2017-新生物技術(shù)藥物

2017-新生物技術(shù)藥物第一頁，共55頁。第一節(jié)緒論第二頁，共55頁。生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展經(jīng)歷了三個(gè)不同的歷史階段，即天然藥物階段化學(xué)合成藥物階段基因工程藥物階段第三頁，共55頁。生物技術(shù)是指對有機(jī)體的操作技術(shù)，包括利用活的有機(jī)體來生產(chǎn)或修飾獲得產(chǎn)品的所有技術(shù)?，F(xiàn)代生物技術(shù)包括：基因工程、細(xì)胞工程、發(fā)酵工程和酶工程，其中核心技術(shù)是基因工程技術(shù)。第四頁，共55頁。生物技術(shù)藥物是采用現(xiàn)代生物技術(shù)人為地創(chuàng)造條件，借助生物體（微生物、動(dòng)物和植物等）或其組成部分（器官、組織、細(xì)胞、酶等）來產(chǎn)生所需要的醫(yī)藥產(chǎn)品。生物技術(shù)藥物的經(jīng)典定義：是指利用重組DNA技術(shù)獲得的蛋白質(zhì)多肽類藥物。第五頁，共55頁。人胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)胰島素的兩個(gè)肽鏈分別為21個(gè)氨基酸組成的A鏈和30個(gè)氨基酸組成的B鏈，氨基酸排列有種屬差異。1982年美國Lily公司開發(fā)世界上第一個(gè)基因工程----重組人胰島素第六頁，共55頁。先確對某種疾病有預(yù)防和治療作用的蛋白質(zhì)，然后將控制該蛋白質(zhì)合成過程的基因取出來，經(jīng)過一系列基因操作，最后將該基因放入可以大量生產(chǎn)的受體細(xì)胞中去（包括細(xì)菌、酵母菌、動(dòng)物或動(dòng)物細(xì)胞、植物或植物細(xì)胞），在受體細(xì)胞中不斷繁殖，大規(guī)模生產(chǎn)具有預(yù)防和治療這些疾病的蛋白質(zhì)。第七頁，共55頁。最近又研究了以酵母菌為宿主細(xì)胞進(jìn)行合成人胰島素?？蓞⒖嘉墨I(xiàn)：《人類胰島素基因的克隆及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建》、《產(chǎn)人胰島素畢赤酵母工程菌的構(gòu)建》第八頁，共55頁。一、生物技術(shù)藥物生物技術(shù)藥物或生物制品是一個(gè)更廣義的概念除了經(jīng)典的生物藥物如蛋白質(zhì)、多肽、抗體、DNA、RNA和寡核苷酸等外，還包括疫苗、組織、血液、血液制品以及由天然來源提取的細(xì)胞療法等。第九頁，共55頁。一、生物技術(shù)藥物全球藥物銷售統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2012年全球銷售居前20名的藥物中有8個(gè)生物藥物，而其中7個(gè)生物藥物列于銷量前10名的名單中。第十頁，共55頁。一、生物技術(shù)藥物1、與小分子藥物相比，生物藥物的藥效及特異性更強(qiáng)，且副作用較小；原因：很多生物藥物都具有獨(dú)特的空間構(gòu)象，而且通常它們都是內(nèi)源性物質(zhì)，它們在體內(nèi)與特定受體結(jié)合，這種結(jié)合具有很強(qiáng)的專一性。第十一頁，共55頁。一、生物技術(shù)藥物2、目前小分子藥物的研究已經(jīng)進(jìn)入了瓶頸期，生物藥物可能會(huì)為某些疾病的患者提供一線生機(jī)。第十二頁，共55頁。二、生物藥物開發(fā)的近況及挑戰(zhàn)1、生物藥物分子體積一般比較大，具有親水性和解離特性，導(dǎo)致其膜通透性極差，大部分生物藥物必須采用注射方式給藥以保證足夠的生物利用度。由于其血漿半衰期短，通常需要采取一日多次注射的給藥方案。第十三頁，共55頁。二、生物藥物開發(fā)的近況及挑戰(zhàn)2、大多數(shù)生物藥物的物理和化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，因此在處方設(shè)計(jì)時(shí)需要考慮很多策略改善其制劑處方，以提高生物藥物在制備、貯存、運(yùn)輸以及給藥時(shí)的穩(wěn)定性，確保它們的有效性和安全性。