蛋白質(zhì)藥物的PEG化學(xué)修飾

蛋白質(zhì)藥物(yàowù)的PEG化學(xué)修飾

胡濤中國(guó)科學(xué)院過程工程研究所生化工程國(guó)家(guójiā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室第一頁，共44頁。1 1.迅速被體內(nèi)酶降解 2.腎小球過濾去除 3.抗原－抗體反響 4.溶解度差導(dǎo)致(dǎozhì)沉淀蛋白質(zhì)藥物(yàowù)在使用中出現(xiàn)的問題TC實(shí)際濃度理想濃度第二頁，共44頁。2體外聚乙二醇修飾(xiūshì)〔PEG化〕(1)增大藥物分子量，防止被腎小球過濾(2)阻礙蛋白酶的降解作用(3)屏蔽藥物的免疫位點(diǎn)(4)增加(zēngjiā)藥物在體液中的溶解度(5)與藥物間的化學(xué)鍵在體內(nèi)隨時(shí)間水解，緩慢釋放藥物+蛋白(dànbái)或多肽偶聯(lián)物聚乙二醇CH3(-O-CH-CH)n-OH第三頁，共44頁。3分離工程反應(yīng)工程劑型工程生物醫(yī)藥生物能源(néngyuán)生物材料生物化學(xué)品其它產(chǎn)品生化工程(gōngchéng)

〔生物化學(xué)工程(gōngchéng)，BiochemicalEngineering〕第四頁，共44頁。4目錄PEG修飾(xiūshì)的國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展PEG修飾(xiūshì)劑的研發(fā)PEG修飾(xiūshì)方法PEG修飾(xiūshì)工藝的優(yōu)化PEG修飾(xiūshì)產(chǎn)物的質(zhì)量控制第五頁，共44頁。5一、PEG修飾(xiūshì)的國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展第六頁，共44頁。6國(guó)際(guójì)上PEG修飾技術(shù)的研究進(jìn)展美國(guó)Rutgers大學(xué)Davis教授70年代的工作甲氧基PEG的應(yīng)用美國(guó)Enzon公司美國(guó)最早從事PEG修飾蛋白質(zhì)藥物的公司美國(guó)Shearwaters公司各種(ɡèzhǒnɡ)PEG修飾劑的生產(chǎn)商美國(guó)羅氏、先靈寶雅、安進(jìn)PEG藥物：PEG-INF，PEG-G-CSF其它：輝瑞、默克、葛蘭素史克、施貴寶。。。第七頁，共44頁。7國(guó)內(nèi)PEG修飾(xiūshì)技術(shù)的研究進(jìn)展國(guó)家863重大機(jī)密工程：人工血液代用品的研制，1997-2000中國(guó)科學(xué)院重點(diǎn)工程：血液代用品和血液凈化，2001-2005國(guó)家重大科技專項(xiàng)課題?創(chuàng)新(chuàngxīn)藥物和中藥現(xiàn)代化?：長(zhǎng)效基因工程蛋白質(zhì)和多肽制劑關(guān)鍵技術(shù)，2002-2005國(guó)家863重點(diǎn)工程課題：核酸和多肽的修飾和劑型化技術(shù)，2007-2010PEG修飾血紅蛋白：I期臨床〔中科院過程所、凱正公司〕PEG修飾G-CSF：III期臨床〔格蘭百克〕第八頁，共44頁。8修飾(xiūshì)粒細(xì)胞集落刺激因子〔rhG-CSF〕 延長(zhǎng)半衰期修飾(xiūshì)人腫瘤壞死因子 消除副作用修飾(xiūshì)白介素I受體拮抗劑〔rhIL-1Ra〕 延長(zhǎng)半衰期修飾(xiūshì)牛胰核糖核酸酶〔RNase〕 提高抗腫瘤活性修飾(xiūshì)超氧化物歧化酶〔SOD〕 提高半衰期修飾(xiūshì)天冬酰氨酶〔Aspartase〕 克服免疫原性 提高半衰期修飾(xiūshì)人干擾素〔IFN〕 提高半衰期修飾(xiūshì)血紅蛋白〔Hb〕 血液代用品修飾(xiūshì)胰島素 提高半衰期我國(guó)在PEG修飾蛋白質(zhì)方面的一些(yīxiē)工作第九頁，共44頁。9二、PEG修飾(xiūshì)劑的研發(fā)第十頁，共44頁。10Sc-PEG專利(zhuānlì)分析以PEG-OH為原料的必然(bìrán)途徑CH3OCH2CH2(OCH2CH2)nOH+光氣(ɡuānɡqì)+NHSCH3OCH2CH2(OCH2CH2)nO-C-O-N

