基因工程文庫的構(gòu)建

（優(yōu)選）基因工程文庫的構(gòu)建目前一頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)目前二頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)目前三頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)構(gòu)建基因文庫的基本程序：提取研究對(duì)象基因組DNA，制備合適大小的DNA片段，或提取組織或器官的mRNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA；DNA片段或cDNA與經(jīng)特殊處理的載體連接形成重組DNA；重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞或體外包裝后侵染受體菌；陽性重組菌落或噬菌斑的選擇。目前四頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)第一節(jié)基因組DNA文庫的構(gòu)建一、基因組DNA文庫的類型和發(fā)展質(zhì)粒文庫噬菌體文庫黏粒文庫人工染色體文庫亞基因組文庫目前五頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)鳥槍法（霰彈法）：利用機(jī)械剪切力和超聲波等物理方法或限制性核酸內(nèi)切酶酶切等生化方法將生物chr.打斷，隨后通過T4DNA連接酶把這些片段與適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒載體進(jìn)行重組，轉(zhuǎn)化受體菌后進(jìn)行無性繁殖，獲得一大群含不同外源DNA片段的克隆，再用簡便的篩選方法從眾多的轉(zhuǎn)化菌株中篩選出含有某一目的基因的菌株，從中獲得所要的基因。目前六頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)代表性：指文庫中所有克隆所攜帶的DNA片段重新組合起來可以覆蓋整個(gè)基因組，即可以從該文庫中分離任何一段DNA。代表性是衡量文庫質(zhì)量的一個(gè)很重要的指標(biāo)。文庫構(gòu)建策略：①采用部分酶切或隨機(jī)切割的方法來消化染色體DNA，以保證克隆的隨機(jī)性，保證每段DNA在文庫中出現(xiàn)的頻率均等；②提高文庫所含基因組DNA的總?cè)萘?，通常用覆蓋基因組的倍數(shù)來衡量。二、文庫的代表性和隨機(jī)性目前七頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)三、基因組DNA文庫構(gòu)建流程載體的制備；高純度大分子量基因組DNA的提??；HMWDNA的部分酶切與脈沖電泳分級(jí)分離（PFGEsizeselection）；載體與外源片段的連接與轉(zhuǎn)化或侵染宿主細(xì)胞；重組克隆的挑取和保存。目前八頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)目前九頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)1．基因組DNA文庫的載體制備

載體的制備要求：①純度高；②去磷酸化好。2．高質(zhì)量大分子量基因組DNA的提取和部分酶切

提取的基因組DNA要求保存完整。分子量越大，所得到的重組克隆的插入片段越大。3．文庫的連接轉(zhuǎn)化或包裝侵染

在電轉(zhuǎn)化和包裝侵染過程中，首先選擇轉(zhuǎn)化效率高的感受態(tài)細(xì)胞或效價(jià)高且質(zhì)量穩(wěn)定的包裝蛋白；同時(shí)，研究表明對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行脫鹽處理也可以明顯地提高其效率。另外，對(duì)于電轉(zhuǎn)化而言，選擇合適的轉(zhuǎn)化電壓對(duì)不同插入片段的DNA的轉(zhuǎn)化效率也有所不同。目前十頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)4．文庫的質(zhì)量檢測

文庫的平均插入片段長度是通過PFGE電泳檢測一定數(shù)目的重組子的插入片段大小所得平均值。美國的研究機(jī)構(gòu)對(duì)BAC文庫，一般要求植物的在130kb左右，而動(dòng)物的在150kb左右。插入效率：有插入片段的克隆在所有檢測的克隆中所占的比例。基因組覆蓋倍數(shù)＝平均插入片段長度×克隆數(shù)/基因組DNA的長度（一般是約數(shù)）；