第十四頁，共55頁。二、生物藥物開發(fā)的近況及挑戰(zhàn)例如：蛋白質(zhì)藥物----集聚----激發(fā)機(jī)體---免疫應(yīng)答------機(jī)體分泌抗體清除該蛋白藥物-----改變該蛋白藥物的藥物動(dòng)力學(xué)行為---產(chǎn)生副作用第十五頁，共55頁。二、生物藥物開發(fā)的近況及挑戰(zhàn)3、與小分子藥物制劑相比，生物藥物制劑的研發(fā)過程中需要依靠更多不同的分析手段表征生物藥物的特征。例如：對乙酰氨基酚與阿達(dá)木單抗（P353)第十六頁，共55頁。二、生物藥物開發(fā)的近況及挑戰(zhàn)4、對于核酸類藥物如反義寡核苷酸、小干擾RNA和基因等作用靶點(diǎn)位于細(xì)胞內(nèi)的生物藥物，普通的液體注射劑已經(jīng)不能滿足其遞送要求，很難通過富含脂質(zhì)的細(xì)胞膜到達(dá)其胞內(nèi)靶點(diǎn)。研發(fā)核心：能高效幫助核酸跨越生物屏障的遞送系統(tǒng)第十七頁，共55頁。生物技術(shù)藥物的經(jīng)典定義：是指利用重組DNA技術(shù)獲得的蛋白質(zhì)多肽類藥物。第十八頁，共55頁。蛋白和多肽類藥物分子之間的區(qū)別，描述蛋白質(zhì)的構(gòu)象結(jié)構(gòu)？第十九頁，共55頁。第二節(jié)蛋白多肽類藥物制劑一、蛋白多肽類藥物的生產(chǎn)蛋白類藥物通常是利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞（中國地鼠卵巢細(xì)胞系）以及細(xì)菌（如大腸桿菌）或酵母細(xì)胞來進(jìn)行制備。蛋白質(zhì)產(chǎn)率是評價(jià)這一過程的效率的重要指標(biāo)。第二十頁，共55頁。二、蛋白多肽類藥物的結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)多肽分子量質(zhì)量＜5KD，由大約少于50個(gè)氨基酸所組成的肽鏈為多肽。蛋白質(zhì)分子量質(zhì)量＞5KD，具有三維機(jī)構(gòu)的大分子稱為蛋白質(zhì)。第二十一頁，共55頁。二、蛋白多肽類藥物的結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)大部分蛋白質(zhì)都具有三維結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)天然折疊形成的結(jié)構(gòu)稱為其天然構(gòu)象。蛋白質(zhì)分子構(gòu)象分為四級(jí)。一級(jí)結(jié)構(gòu)是指氨基酸殘基按照特定順序通過肽鍵連接形成的長鏈。第二十二頁，共55頁。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸長鏈通過規(guī)律性重復(fù)出現(xiàn)的局部結(jié)構(gòu)折疊形成二級(jí)結(jié)構(gòu)第二十三頁，共55頁。蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)第二十四頁，共55頁。氫鍵或二硫鍵進(jìn)一步相互交聯(lián)形成的鏈折疊稱為三級(jí)機(jī)構(gòu)，它是控制蛋白質(zhì)基本功能的結(jié)構(gòu)，疏水作用和離子相互作用等弱相互作用力通常對三級(jí)機(jī)構(gòu)起到穩(wěn)定化作用。第二十五頁，共55頁。蛋白質(zhì)多肽類藥物的活性與其機(jī)構(gòu)的完整性密切相關(guān)第二十六頁，共55頁。為什么蛋白類藥物需要在制劑中保持正確的折疊構(gòu)象？維持蛋白質(zhì)構(gòu)象結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的作用力包括哪些？第二十七頁，共55頁。