病理檢驗(yàn)技術(shù)

病理檢驗(yàn)技術(shù)

江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院

病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室

2004年4月

內(nèi)容提要

本書介紹組織病理學(xué)常用的多種技術(shù)。包括常見的技術(shù)，即福爾馬林固定、石蠟包

埋、HE染色技術(shù)，同時也介紹了常用的特殊染色技術(shù)，免疫組織化學(xué)技術(shù)，并簡

明地介紹了分子生物學(xué)技術(shù)的基本理論以及在組織病理學(xué)中的應(yīng)用。

全書理論與實(shí)踐并重，經(jīng)典與改良結(jié)合，內(nèi)容豐富，通俗易懂，實(shí)用性強(qiáng)，為實(shí)驗(yàn)

室工作的必備參考書。適合從事病理學(xué)、組織學(xué)、生物學(xué)、法醫(yī)學(xué)等的科研教學(xué)和

臨床工作的技術(shù)人員、教師、醫(yī)師和研究生使用。同時也適合臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)專業(yè)中

專、專科生使用以及臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)專升本學(xué)生和臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)本科生選用

第一篇石蠟切片技術(shù)

第一章組織標(biāo)本的處理

第一節(jié)取材....................................................5

第二節(jié)組織的固定.............................................6

第三節(jié)大體標(biāo)本的處理和固定.................................

第四節(jié)陳列標(biāo)本的固定.......................................15

第五節(jié)脫鈣...................................................16

第六節(jié)組織的沖洗............................................18

第二章石蠟包埋技術(shù)

第一節(jié)脫水....................................................19

第二節(jié)透明....................................................21

第三節(jié)浸蠟....................................................22

第四節(jié)包埋....................................................22

第三章切片技術(shù)

第一節(jié)切片刀..................................................25

第二節(jié)切片機(jī)..................................................27

第三節(jié)石蠟切片的制作.......................................27

第四節(jié)特殊組織石蠟切片的制作..............................29

第五節(jié)石蠟切片的異常及處理.................................29

第四章染色與染色劑

第一節(jié)染色的基本原理........................................31

第二節(jié)染色劑染色的化學(xué)基礎(chǔ)..................................33

第三節(jié)染色劑的分類...........................................34

第四節(jié)常用染色劑及配制......................................35

第五節(jié)蘇木素一伊紅染色法....................................39

第六節(jié)封固劑.................................................41

第五章特殊染色技術(shù)

第一節(jié)結(jié)締組織染色法........................................43

第二節(jié)脂類染色法............................................47

第三節(jié)糖原及粘液染色法......................................48

第四節(jié)色素染色法............................................50

第五節(jié)神經(jīng)組織染色法.........................................52

第六節(jié)核酸及核蛋白染色法....................................52

第七節(jié)肌肉組織染色法.........................................53

第八節(jié)病原微生物染色法......................................54

第九節(jié)特殊染色技術(shù)的應(yīng)用....................................57

第二篇免疫組織化學(xué)和親和免疫組織化學(xué)技術(shù)

第一章免疫組織化學(xué)技術(shù)

第一節(jié)基本原理...............................................62

第二節(jié)染色步驟...............................................67

第三節(jié)常用試劑的配制.........................................72

第二章親和免疫組織化學(xué)技術(shù)

第一節(jié)基本原理...............................................77

第二節(jié)染色步驟...............................................80

第三篇分子生物學(xué)技術(shù)

第一章核酸原位雜交技術(shù)

第一節(jié)核酸原位雜交的基本原理...............................83

第二節(jié)核酸原位雜交的主要過程...............................84

第三節(jié)核酸原位雜交的基本操作步驟..........................86

第四節(jié)常用試劑的配制........................................87

第五節(jié)核酸原位雜交的應(yīng)用....................................89

第二章原位PCR技術(shù)

第一節(jié)基本原理...............................................91

第二節(jié)基本類型...............................................91

第三節(jié)基本步驟...............................................92

第四節(jié)原位PCR技術(shù)的應(yīng)用..................................93

第一篇石蠟切片技術(shù)

切片技術(shù)的應(yīng)用到現(xiàn)在已有一百年多的歷史了。

最早應(yīng)用的只是冰凍切片，隨著冰凍切片的應(yīng)用和實(shí)踐又進(jìn)一步利用石蠟的硬

度，將要檢查的組織塊浸漬并包埋于這種堅(jiān)實(shí)的介質(zhì)之中，制成了石蠟切片。后來

又利用明膠，火棉膠等物質(zhì)的韌性來包埋組織，制成了明膠切片和火棉膠切片。

切片技術(shù)隨著生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的發(fā)展，經(jīng)過不斷地改進(jìn)而逐漸的完善起來，隨著光