基因組覆蓋度是指文庫中的克隆覆蓋基因組的范圍，檢測時(shí)是通過選擇一定數(shù)目的已知的單拷貝的基因作探針來篩選文庫。由于所使用的每個(gè)探針篩選的克隆數(shù)目即表明文庫中對(duì)該基因位點(diǎn)的覆蓋倍數(shù)，因此，基因組覆蓋倍數(shù)又等于所有探針篩到的陽性克隆的總個(gè)數(shù)/使用的總探針數(shù)的比值

目前十一頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)第二節(jié)cDNA文庫的構(gòu)建

cDNA文庫中的外源DNA片段是互補(bǔ)DNA（complementaryDNA,cDNA）。cDNA是由生物的某一特定器官或特定發(fā)育時(shí)期細(xì)胞內(nèi)的mRNA經(jīng)體外反轉(zhuǎn)錄后形成的雙鏈cDNA。cDNA文庫代表生物的某一特定器官或特定發(fā)育時(shí)期細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平上的基因的群體，并不能包括該生物的全部基因，且這些基因在表達(dá)豐度上存在很大差異。cDNA文庫構(gòu)建步驟：細(xì)胞總RNA的提取和mRNA分離；第一鏈cDNA合成；第二鏈cDNA合成；雙鏈cDNA克隆進(jìn)質(zhì)粒或噬菌體載體并導(dǎo)入宿主中繁殖。目前十二頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)目前十三頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)

mRNA在總RNA中所占比例很小，因此從總RNA中富集mRNA是構(gòu)建cDNA文庫和其它應(yīng)用所必需進(jìn)行的步驟。

目前mRNA的純化方法：在固體支持物表面共價(jià)結(jié)合固定一段由脫氧胸腺嘧啶核苷組成的寡聚核苷酸[oligo（dT）]鏈，由它與mRNA的Poly（A）尾巴雜交，從而吸附固定住mRNA，進(jìn)而將mRNA從其它組分中分離出來。

1．mRNA的完整性指導(dǎo)合成高分子量蛋白質(zhì)的能力；指導(dǎo)合成目的多肽的能力（利用免疫共沉淀和SDS）；mRNA的大?。?00bp-8kb，多數(shù)1.5-2kb）；總mRNA制劑指導(dǎo)合成cDNA第一鏈長分子的能力。一、mRNA的分離目前十四頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)3．mRNA的富集

3.1按大小對(duì)mRNA進(jìn)行分級(jí)分離

3.2cDNA的分級(jí)分離

近年來多采用此方法，特別是大mRNA，可避免降解mRNA,agarose分離大小易辨。

3.3多聚核糖體的免疫學(xué)純化法

用抗體來純化合成的目的多肽的多聚核糖體。

免疫親和柱/A蛋白-Sepharose柱，單克隆抗體把正在合成新生鏈的多聚核糖體結(jié)合到A蛋白-spharose柱上，隨后用EDTA解離下來，通過oligo（dT）層析分離mRNA。此法分離的mRNA只占總mRNA的0.01-0.05%。2．mRNA的豐度

高豐度mRNA：在特定細(xì)胞中占50-90%，如：免疫球蛋白。

低豐度mRNA：含量＜0.5%被稱為低豐度或稀有mRNA。目前十五頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)二、cDNA第一鏈的合成常用的反轉(zhuǎn)錄酶：AMV（來自禽成髓細(xì)胞瘤病毒）MMLV（來自Moloey鼠白血病病毒）依賴于RNA的DNA聚合酶，有5'--3'DNA聚合酶活性。合成DNA常用的引物：Oligo（dT）和隨機(jī)引物。Oligo（dT）引物一般包含10～20個(gè)脫氧胸腺嘧啶核苷和一段帶有稀有酶切位點(diǎn)的引物共同組成，隨機(jī)引物一般是包含6～10個(gè)堿基的寡核苷酸短片段。目前十六頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)

