培訓(xùn)課件食品中大腸菌群的測定GB

第一法大腸菌群MPN法目前一頁\總數(shù)四十七頁\編于八點

一、

目的1、

了解大腸菌群的定義及食品中大腸菌群測定在食品衛(wèi)生檢驗中的意義。

2、練習(xí)并掌握大腸菌群的檢驗方法

。目前二頁\總數(shù)四十七頁\編于八點二、原理1、大腸菌群大腸菌群系指一群在一定條件下（37℃、24小時）能夠發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣，需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。目前三頁\總數(shù)四十七頁\編于八點這些細(xì)菌在生化及血清學(xué)方面并非完全一致。根據(jù)進一步的生化鑒定試驗，可將大腸菌群細(xì)分為大腸埃希氏菌（俗稱大腸桿菌）、弗氏檸檬酸桿菌、肺炎克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌等。另一種說法：（主要由腸桿菌科中埃希氏菌屬、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬的一部分及沙門氏屬的Ⅲ亞屬細(xì)菌組成。）目前四頁\總數(shù)四十七頁\編于八點2、測定的意義該菌主要來源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標(biāo)來評價食品的衛(wèi)生質(zhì)量，推斷食品中是否有腸道致病菌污染的可能性，具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義。食品中大腸菌群數(shù)系以每1g（或mL）檢樣內(nèi)大腸菌群最可能數(shù)MPN（the

most

probable

number-簡稱MPN）表示目前五頁\總數(shù)四十七頁\編于八點3大腸桿菌的生物學(xué)特性基本形態(tài)：此菌為兩端鈍圓的短小桿菌，一般約0.5-0.8μm*1.0-3.0μm，多單獨存在或成雙，但不呈長鏈排列。約50%的菌株有周生鞭毛，但多數(shù)只有1-4根，一般不超過10根，故菌體動力弱。多數(shù)菌株有菌毛，有的有莢膜或微莢膜，不形成芽孢，對普通堿性染料著色良好，革蘭氏染色陰性。目前六頁\總數(shù)四十七頁\編于八點在普通營養(yǎng)瓊脂上有3中菌落形態(tài)：

1）光滑型：菌落邊緣整齊，表面有光澤、濕潤、光滑、呈灰色，在生理鹽水中易分散；

2）粗糙型：菌落扁平、干澀、邊緣不整齊，易在生理鹽水中自凝；

3）黏液型：常為含有莢膜的菌株。培養(yǎng)特性：大腸桿菌合成代謝能力強，在含無機鹽、銨鹽、葡萄糖的普通培養(yǎng)基上生長良好。最適生長溫度為37℃，在42-44℃條件下仍能生長，生長溫度范圍15-46℃。目前七頁\總數(shù)四十七頁\編于八點三

、

材料1、食品樣品乳、肉、禽蛋制品、飲料、糕點、發(fā)酵調(diào)味品或其他食品。2、陽性對照菌大腸桿菌

目前八頁\總數(shù)四十七頁\編于八點3、

儀器設(shè)備除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、

均質(zhì)器、振蕩器、無菌吸管或微量移液器及吸頭、無菌錐形瓶、無菌培養(yǎng)皿、菌落計數(shù)器等。目前九頁\總數(shù)四十七頁\編于八點

4、培養(yǎng)基和試劑月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯、煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA)、無菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液、1mol/L氫氧化鈉（NaOH)、1mol/L鹽酸（HCL)。目前十頁\總數(shù)四十七頁\編于八點

四、檢驗方法第一法大腸菌群MPN計數(shù)法。第二法大腸菌群平板計數(shù)法。目前十一頁\總數(shù)四十七頁\編于八點試驗流程目前十二頁\總數(shù)四十七頁\編于八點第一法大腸菌群MPN計數(shù)法

1、樣品的稀釋（1）

固體和半固體樣品稱取25g

樣品，放入盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000r/min-10000r/min均質(zhì)1min-2min，或放入盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min-2min，制成1:10

的樣品勻液。目前十三頁\總數(shù)四十七頁\編于八點（2）液體樣品以無菌吸管吸取25mL樣品，置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠）中，充分棍勻，制成1:10

的樣品勻液。（3）樣品勻液的pH值應(yīng)在

之間，必要時分別用1mol/L氫氧化鈉（NaOH）或1mol/L鹽酸（HCI）調(diào)節(jié)。目前十四頁\總數(shù)四十七頁\編于八點目前十五頁\總數(shù)四十七頁\編于八點（4）用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10

樣品勻液1mL，沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支1mL無菌吸管反復(fù)吹打，使其混合均勻，制成1:100

的樣品勻液。目前十六頁\總數(shù)四十七頁\編于八點

（5）、根據(jù)對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成10倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15min

。目前十七頁\總數(shù)四十七頁\編于八點

2、初發(fā)酵試驗每個樣品，選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯）,36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h±2h。目前十八頁\總數(shù)四十七頁\編于八點記錄在24h和48h內(nèi)產(chǎn)氣的LST肉湯管數(shù)。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性，產(chǎn)氣者則進行復(fù)發(fā)酵試驗。