學(xué)儀器和切片機(jī)器的口益的精密和不斷向前發(fā)展?，F(xiàn)代切片技術(shù)巳成為生物形態(tài)學(xué)

微觀結(jié)構(gòu)研究的一個重要方面，更是病理檢驗(yàn)技術(shù)中不可缺少的一個組成部分。

將各種組織制成非薄的切片標(biāo)本，需要經(jīng)過一系列比較繁雜的過程，每一步都要

求病理技術(shù)工作者要認(rèn)真，耐心，細(xì)致地使整個過程一環(huán)扣住一環(huán)，才能獲得優(yōu)良

結(jié)果。

制作切片的主要過程有：（1）取材，（2）固定，（3）脫水，（4）包埋，（5）

切片，（6）染色，（7）封固。在這七個主要過程中，又包括著若干步驟，（詳

見切片制作程序表）。

冰凍切片石蠟切片火棉膠切片

I!I

---------------------?取材----------------------

固定

冰凍沖水

脫水

透明乙酸酒精

浸蠟?zāi)z液滲透

石蠟包埋火棉膠包埋

冰凍切片切片切片

染色染色染色

封固封固封固

凡欲制作切片的組織，首先必須固定，以防止組織自溶而產(chǎn)生死后變化。組織經(jīng)過

固定之后，再以流水沖洗。如為冰凍切片，即可直接將組織冰凍進(jìn)行切片。如欲制

石蠟切片或火棉膠切片，為了使石蠟或火棉膠滲透到組織中去，以能包埋組織，在

固定水洗之后，還須經(jīng)過脫水，媒劑（透明），石蠟火棉膠的滲透，才能包埋切片。

在切片以后，為了便于觀察，還要對其進(jìn)行不同的染色，最后將切片封固，制成長

久保存的組織切片標(biāo)本。

第一章組織標(biāo)本的處理

第一節(jié)取材

取材是制作切片程序中的首要步驟，取材不當(dāng)，將直接影響病理診斷和科研工作的

效果。組織標(biāo)本的選用非常重要，不能隨意的切取組織來制作組織切片，否則病理

檢驗(yàn)的結(jié)果是不會令人滿意的。

一、取材工具：取材刀具必須鋒利。切取標(biāo)本不應(yīng)該擠壓和揉擦，不應(yīng)使用有鉤

鐐子或血管鉗等手術(shù)器械鏡取標(biāo)本，以免損害組織造成人為組織變化，給診斷帶來

困難或?qū)е洛e診，漏診。

二、標(biāo)本的選?。簯?yīng)選擇病變或可疑病變的組織。必要時選取病變與正常組織交界

處。切取標(biāo)本的原則是求準(zhǔn)而不是求量多，所以切取組織宜小不宜大，以不超過

24x24mm2為佳，厚度以3—5mm為度，過大過厚會影響對標(biāo)本的固定，另方

面也影響切片的制作。特殊目的者應(yīng)屬例外。

1、了使組織切片的結(jié)構(gòu)清楚，取材要及時，組織塊必須爭取時間及時固定。

組織的固定以愈新鮮愈好。

2、取材時對大體標(biāo)本（肉眼標(biāo)本）繪制圖象，進(jìn)行仔細(xì)描述。包括形狀、大

小，硬度，顏色，病灶（或可疑病變）部位等。對所取的組織應(yīng)定位編號。

3、切取各組織塊時，切勿擠壓損傷，對典型或具有教學(xué)和科研價值的肉眼標(biāo)