+NH2——G-CSFOOOCH3OCH2CH2(OCH2CH2)nO-C-NH——G-CSF

O單鏈修飾：(SC-PEG)第十一頁，共44頁。11Roche公司(ɡōnɡsī)的長(zhǎng)效干擾素產(chǎn)品專利分析同樣是以PEG-OH為原料(yuánliào)的必然途徑雙鏈修飾(xiūshì)：第十二頁，共44頁。12新的修飾(xiūshì)策略采用新方法制備(zhìbèi)新的修飾劑以PEG-COOH〔CM-PEG)為原料(yuánliào)的必然途徑，已獲專利CH3(OCH2CH2)nOCH2CH2OHCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-O-N+NH2——G-CSFOOO單鏈修飾：CH3(OCH2CH2)nOCH2COOHCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH——G-CSFO(CM-PEG)第十三頁，共44頁。13我們(wǒmen)的策略以PEG-COOH為原料的必然(bìrán)途徑CH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NHOOO雙鏈修飾(xiūshì)：CH3(OCH2CH2)nOCH2COOH+LysineOCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH-O(CH2)3CH2CH-C-O-N+NH2——IFNCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NHOOCH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH-O(CH2)3CH2CH-C-NH——IFN第十四頁，共44頁。141、PEG修飾劑的批量(pīliànɡ)制備取得了成功取得的主要進(jìn)展分枝型ZL01141745.5分叉(長(zhǎng)尾)型ZL03100736.8可逆型ZL03105003.4不可逆型200410029577.1ZL02120740.2異端基雙官能團(tuán)200410029577.1第十五頁，共44頁。15聚乙二醇修飾(xiūshì)劑產(chǎn)品產(chǎn)品號(hào)末端基團(tuán)分子量包裝（g）價(jià)格（￥）mPEG-OH5-OH5K100103500700mPEG-OH10-OH10K1001070001400mPEG-OH20-OH20K1001070001400mPEG-COOH5-COOH5K10010100002000mPEG-COOH10-COOH10K10010150003000mPEG-COOH20-COOH20K10010200004000MPEG-NHS5-N-羥基琥珀酰亞胺5K1001052000040002000MPEG-NHS10-N-羥基琥珀酰亞胺10K1001053000060003000MPEG-NHS20-N-羥基琥珀酰亞胺20K1001053500070003500第十六頁，共44頁。16三、藥用蛋白(dànbái)的PEG修飾方法第十七頁，共44頁。17創(chuàng)新技術(shù)〔反響(fǎnxiǎng)器技術(shù)和產(chǎn)物移走技術(shù)〕①振蕩(zhèndàng)反響器②流加反響(fǎnxiǎng)器③緩釋反響器④固相反響方式⑥膜耦合反響方式⑤雙水相反響方式Q.Yun,R.Yang,T.Chen,J.Bi,G.Ma,ZSu.J.Biotechnology,2005,118:67-74中國(guó)創(chuàng)造專利，申請(qǐng)?zhí)?00510114930.0中國(guó)創(chuàng)造專利，申請(qǐng)?zhí)?4100295771.修飾反響器設(shè)計(jì)—PEG-pellet反響器第十八頁，共44頁。18吸附蛋白加入PEGPEG修飾洗脫2.固相吸附(xīfù)法制備PEG修飾蛋白第十九頁，共44頁。19固相吸附(xīfù)法與液相吸附(xīfù)法的比較1峰：原蛋白(dànbái)；2峰：?jiǎn)涡揎椀鞍?dànbái)；3峰：多修飾蛋白(dànbái)第二十頁，共44頁。20PEG-INF的制備(zhìbèi)過程G-CSFPEG-G-CSFCH3(-O-CH-CH)n-OH甲氧基PEG（mPEG-OH）活化的mPEG-O-醛醛制備單修飾(xiūshì)的藥用蛋白第二十一頁，共44頁。21粒細(xì)胞集落刺激(cìjī)因子(G-CSF)MW:18.8kd(174aminoacids)pI:6.1,1thiol,1N-terminal,4lysines,Halflife:5h,Weeklyinjection:7times第二十二頁，共44頁。22三批PEG30-rhG-CSF產(chǎn)品(chǎnpǐn)的制備取得的主要進(jìn)展序號(hào)產(chǎn)品批號(hào)試制日期試制量12007080012007-8-5~2007-8-15共3750mg：6mg/支，302支；3mg/支，210支；1.5mg/支，520支；6.6mg/ml，80ml22007090012007-9-8~2007-9-18共1263mg：3mg/支，400支；3.15mg/ml，20ml32007100012007-10-9~2007-10-21共1422mg：3mg/支，400支；3.4mg/ml，65ml。PEG化重組(zhònɡzǔ)人生長(zhǎng)激素，批產(chǎn)量1-10g；PEG化降纖酶，批產(chǎn)量6000支；環(huán)孢素A眼用微乳制劑，批產(chǎn)量5000支PEG化G-CSF2L修飾反響(fǎnxiǎng)器計(jì)算機(jī)程序控制批產(chǎn)量>3g生產(chǎn)周期10天第二十三頁，共44頁。23修飾和劑型化產(chǎn)品質(zhì)量到達(dá)國(guó)際(guójì)先進(jìn)水平生產(chǎn)規(guī)模產(chǎn)品質(zhì)量批次穩(wěn)定性123123123(A)(B)(C)以分子量為30kDa的PEG修飾rhG-CSF為例：(A)三批產(chǎn)品的SDS檢測(cè)(jiǎncè)圖譜(B)三批產(chǎn)品的高效凝膠過濾檢測(cè)(jiǎncè)圖譜(C)三批產(chǎn)品的園二色檢測(cè)(jiǎncè)圖譜第二十四頁，共44頁。244.引入巰基的方法制備(zhìbèi)PEG修飾蛋白(2)PEGylationSNH+(1)ThiolationHS-(CH2)3-C-NH-HbNH+NOOPEG-S-(CH2)3-C-NH-HbNH+OPEGNO2-iminothiolaneNH2-Hb第二十五頁，共44頁。25Sangart公司是一家(yījiā)私營(yíng)的生物制藥公司，主要從事氧載體的研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化Hemospan