Oligo（dT）引導(dǎo)的cDNA合成是在cDNA的合成過程中加入高濃度的Oligo（dT）引物，Oligo（dT）引物與mRNA的3‘末端的poly（A）配對(duì)，引導(dǎo)反轉(zhuǎn)錄酶以mRNA為模板合成第一鏈cDNA。這種cDNA合成的方法在cDNA文庫構(gòu)建中應(yīng)用極為普遍，其缺點(diǎn)主要是由于cDNA末端存在較長的poly（A）而影響cDNA測序。

隨機(jī)引物引導(dǎo)的cDNA合成是采用6－10個(gè)隨機(jī)堿基的寡核苷酸短片段來錨定mRNA并作為反轉(zhuǎn)錄的起點(diǎn)。由于隨機(jī)引物可能在一條mRNA鏈上有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)而從多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)發(fā)生反轉(zhuǎn)錄，比較容易合成特長的mRNA分子的5'-端序列。隨機(jī)引物cDNA合成的方法不適合構(gòu)建cDNA文庫，一般用于克隆特定mRNA的5'末端，如RT-PCR和5'-RACE。目前十七頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)1．自身引導(dǎo)法：

首先用氫氧化鈉消化雜合雙鏈中的mRNA鏈，解離的第一鏈cDNA的3‘-末端就會(huì)形成一個(gè)發(fā)夾環(huán)（發(fā)夾環(huán)的產(chǎn)生是第一鏈cDNA合成時(shí)的特性，原因至今未知，據(jù)推測可能是與帽子的特殊結(jié)構(gòu)相關(guān)），并引導(dǎo)DNA聚合酶復(fù)制出第二鏈，此時(shí)形成的雙鏈之間是連接在一起的，再利用S1核酸酶將連接處（僅該位點(diǎn)處為單鏈結(jié)構(gòu)）切斷形成平端結(jié)構(gòu)可以進(jìn)行連接。三、cDNA第二鏈的合成目前十八頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)目前十九頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)2．置換合成法：RNaseH：將mRNA－cDNA雜合雙鏈中的mRNA鏈切割成很多的小片段；大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ：以形成的小片段為引物，以第一鏈cDNA為模板合成一段段互補(bǔ)的cDNA片段。DNA連接酶：合成的這些小cDNA片段被連接成一條鏈。目前二十頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)目前二十一頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)3．引導(dǎo)合成法：

本方法是Okayama和Berg1982提出的。首先是制備一端帶有Poly（dG）的片段Ⅱ和帶有Poly（dT）的載體片段Ⅰ，并用片段Ⅰ來代替Oligo（dT）進(jìn)行cDNA第一鏈的合成，在第一鏈cDNA合成后直接采用末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）在第一鏈cDNA的3'-端加上一段Poly（dC）的尾巴，同時(shí)進(jìn)行酶切創(chuàng)造出另一端的粘端，與片段Ⅱ一起形成環(huán)化體，這種環(huán)化了的雜合雙鏈在RNaseH、大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ和DNA連接酶的作用下合成與載體聯(lián)系在一起的雙鏈cDNA。其主要特點(diǎn)是合成全長cDNA的比例較高，但操作比較復(fù)雜，形成的cDNA克隆中都帶有一段Poly（dC）/（dA），對(duì)重組子的復(fù)制和測序都不利。目前二十二頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)目前二十三頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)目前二十四頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)4．引物－銜接頭合成法第一鏈合成后直接采用末端轉(zhuǎn)移酶在第一鏈cDNA的3'-端加上一段Poly（dC）的尾巴，然后用一段帶接頭序列的Poly（dG）短核苷酸鏈作引物合成互補(bǔ)的cDNA鏈，接頭序列可以是適用于PCR擴(kuò)增的特異序列或用于方便克隆的酶切位點(diǎn)的序列。這一方法目前已經(jīng)發(fā)展成PCR法構(gòu)建cDNA文庫的常用方法。目前二十五頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)目前二十六頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)目前二十七頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)目前二十八頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)目前二十九頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)目前三十頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)

