shù)九十頁\編于七點肌球蛋白mRNA在胚胎小鼠心臟原位表達目前十五頁\總數(shù)九十頁\編于七點熒光原位雜交（FISH）與染色體涂染目前十六頁\總數(shù)九十頁\編于七點目前十七頁\總數(shù)九十頁\編于七點1985年美國cetus公司的KaryMullis創(chuàng)建，80年代一向革命性技術(shù)，1993年獲諾貝爾化學(xué)獎。模擬生物體內(nèi)的DNA復(fù)制，在體外DNA聚合酶酶促合成某一特異DNA片斷的技術(shù)。3、PCR技術(shù)

（Polymerasechainreaction)目前十八頁\總數(shù)九十頁\編于七點步驟：

變性

20----30周期復(fù)性延伸引物的核苷酸順序?qū)Q定擴增片段特異性及其長度。該技術(shù)靈敏度高，特異性強，操作簡便，快捷，目前自動化操作。目前十九頁\總數(shù)九十頁\編于七點PCR擴增目前二十頁\總數(shù)九十頁\編于七點（1）PCR----RFLPPCR擴增后酶切，檢測點突變或多態(tài)。目前二十一頁\總數(shù)九十頁\編于七點（2）PCR----SSCP單鏈構(gòu)象多態(tài)（singlestrandconformationpolymorphism,SSCP）：DNA單鏈在非變性膠中電泳時形成立體構(gòu)象，其構(gòu)象與堿基順序相關(guān)。長度相同，但只要一個堿基的差別形成不同構(gòu)象泳動速率不同形成不同泳動帶。能檢測已知和未知點突變。目前二十二頁\總數(shù)九十頁\編于七點

---------------------------primer---------------------------↓32P-dNTP摻入PCR擴增產(chǎn)物↓變性↓單鏈DNA↓

中性聚丙烯酰胺凝膠電泳

↓12345

自顯影↓1.為正常結(jié)果分析2、4、5純合患者

3.為雜合子

PCR-SSCP過程目前二十三頁\總數(shù)九十頁\編于七點目前二十四頁\總數(shù)九十頁\編于七點(3)PCR----DGGE變性梯度凝膠電泳（denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGE）Tm值----DNA雙鏈50%解鏈溫度。Tm值主要與堿基組成相關(guān)。PCR擴增后的DNA，在變性梯度由低到高的聚丙烯酰氨凝膠電泳過程中，Tm值低的DNA片段先解鏈，電泳速度變慢一個堿基差異也能改變Tm值導(dǎo)致泳動速率改變產(chǎn)生泳動變位，能檢測已知，未知點突變。檢測突變率比PCR-----SSCP高。目前二十五頁\總數(shù)九十頁\編于七點目前二十六頁\總數(shù)九十頁\編于七點目前二十七頁\總數(shù)九十頁\編于七點4、DNA測序Sanger法-----雙脫氧核苷酸末端終止法。雙脫氧核苷酸不能形成5’磷酸和3’OH之間的磷酸二脂鍵（因3’也脫氧）而終止反應(yīng)。4個反應(yīng)體系分別加入ddATP，ddGTP，ddCTP，ddTTP，將產(chǎn)生不同長度（在A，G，C，T處隨機終止）的DNA片段，分別在變性凝膠電泳分離呈梯狀帶型，自下而上是5’3’被合成的DNA鏈順序。目前二十八頁\總數(shù)九十頁\編于七點目前二十九頁\總數(shù)九十頁\編于七點目前三十頁\總數(shù)九十頁\編于七點DNA自動測序應(yīng)用如上原理，不同的是：①4種不同熒光染料標(biāo)記的dNTP摻入酶促反應(yīng)(不用分4個反應(yīng)體系)。②經(jīng)過毛細(xì)管凝膠電泳分離(不用分4個泳道)。③激光分析和計算機處理，直接標(biāo)出堿基序列。目前三十一頁\總數(shù)九十頁\編于七點目前三十二頁\總數(shù)九十頁\編于七點目前三十三頁\總數(shù)九十頁\編于七點焦磷酸測序目前三十四頁\總數(shù)九十頁\編于七點焦磷酸測序檢測結(jié)腸癌KRAS基因突變目前三十五頁\總數(shù)九十頁\編于七點下一代“克隆”測序目前三十六頁\總數(shù)九十頁\編于七點5、DNA微陣列（DNA芯片）