三、蛋白多肽類藥物的穩(wěn)定性蛋白質(zhì)多肽類藥物，其生物活性的保持不僅取決于它的化學(xué)穩(wěn)定性，還取決于其物理穩(wěn)定性，即其空間構(gòu)象的穩(wěn)定性。第二十八頁，共55頁。化學(xué)不穩(wěn)定性表現(xiàn)為新化學(xué)鍵的形成或原化學(xué)鍵的斷裂導(dǎo)致其一級(jí)機(jī)構(gòu)的變化。變化過程包括蛋白質(zhì)或多肽的水解、脫酰胺、氧化、外消旋、二硫鍵斷裂等第二十九頁，共55頁。物理不穩(wěn)定性即其化學(xué)組成（一級(jí)結(jié)構(gòu)）不變，而高級(jí)結(jié)構(gòu)（二級(jí)及二級(jí)以上結(jié)構(gòu)）發(fā)生改變的過程。物理不穩(wěn)定性包括變性（去折疊）、聚集、沉淀和表面或界面吸附等。第三十頁，共55頁。三、蛋白多肽類藥物的穩(wěn)定性（一）化學(xué)不穩(wěn)定性1、脫酰胺反應(yīng)(P355）Glu谷氨酰胺Asp天冬酰胺側(cè)鏈上的酰胺基被水解，形成游離羧酸根，攻擊肽鍵，形成丁二酰亞胺中間體，進(jìn)一步水解成天冬氨酸或者異天冬氨酸。天冬氨酸的氨基側(cè)鏈被羧基取代，故被稱為脫酰胺基作用。第三十一頁，共55頁。三、蛋白多肽類藥物的穩(wěn)定性（一）化學(xué)不穩(wěn)定性2、氧化反應(yīng)蛋白質(zhì)多肽氨基酸鏈中甲硫氨酸，半胱氨酸、組氨酸、色氨酸、和酪氨酸的側(cè)鏈都是可能發(fā)生氧化反應(yīng)的位點(diǎn)。引發(fā)氧化反應(yīng)的因素除了空氣中的氧，還包括離子、自由基、光照等。第三十二頁，共55頁。三、蛋白多肽類藥物的穩(wěn)定性（一）化學(xué)不穩(wěn)定性3、二硫鍵斷裂或交換巰基、二硫鍵和它們之間的相互作用對大部分蛋白的性質(zhì)都具有重要影響。4、其他水解、外消旋、異構(gòu)化等，常見，但選擇適當(dāng)?shù)臈l件來阻滯或避免。第三十三頁，共55頁。三、蛋白多肽類藥物的穩(wěn)定性（二）物理不穩(wěn)定性1、變性／去折疊：蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水殘基相互作用決定2、聚集：部分變性的蛋白質(zhì)分子間結(jié)合形成的3、表面／界面吸附：活性蛋白質(zhì)或部分去折疊的蛋白質(zhì)在表面上的吸附，在界面上重新定位和排布4、沉淀：肉眼可見的蛋白質(zhì)從溶液鎮(zhèn)南關(guān)析出的過程，這種行為不可逆的。“顆粒形成”第三十四頁，共55頁。（二）物理不穩(wěn)定性

1、變性／去折疊蛋白質(zhì)的物理穩(wěn)定通常是有蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水殘基間相互作用決定的，當(dāng)這些疏水殘基暴露在溶劑中時(shí)，它們會(huì)與疏水性界面相互作用，或者引起這些失活的蛋白質(zhì)在局部富集，從而導(dǎo)致蛋白聚集及沉淀。

第三十五頁，共55頁。（二）物理不穩(wěn)定性2、聚集蛋白質(zhì)聚集是由部分變性的蛋白質(zhì)分子間結(jié)合形成的。變性劑：十二烷基硫酸鈉、鹽酸胍和尿素可以用來確定蛋白質(zhì)聚集是否為共價(jià)聚集非共價(jià)聚集：蛋白質(zhì)聚集物可以在變性劑中溶解，反之則為共價(jià)（化學(xué)）聚集第三十六頁，共55頁。（二）物理不穩(wěn)定性

3、表面／界面吸附表面／界面誘發(fā)的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定性過程始于蛋白質(zhì)或部分去折疊的蛋白質(zhì)在表面上的吸附，隨后吸附的蛋白質(zhì)分子在界面（氣/液界面或固/液界面）上重新定位和排布。第三十七頁，共55頁。（二）物理不穩(wěn)定性4、沉淀蛋白質(zhì)聚集主要可溶性聚集物，而沉淀指的是肉眼可見的蛋白質(zhì)從溶液中析出的過程。不可逆的這種情況叫做“顆粒形成”。胰島素結(jié)霜就是一個(gè)發(fā)生蛋白質(zhì)沉淀的典型例子，指的是胰島素在容器壁上形成了細(xì)小的沉淀顆粒。第三十八頁，共55頁。三、蛋白多肽類藥物的穩(wěn)定性（三）影響蛋白多肽類藥物分子穩(wěn)定性的因素（P357)溫度、pH、表面界面作用、鹽類、金屬離子、螯合劑、搖晃剪切力、非水溶劑、蛋白質(zhì)濃度、蛋白質(zhì)純度第三十九頁，共55頁。三、蛋白多肽類藥物的穩(wěn)定性（四）蛋白多肽類藥物穩(wěn)定性的分析方法