cDNA克隆時(shí)常出現(xiàn)丟失末端序列的現(xiàn)象，需較長時(shí)間獲得全長cDNA克隆。cDNA克隆中,得到了不完整的片段,可采用此方法獲得3‘末端和5’末端的序列。工作原理見后圖。篩選文庫時(shí)一般只能回收一個(gè)或幾個(gè)cDNA克隆，而RACE可產(chǎn)生大量獨(dú)立克隆。引物GSP1根據(jù)已經(jīng)得到的不完整的cDNA的序列設(shè)計(jì)。（3）RACE（randomamplificationofcDNAends）

目前三十一頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)目前三十二頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)目前三十三頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)第三節(jié)基因克隆的篩選策略一般來說，這一篩選過程的難易程度，主要取決于所采用基因的克隆方案和目的基因的性質(zhì)與來源。從文庫中篩選目的基因的方法主要有：核酸雜交法、特異性抗原的免疫學(xué)檢測法、PCR篩選法?；蚩寺〉谋举|(zhì)：從文庫中篩選目標(biāo)克隆，重點(diǎn)在篩選。常見篩選工具：探針（probe）狹義：核酸，抗體廣義：還包括其他篩選手段。目前三十四頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)

生物體的表型特征由控制其性狀的基因編碼。因此，可以通過觀察表型的變化來篩選目的基因。表型篩選法就是根據(jù)目的基因編碼比較特殊的功能，并且載體的幫助下可以在宿主菌（如大腸桿菌）中表達(dá)該基因，表現(xiàn)出其特殊的功能所決定的表型性狀來，這樣就很容易通過導(dǎo)入的基因帶來新的功能或恢復(fù)其缺失的功能來確定目的基因。一、表型篩選法抗性基因：抗生素抗性基因、抗重金屬抗性基因分解基因：苯環(huán)化合物、分解酶功能活性：殺蟲、酶啟動(dòng)子/復(fù)制子：功能缺失：在獲得相應(yīng)突變體的前提下，以此突變體作為宿主，將野生型的DNA導(dǎo)入后檢測回復(fù)突變（如：營養(yǎng)缺陷型相關(guān)的基因）。目前三十五頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)目前三十六頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)

當(dāng)目標(biāo)基因是未知功能的基因或一些不能在原核生物中表達(dá)的真核生物的基因，可以利用的可能只是該基因的部分序列、同源基因片段或不完整的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，此時(shí)就必須考慮其它的方法來篩選。雜交篩選法是應(yīng)用最為廣泛的篩選目標(biāo)基因克隆的一種方法。二、雜交篩選同源DNA探針：高度保守的基因rRNA基因鄰近種屬的相應(yīng)基因相應(yīng)基因的序列比較合成寡核苷酸：蛋白質(zhì)N-末端aa序列簡并探針根據(jù)密碼子的使用頻率，合成猜測體探針設(shè)計(jì)兩組簡并探針，用第二個(gè)探針對(duì)第一次篩選的陽性克隆子作第二次雜交目前三十七頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組mRNA&對(duì)照組mRNA

↓分別制備探針（mRNA或cDNA)

↓

分別篩選含目的基因的cDNA文庫

↓

陽性菌落x光底片顯色

↓

比較x光底片和對(duì)照平板，挑出含目的基因的菌落

↓鑒定目的基因(一)差別雜交(differentialhybridization

)優(yōu)點(diǎn)--簡便、直觀缺點(diǎn)--敏感性不高，難以獲得低豐度差異表達(dá)基因--膜雜交篩選工作量大，信號(hào)強(qiáng)度可比性不佳目前三十八頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組mRNA&對(duì)照組mRNA