目前十九頁\總數(shù)四十七頁\編于八點3、復(fù)發(fā)酵試驗用接種環(huán)從所有48h±2h內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物l環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽(BGLB）肉湯管中，36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h

，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計為大腸菌群陽性管。

目前二十頁\總數(shù)四十七頁\編于八點煌綠乳糖膽鹽(BGLB）肉湯管目前二十一頁\總數(shù)四十七頁\編于八點4、大腸菌群最可能數(shù)（MPN）的報告

根據(jù)大腸菌群陽性管數(shù)，檢索MPN表（見下頁表)，報告每克（或毫升）樣品中大腸菌群的MPN值。注意：當(dāng)檢樣的量與表中的量有增加或減少時，表內(nèi)的數(shù)也應(yīng)相應(yīng)減少或增加。

目前二十二頁\總數(shù)四十七頁\編于八點結(jié)果報告：MPN表目前二十三頁\總數(shù)四十七頁\編于八點第二法大腸菌群計數(shù)法目前二十四頁\總數(shù)四十七頁\編于八點大腸桿菌0157顯色培養(yǎng)基上的菌落目前二十五頁\總數(shù)四十七頁\編于八點在伊紅美蘭乳糖瓊脂（EMB）上目前二十六頁\總數(shù)四十七頁\編于八點大腸菌群在去氧膽酸鈉瓊脂上的典型特征典型菌落為紅色,菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)。菌落直徑為2-3mm或更大。

目前二十七頁\總數(shù)四十七頁\編于八點大腸菌群在結(jié)晶紫中性紅瓊脂(VRBA)上典型特征

典型菌落為紫紅色,菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)。菌落直徑為0.5mm或更大。目前二十八頁\總數(shù)四十七頁\編于八點大腸桿菌在MFC瓊脂上的典型特征目前二十九頁\總數(shù)四十七頁\編于八點目前三十頁\總數(shù)四十七頁\編于八點試驗流程目前三十一頁\總數(shù)四十七頁\編于八點1、樣品的稀釋按第一法中的稀釋方法進行。目前三十二頁\總數(shù)四十七頁\編于八點2、平板計數(shù)（1）選取2個～3個適宜的連續(xù)稀釋度，每個稀釋度接種兩個無菌平皿，每皿1mL。同時分別取1mL生理鹽水加入兩個無菌平皿作空白對照。（2）及時將15mL-20mL冷至46℃的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）約傾注于每個平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3mL-4mLVRBA

覆蓋平板表層。翻轉(zhuǎn)平板，置于36℃±l℃培養(yǎng)18h-24h。目前三十三頁\總數(shù)四十七頁\編于八點

（3）平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在15-150

之間的平板，分別計數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5mm或更大。

目前三十四頁\總數(shù)四十七頁\編于八點結(jié)晶紫中性膽鹽瓊脂目前三十五頁\總數(shù)四十七頁\編于八點

（4）、證實試驗

從VRBA平板上挑取10個不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB

肉湯管內(nèi)，36℃±1℃培養(yǎng)24h-48h

，觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣，即可報告為大腸菌群陽性。

目前三十六頁\總數(shù)四十七頁\編于八點2、平板計數(shù)

（5）大腸菌群平板計數(shù)的報告

經(jīng)最后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以（3）中計數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每克（或毫升）樣品中大腸菌群數(shù)。目前三十七頁\總數(shù)四十七頁\編于八點例：10-4樣品稀釋液1mL，在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落，挑取其中10個接種BGLB肉湯管，證實有6個陽性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：100×6/10×104/g（mL）=6.0×105CFU/g（mL）。目前三十八頁\總數(shù)四十七頁\編于八點可疑菌落特點：具有金屬光澤的深紫黑色菌落；不帶或略帶金屬光澤的菌落；中心色較深的淡紫黑色菌落。目前三十九頁\總數(shù)四十七頁\編于八點三、注意事項1、第一步乳糖膽鹽發(fā)酵試驗是樣品的發(fā)酵結(jié)果，不是純菌的發(fā)酵試驗，初發(fā)酵陽性管，經(jīng)過后兩步，有可能成為陰性。只做一步，會有相當(dāng)多的合格樣品作為不合格處理，應(yīng)注意。目前四十頁\總數(shù)四十七頁\編于八點

2、膽鹽可抑制革蘭氏陽性菌的生長，有利于大腸桿菌的生長繁殖。目前四十一頁\總數(shù)四十七頁\編于八點

3、接種量在1ml以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管，1ml及1ml以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。目前四十二頁\總數(shù)四十七頁\編于八點

4、大腸菌群菌落在EMB瓊脂上大多呈紫黑色有金屬光澤或無金屬光澤。應(yīng)取典型菌落，如無應(yīng)多取幾個菌落，以免出現(xiàn)假陽性。一般平板上有較多的大腸桿菌典型菌落，且革蘭氏染色為陰性，可做出判定。目前四十三頁\總數(shù)四十七頁\編于八點

5、對初發(fā)酵時未產(chǎn)氣的發(fā)酵管有疑問時，可用手輕輕敲動或搖動試管，如有氣泡沿管壁上升，應(yīng)考慮有氣體產(chǎn)生，