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MP4

PhaseI–Sweden

Status:CompletePhaseIb/II–Sweden

Status:CompletePhaseII–Sweden

Status:CompletePhaseII–USA

Status:Enrollment

CompletePhaseIII–Europe

Status:Enrollment

Complete第二十六頁，共44頁。26該P(yáng)EG修飾產(chǎn)物的凝膠過濾(guòl(fā)ǜ)分析第二十七頁，共44頁。27四、PEG修飾(xiūshì)工藝的優(yōu)化第二十八頁，共44頁。28PEG修飾(xiūshì)反響參數(shù)的優(yōu)化建立反響(fǎnxiǎng)動(dòng)力學(xué)，包括位點(diǎn)反響(fǎnxiǎng)動(dòng)力學(xué)和蛋白分子反響(fǎnxiǎng)動(dòng)力學(xué)，優(yōu)化反響(fǎnxiǎng)時(shí)間優(yōu)化反響(fǎnxiǎng)的pH值優(yōu)化PEG與蛋白的摩爾比優(yōu)化反響(fǎnxiǎng)體系第二十九頁，共44頁。29pTimeppppp…………蛋白分子的修飾(xiūshì)反響動(dòng)力學(xué)WeijunLi,ZhiguoSu.Quantitativelyinvestigatingmonomethoxypolyethyleneglycolmodificationofproteinbycapillaryelectrophoresis,J.Biochem.Biophys.Methods.2004，59:65-74第三十頁，共44頁。30PEG修飾(xiūshì)的位點(diǎn)反響動(dòng)力學(xué)第三十一頁，共44頁。31PEG醛修飾(xiūshì)藥用蛋白的優(yōu)化反響第三十二頁，共44頁。32單修飾(xiūshì)產(chǎn)物的別離純化