↓反轉(zhuǎn)錄為單鏈cDNA（量少）生物素標(biāo)記mRNA（量多）

↓雜交(約1:20)生物素標(biāo)記mRNA：cDNA雜合子

↓

與鏈球菌抗生物素蛋白進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)生物素標(biāo)記mRNA：cDNA雜合子交聯(lián)于鏈球菌抗生物素蛋白上

↓

去雙鏈結(jié)構(gòu)

↓單鏈cDNA

↓制備差減探針&

構(gòu)建差減cDNA文庫

↓差減cDNA文庫篩選

↓鑒定目的基因(二)mRNA減法雜交（subtractivehybridization)目前三十九頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)原理：SSH是差減雜交與PCR結(jié)合的簡單、快速分離差異基因的方法。其運(yùn)用雜交動(dòng)力學(xué)原理，即豐度高的單鏈DNA在退火時(shí)產(chǎn)生同源雜交的速度快于豐度低的單鏈DNA，從而使不同豐度的單鏈DNA得到均衡；抑制PCR則利用鏈內(nèi)退火優(yōu)于鏈間退火的優(yōu)點(diǎn)，使非目的基因片段兩端反向重復(fù)序列在退火時(shí)產(chǎn)生類似發(fā)卡的互補(bǔ)結(jié)構(gòu),無法作為模板與引物配對(duì)，選擇性地抑制了非目的基因片段的擴(kuò)增，從而使目的基因得到富集、分離。（三）抑制性差減雜交(suppressivesubtractivehybridization,SSH)目前四十頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)方法：提取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組mRNA合成雙鏈cDNA，經(jīng)識(shí)別4堿基的限制性內(nèi)切酶切割；實(shí)驗(yàn)組cDNA平均分為2份，分別連接2個(gè)接頭；進(jìn)行2輪差減雜交和抑制PCR；獲得富集的目的基因。目前四十一頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)檢測組(Tester)—含目的基因cDNA，加接頭驅(qū)逐組(Driver)—不含目的基因cDNA，不加接頭*接頭含PCR引物正向SSH:易感者(Tester)+不易感者(Driver)易感者特異表達(dá)或高表達(dá)基因反向SSH:不易感者(Tester)+易感者(Driver)不易感者特異表達(dá)或高表達(dá)基因優(yōu)點(diǎn)：采用兩次差減雜交和兩次PCR，保證了高特異性(假陽性率可降至6％);在雜交過程中可使不同豐度基因均衡化，從而獲得低豐度差異表達(dá)基因;操作相對(duì)簡便，是目前分離新基因的主要方法。缺點(diǎn)：起始材料需要g級(jí)量mRNA;SSH差減克隆片段較小，獲取cDNA全長序列有一定難度。目前四十二頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)三、免疫篩選

免疫篩選法和核酸雜交的方法類似，只是其使用的探針不是核酸，而是特異性的抗體。適合免疫雜交法篩選的外源基因首先要在宿主細(xì)胞中存在抗原蛋白的表達(dá)，用于篩選的DNA文庫必須是表達(dá)文庫，通常是原核生物的基因組DNA文庫和真核生物的cDNA表達(dá)文庫。而且，所檢測的對(duì)象為宿主中不編碼的基因或宿主中缺失表達(dá)的基因。

四、高表達(dá)基因高豐度mRNA，如用苯肼做了貧血處理的兔網(wǎng)織紅細(xì)胞中，血紅蛋白mRNA的含量占絕大多數(shù)目前四十三頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)mRNA3’末端有12種可能的序列；以此12種引物引導(dǎo)cDNA第一鏈合成；以10nt隨機(jī)引物引導(dǎo)cDNA第二鏈合成，可產(chǎn)生50-100條100-500bp的條帶；12種錨定引物和20種隨機(jī)引物組成240組引物，產(chǎn)生約20000種DNA條帶。五、mRNA差別顯示目前四十四頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)目前四十五頁\總數(shù)四十九頁\編于十六點(diǎn)酵母雙雜交系統(tǒng)由Fields和Song等首先在