在雜交測序基礎(chǔ)上發(fā)展起來的：①大規(guī)模集成電路手段把成千上萬個寡核苷酸探針有規(guī)律地排列在指甲大小的芯片上----制作寡核苷酸陣列。②將待測的DNA，RNA或cDNA用熒光標(biāo)記后在DNA芯片上與探針雜交。③用激光共聚焦顯微鏡對芯片進行掃描，配合計算機處理熒光信號，得出所需信息。目前三十七頁\總數(shù)九十頁\編于七點目前三十八頁\總數(shù)九十頁\編于七點目前三十九頁\總數(shù)九十頁\編于七點High-resolutionmeltcurveanalysis(HRM)目前四十頁\總數(shù)九十頁\編于七點Identificationofcopynumberchangesbyarraycomparativegenomichybridization(CGH)目前四十一頁\總數(shù)九十頁\編于七點三、基因診斷方法1、直接診斷：直接檢測致病基因缺陷性質(zhì)。

能作直接診斷的條件：遺傳方式已知病因基因或cDNA已克隆分離突變性質(zhì)與疾病關(guān)系已闡明

基因突變類型：

1、DNA堿基置換(點突變)2、DNA片段的缺失、插入、重復(fù)等

3、動態(tài)突變目前四十二頁\總數(shù)九十頁\編于七點檢測點突變已知點突變檢測：1、RFLP2、ASO探針雜交法3、等位特異性PCR4、PCR----SSCP5、PCR-----DGGE未知點突變檢測：1、PCR----SSCP2、PCR----DGGE3、DNA測序4、DHPLC目前四十三頁\總數(shù)九十頁\編于七點（1）RFLP方法---檢測已知突變基因較大片段缺失或插入酶切片段長度改變。基因點突變正好發(fā)生在某限制酶識別位點酶切點消失或增加酶切片段長度改變。酶切圖譜法檢測的缺點:①不直接影響酶切點的突變不能檢測到。②產(chǎn)生的片段大小太相似也不易被檢測到。特異性擴增含酶切位點的PCR擴增片段，再經(jīng)酶切后電泳檢測----更簡便,快速,也能彌補缺點②。目前四十四頁\總數(shù)九十頁\編于七點鐮狀細(xì)胞血紅蛋白（HbS）目前四十五頁\總數(shù)九十頁\編于七點56bp54bpA

……CC↓TGAGG……110bpS

……CCTGTGG……MstII

PCR目前四十六頁\總數(shù)九十頁\編于七點（2）ASO探針雜交法--檢測已知點突變等位特異性寡核苷酸探針（allelespecificoligonucleotideprobe，ASO）以點突變?yōu)橹行暮铣?0bp左右的一對探針：與正常序列雜交的探針與異常序列雜交的探針優(yōu)點：探針可準(zhǔn)確合成；不改變酶切位點的突變也能檢測。缺點:

突變位點及性質(zhì)清楚的前提下才能合成ASO探針，只能檢測已知點突變。目前四十七頁\總數(shù)九十頁\編于七點目前四十八頁\總數(shù)九十頁\編于七點2、間接方法---連鎖分析法基因內(nèi)或基因近旁DNA多態(tài)為遺傳標(biāo)記進行連鎖分析，判斷被檢者是否得到帶有致病基因的染色體而作出診斷。DNA多態(tài)性（DNApolymorphism）：群體當(dāng)中不同染色體上的基因每幾百個bp中大約有1個的比例存在堿基取代，但對表現(xiàn)型無改變，這種變異的頻率在群體中占1%以上，這種現(xiàn)象叫DNA多態(tài)性。這種變異以孟德爾共顯性遺傳方式傳遞。目前四十九頁\總數(shù)九十頁\編于七點目前五十頁\總數(shù)九十頁\編于七點第一代遺傳標(biāo)記：限制性片段長度多態(tài)性（Restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）目前五十一頁\總數(shù)九十頁\編于七點第二代遺傳標(biāo)記：數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)