P1P2第三十三頁，共44頁。33別離(biélí)產(chǎn)物分析6.514.3

29.0

66.420.1116

200KDa44.3

P1P2P1凝膠過濾(guòl(fā)ǜ)分析第三十四頁，共44頁。34膜耦合修飾工藝(gōngyì)制備PEG化藥用蛋白第三十五頁，共44頁。35五、PEG修飾產(chǎn)物(chǎnwù)的質(zhì)量控制第三十六頁，共44頁。36IEF和SDS鑒定(jiàndìng)PEG修飾蛋白1234+-IodinestainComassiebluestainSDSIEF1:Marker,2:HbA,3:-Hb4:(Propyl-PEG5K)6-Hb5:(Propyl-PEG5K)6--Hb1:HbA,2:-Hb3:(Propyl-PEG5K)6-Hb4:(Propyl-PEG5K)6--Hb

1

2

3

4

4

5

5

94.0

66.2

43.0

31.0

20.1

14.4

第三十七頁，共44頁。37RP-HPLC分析(fēnxī)胰蛋白酶切片段第三十八頁，共44頁。38質(zhì)譜分析胰蛋白酶(yídànbáiméi)切片段MALDI-TOF/TOF分析(fēnxī)PEG修飾位點(diǎn)在Val-1()第三十九頁，共44頁。39PEG修飾蛋白(dànbái)的結(jié)構(gòu)鑒定圓二色光譜(guāngpǔ)鑒定熒光光譜(guāngpǔ)鑒定第四十頁，共44頁。40RP-HPLC分析(fēnxī)PEG修飾蛋白第四十一頁，共44頁。41蛋白質(zhì)修飾(xiūshì)劑及其制備方法和用途,中國(guó)創(chuàng)造專利，制備分枝型聚乙二醇的新方法,中國(guó)創(chuàng)造專利，帶PEG長(zhǎng)尾的蛋白質(zhì)修飾(xiūshì)劑的制法和用途,中國(guó)創(chuàng)造專利，聚乙二醇羧酸的制備方法和其用途,中國(guó)創(chuàng)造專利，ZL重組人復(fù)合干擾素-聚乙二醇偶聯(lián)物的制備及其偶聯(lián)產(chǎn)物,中國(guó)創(chuàng)造專利，ZL2一種蛋白質(zhì)交聯(lián)劑及其交聯(lián)方法,中國(guó)創(chuàng)造專利，一種分級(jí)別離制備血紅蛋白偶聯(lián)物的方法,中國(guó)創(chuàng)造專利，一種二醇聚合物—?jiǎng)游镅t蛋白偶聯(lián)物的制備方法,中國(guó)創(chuàng)造專利，一種二醇聚合物—?jiǎng)游镅灏椎鞍着悸?lián)物的制備方法,中國(guó)創(chuàng)造專利分子量均一的聚合物血紅蛋白的制備方法,中國(guó)創(chuàng)造專利ZL01136190.5.血紅蛋白--人血清白蛋白偶聯(lián)物制備血液代用品及其制備方法,中國(guó)創(chuàng)造專利，Z蛋白質(zhì)修飾(xiūshì)國(guó)家創(chuàng)造專利11項(xiàng)〔已授權(quán)〕第四十二頁，共44頁。42PEG修飾(xiūshì)的SCI論文QYun,TChen,GZhang,JBi,GMa,ZSu.Anovelpolyethyleneglycolderivativesuitableforthepreparationofmono-PEGylatedprotein.BiotechLett,27,213-217,2005QYun,RYang,TChen,JBi,GMa,ZSu.ReproduciblepreparationandeffectiveseparationofPEGylatedrecombinanthumangranulocytecolony-stimulatingfactorwithnovel“PEG-pellet〞PEGylationmodeandion-exchangechromatography.JBiotech.2005,118:67-74QYun,MHe,WXing,JBi,GMa,ZSu,Anoveltetrafunctionalreagentforsimultaneousintramolecularandintermolecularcross-linkingofbovinehemoglobin,BiotechLett26:1359-1363,2004.XLi,FMeng,GMa,ZSu,Asimpleandefficientmethodforsynthesisofcarboxymethylatedpolyet