監(jiān)測蛋白質(zhì)和多肽藥物的不穩(wěn)定性是開發(fā)蛋白質(zhì)多肽類藥物制劑過程中的主要工作之一。第四十頁，共55頁。列舉一些用于穩(wěn)定蛋白多肽類藥物分子的藥用輔料，并簡述這些輔料的穩(wěn)定化機(jī)制？第四十一頁，共55頁。四、蛋白多肽類藥物制劑及其穩(wěn)定化方法（一）蛋白多肽類藥物制劑的穩(wěn)定化方法1、替換容易發(fā)生降解的氨基酸；2、加入穩(wěn)定劑改變蛋白質(zhì)的外在環(huán)境；3、通過干燥手段固化蛋白質(zhì)，減少其降解概率第四十二頁，共55頁。四、蛋白多肽類藥物制劑及其穩(wěn)定化方法常用的穩(wěn)定劑緩沖液：磷酸鹽緩沖液、枸櫞酸鹽緩沖液糖類及多元醇：蔗糖、海藻糖、葡萄糖表面活性劑：聚山梨醇酯類、普朗尼克鹽類：NaCl、Kcl聚合物：血清白蛋白、聚乙二醇，羥丙基-?-CD

金屬離子：Ca2+、Mg2+、Zn2+氨基酸:組氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸抗氧劑：維生素C、硫磺鹽、枸櫞酸第四十三頁，共55頁。四、蛋白多肽類藥物制劑及其穩(wěn)定化方法蛋白質(zhì)的干燥冷凍干燥過程中可能使蛋白質(zhì)變性的因素及其變性機(jī)制1、低溫2、濃度效應(yīng)3、冰-水界面的形成4、冷凍過程中的pH變化5、冷凍過程中的聚合物相分離6、脫水化作用第四十四頁，共55頁。低溫保護(hù)劑：海藻糖、蔗糖、麥芽糖等糖和多元醇；羥丙基甲基纖維素、白蛋白等聚合物凍干保護(hù)劑：海藻糖、蔗糖、麥芽糖等糖和多元醇類；白蛋白、右旋糖酐等聚集物第四十五頁，共55頁。四、蛋白多肽類藥物制劑及其穩(wěn)定化方法（二）蛋白質(zhì)和多肽類藥物制劑開發(fā)過程簡介1、建立分析方法表征蛋白質(zhì)和多肽藥物分子的物理化學(xué)性質(zhì)2、確定目標(biāo)生物藥物的產(chǎn)品特征3、制劑穩(wěn)定性試驗(yàn)第四十六頁，共55頁。五、蛋白質(zhì)和多肽類藥物的遞送注射劑通過延長蛋白質(zhì)和多肽類藥物的血漿半衰期或溶出度，從而降低注射頻率制劑手段：化學(xué)修飾：PEG化、糖基化、乙?；?、氨基酸替換、蛋白融合貯庫給藥系統(tǒng)：微粒遞藥系統(tǒng)、原位貯庫遞藥系統(tǒng)、植入遞藥系統(tǒng)蛋白質(zhì)結(jié)晶或沉淀第四十七頁，共55頁。五、蛋白質(zhì)和多肽類藥物的遞送非注射型運(yùn)用非注射的其他給藥途徑制劑手段口服遞藥肺部遞藥透皮遞藥鼻腔遞藥口腔遞藥第四十八頁，共55頁。第三節(jié)寡核苷酸及基因類藥物制劑一、寡核苷酸及基因類藥物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)化學(xué)組成均為聚核苷酸結(jié)構(gòu)，其中DNA分子為脫氧核苷酸的聚合物，RNA分子為核苷酸的聚合物。分子量大，帶有大量的負(fù)電荷，水溶性好，幾乎沒有脂溶性。作用靶點(diǎn)都是在細(xì)胞內(nèi)，藥物遞送必須跨越細(xì)胞膜和核膜的壁壘。---------------------必須借助基因遞送載體？第四十九頁，共55頁。二、寡核苷酸及基因類藥物的遞送載體設(shè)計(jì)目前基因治療領(lǐng)域主要有三類不同的藥物遞送技術(shù)體系：1、物理轉(zhuǎn)染技術(shù)2、病毒載體系統(tǒng)3、非病毒載體系統(tǒng)第五十頁，共55頁。（一）非病毒載體的構(gòu)建和表征由于DNA、RNA分子等帶有大量的負(fù)電荷，所以能夠與帶正電的載體材料相互復(fù)合，形成電荷相互作用復(fù)合物脂質(zhì)復(fù)合物：陽離子脂質(zhì)體與DNA形成的復(fù)