（Variablenumbertandemrepeat，VNTR）大約幾十bp長的堿基序列在人群中其重復(fù)的拷貝數(shù)不同所產(chǎn)生的多態(tài)，一般在非編碼區(qū)中。小衛(wèi)星DNA(6~28bp)n

微衛(wèi)星DNA(2~6bp)n，也稱STRP（smalltandemrepeatpolymorphism）例如:FVIII基因ST14(DXS52)位點(60bp)nDMD基因intron44、45、49、50中(CA)nPAH基因intron3中STR(4bp)n優(yōu)點:群體中等位基因數(shù)目多，雜合子頻率高。目前五十二頁\總數(shù)九十頁\編于七點目前五十三頁\總數(shù)九十頁\編于七點目前五十四頁\總數(shù)九十頁\編于七點目前五十五頁\總數(shù)九十頁\編于七點目前五十六頁\總數(shù)九十頁\編于七點第三代遺傳標(biāo)記：單核苷酸多態(tài)

（Singlenucleotidepolymorphism，SNP）基因組中廣泛存在的堿基置換，大約幾百~1kb之中有一個。應(yīng)用于：疾病的關(guān)聯(lián)分析基因功能鑒定基因發(fā)現(xiàn)和制圖候選基因發(fā)現(xiàn)目前五十七頁\總數(shù)九十頁\編于七點連鎖分析舉例目前五十八頁\總數(shù)九十頁\編于七點連鎖分析舉例目前五十九頁\總數(shù)九十頁\編于七點連鎖分析舉例目前六十頁\總數(shù)九十頁\編于七點4.07.0II34.07.04.07.0I24.29.7II14.07.04.27.0I14.27.04.07.0II24.29.74.07.0連鎖分析舉例目前六十一頁\總數(shù)九十頁\編于七點連鎖分析的優(yōu)點不一定清楚病因基因的分子基礎(chǔ)，只要有基因內(nèi)或近旁DNA多態(tài)標(biāo)記就可以分析。缺點:1、必須要有先證者以及家系中相關(guān)各成員的DNA才能分析。2、攜帶者是雜合子時才能分析。3、連鎖分析要充分認(rèn)識到由于減數(shù)分裂時同源染色體交叉互換導(dǎo)致誤診的可能性。目前六十二頁\總數(shù)九十頁\編于七點四、基因診斷-------遺傳病產(chǎn)前診斷1、甲型血友?。℉emophiliaA）：FVIII因子遺傳性缺陷所致的凝血障礙性出血性疾病.發(fā)病率：男性的1/5000~1/10000，XR。癥狀:自然或輕微外傷后出血不止。皮下、關(guān)節(jié)、肌肉出血----關(guān)節(jié)強直、勞動力喪失。顱內(nèi)出血可危及生命。根據(jù)血漿中FⅧ濃度可分為輕、中、重度。目前六十三頁\總數(shù)九十頁\編于七點診斷、治療血漿代用品分離的FⅧ因子基因工程產(chǎn)品FVIII因子基因治療FVIII基因于1984年克隆并定位于Xq28，全長186kb，含26個外顯子，25個內(nèi)含子，mRNA全長為9kb，編碼2351個氨基酸。由于致病基因突變類型復(fù)雜多樣，且突變位點不集中------直接診斷受限制。目前六十四頁\總數(shù)九十頁\編于七點間接基因診斷方案：先檢測SRY，ZFY/ZFX基因，診斷性別后間接診斷——連鎖分析1、首先ST14（DXS52）位點的VNTR多態(tài)；2、FVIII基因intron18中的BclI/RFLP；3、FVIII基因intron22中的XbaI/RFLP；4、FVIII基因intron13中的（CA）n多態(tài)。直接診斷：檢測i22的倒位。目前六十五頁\總數(shù)九十頁\編于七點目前六十六頁\總數(shù)九十頁\編于七點目前六十七頁\總數(shù)九十頁\編于七點目前六十八頁\總數(shù)九十頁\編于七點2、假肥大型肌營養(yǎng)不良癥(DMD/BMD)肌萎縮中占60%。由于抗肌萎縮蛋白（dystrophin）遺傳性缺陷所致的進行性肌萎縮的致死性神經(jīng)肌肉性遺傳病。發(fā)病率為1/3500，XR遺傳。BMD比DMD發(fā)病晚，病情輕。主要癥狀：通常3---5歲發(fā)病，開始走路不穩(wěn)，鴨型步態(tài)，上樓梯困難，Gower征陽性，進行性肌萎縮伴有腓腸肌假性肥大，10多歲下肢癱，一般在20多歲之前死于心衰或呼吸衰竭。目前六十九頁\總數(shù)九十頁\編于七點目前七十頁\總數(shù)九十頁\編于七點目前七十一頁\總數(shù)九十頁\編于七點生化檢測：血清中磷酸肌酸激酶（CPK）升高。肌電圖：肌源性改變等。1987年Kunkel等克隆DMD基因，定位于Xp21，全長2400kb，含79個外顯子，cDNA長度為14kb。目前已知DMD的50%~80%是由于DMD基因不同區(qū)段的缺失，缺失發(fā)生熱點區(qū)位于DMD基因5′端（2~19）以及外顯子44~52。目前七十二頁\總數(shù)九十頁\編于七點直接基因診斷：應(yīng)用多重PCR（multiplexPCR）檢測缺失，12對引物（43），能檢測98%缺失。多重鏈接依賴探針擴增（Multiplexligation-dependentprobeamplification，MLPA）間接診斷:

RFLP連鎖分析（CA）n連鎖分析：DMD基因5′端和3′端，內(nèi)含44、45、49、50中的（CA）n多態(tài)，進行單體型連鎖分析。目前七十三頁\總數(shù)九十頁\編于七點多重PCR檢測缺失Duchenne/Becker型肌營養(yǎng)不良(DMD/BMD)方法：根據(jù)DMD基因缺失的分布設(shè)計12對引物，分成3組：第1組為外顯子19、43、45、34

引物第2組為外顯子51、12、50、53

引物第3組為外顯子48、17、8、52

引物分別對患者基因組DNA進行擴增，每次擴增均同時設(shè)空白和正常對照。目前七十四頁\總數(shù)九十頁\編于七點1:DL2000marker；2:正常對照(第1組引物)；3.4:檢出外顯子19的先證者和胎兒；5:正常對照(第2組引物)；6.7:檢出外顯子51的先證者和胎兒；8:正常對照(第3組引物)；9.10:檢出外顯子48的先證者和胎兒。目前七十五頁\總數(shù)九十頁\編于七點3、苯丙酮尿癥（phenylketonuria，PKU）由于苯丙氨酸羥化酶（phenylalaninhydroxyrase，PAH）遺傳性缺陷所致的遺傳性氨基酸代謝病發(fā)病率為1/16500，AR遺傳。臨床表現(xiàn)：智力低下黑色素形成障礙尿有特殊氨味目前七十六頁\總數(shù)九十頁\編于七點診斷、治療PAH基因于1983年定位于12q24，全長85kb，含13個外顯子，mRNA全長2.4kb，編碼451個氨基酸。PAH基因缺陷----以點突變?yōu)橹?，?/3點突變集中于外顯子7，另外外顯子6，11，12也較集中。PKU基因診斷策略:1、應(yīng)用內(nèi)含子3的STR多態(tài)進行連鎖分析。2、應(yīng)用PCR—SSCP，PCR—DGGE技術(shù)檢測外顯子第7、6、11、12的點突變。目前七十七頁\總數(shù)九十頁\編于七點目前七十八頁\總數(shù)九十頁\編于七點6%DGGE檢測家系成員PAH基因外顯子6的電泳圖：Ⅱ1Ⅰ1Ⅰ2Ⅱ2

ⅠⅡ121N？目前七十九頁\總數(shù)九十頁\編于七點4、先天愚型（Down綜合征）最常見的常染色體病，發(fā)病率為1/700—1/800，主要是21三體所致（約5%是易位型和嵌合型）。臨床特征：先天性智力低下、特殊面容、體格發(fā)育遲緩、伴先天畸型，特征性皮膚紋理等。基因診斷：1、應(yīng)用D21S11為遺傳標(biāo)記的定量PCR；2、熒光原位雜交（FISH）方法；3、熒光定量PCR（QF-PCR）。目前八十頁\總數(shù)九十頁\編于七點目前八十一頁\總數(shù)九十頁\編于七點熒光定量PCR方法檢測21-三體目前八十二頁\總數(shù)九十頁\編于七點五、