本，

不能因取材而對標(biāo)本造成人為的''病變"。腸粘膜組織上沾有少量糞便，也不應(yīng)以手

拭去或以水洗去。

4、下的組織塊應(yīng)盡量防止其彎曲扭轉(zhuǎn)，如胃腸等組織，應(yīng)先平展于草紙上粘

著以后，慢慢地放入固定液中（故應(yīng)在動手剖驗(yàn)之前做好準(zhǔn)備工作）。固定液的量

要充足，應(yīng)為固定組織的10倍。

5、組織采取應(yīng)在正常與病灶交界之處。組織形狀最好為方形或長方形狀，這

樣有利于制片。切不可以形狀定位，組織厚薄要均勻。因?yàn)榻M織塊的厚度決定固定

的速度，要充分滿足它在一定時間內(nèi)全部達(dá)到適宜的固定。如組織厚薄不均，在脫

水時將會引起標(biāo)本變形或曲，而影響制片。在典型病變部位不妨多切數(shù)塊，以備

口后添制教學(xué)切片或研究的需要。

6、微量標(biāo)本和易碎標(biāo)本，為避免破損或丟失應(yīng)以紗布包裹，但包裹前紗布必

須浸濕，以免標(biāo)本粘附紗布匕

7、各組織塊應(yīng)包括各臟器的重要結(jié)構(gòu)，如腎臟組織包括皮質(zhì)部分和髓質(zhì)部分。

在有漿膜的臟器（如胃等）組織塊中，要至少有一塊帶有漿膜。

8、組織內(nèi)的鈣化病灶或骨質(zhì)，應(yīng)在充分固定之后進(jìn)行脫鈣，組織內(nèi)的非病理性異

物應(yīng)予剔除。

9、標(biāo)本上（組織塊）附著的軟組織如脂肪等，如屬非病變成分，則應(yīng)在不影

響病理診斷的原則卜，盡量剝?nèi)セ蚯谐?，以利制片?/p>

10、組織塊的固定時間不宜過長或過短，不同的固定液，固定時間有所不同，固

定后的組織需要用流水沖洗，再進(jìn)行脫水制片。

11、切取鏡檢組織塊后，可將剩余的組織放入70%灑精中保存，這樣有利于日后

再取材切片時的細(xì)胞染色。

第二節(jié)組織的固定

一、固定的意義

固定是指將各種組織浸入防腐劑內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)為不溶性。固定的作用即是用

一種方法將組織盡可能保持在它原來的形態(tài)，且能適于某些研究程序。

凡是需要制作作病理檢驗(yàn)標(biāo)本的各種組織，無論是制作切片標(biāo)本，還是制作巨體標(biāo)

本，首先必須固定。在制作切片過程中，固定最為重要的步驟，一張優(yōu)秀的組織學(xué)

切片是建立在適當(dāng)而完全的固定基礎(chǔ)之上的。固定不良在以后制片的任何階段皆不

能補(bǔ)救。因此制片的優(yōu)劣首先取決于最初固定適當(dāng)與否。

重要的是，被固定組織在動物死后或從活體切取后要盡可能立即固定。及時的取材

給迅速固定提供了先決條件。如果不迅速固定，造成固定不良，將導(dǎo)致染色不良后

果。組織的良好固定，應(yīng)該是一次性的；某些固定劑還具有助染的作用，可使細(xì)胞

各部易于著色。固定不良的組織，即使進(jìn)行補(bǔ)充固定也起不到改善染色的效果。

二、固定的目的和效果

固定組織的目的是設(shè)法得到接近正常生命狀態(tài)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，有人說''形態(tài)學(xué)的美是

良好固定產(chǎn)物”，這說明固定的特殊重要作用。

1、抑制自溶和腐?。?/p>

組織的固定能保持細(xì)胞與生活時的形態(tài)相似。因?yàn)楫?dāng)機(jī)體生命活動停止、或局部器

官、組織割離機(jī)體之后，組織細(xì)胞的代謝功能即行喪失，新鮮組織如果不經(jīng)固定，

任意放置，由于細(xì)胞內(nèi)酶對蛋白質(zhì)的分解，以及細(xì)胞的孳生等各種因素的作用，則

易因細(xì)胞繁殖而致組織腐爛。細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)分解酶將蛋白質(zhì)分解為氨基酸后脫離

細(xì)胞而引起組織的自溶。

2、保存：

細(xì)胞經(jīng)過固定，不但可以防止自溶和細(xì)菌性腐敗，而且能沉淀或凝固組織內(nèi)的各種

成份和病理代謝產(chǎn)物，如蛋白質(zhì)，脂及脂蛋白、脂肪、糖類、色素，其它碳水化合

物，無機(jī)成份，微生物等都可以經(jīng)過固定而保存下來，并在制片過程中不為其他試

劑溶解破壞。

3、硬化：

固定劑的硬化作用能使柔軟組織（如腦）的質(zhì)地變硬而易于操作。

4、膠質(zhì)物體的固化：

固定能使細(xì)胞正常的半液體狀（溶膠）變?yōu)椴荒苣孓D(zhuǎn)的固體狀（凝膠）粘度。

5、肉眼鑒別：

固定可將各種細(xì)胞和組織成分的析光率作不同程度的改變，增強(qiáng)組織的析光指數(shù)，

這樣能使各種染色成份較之未固定時更容易辨認(rèn)。

6、對染色的影響：

某些固定劑尚具有一定的媒染作用而增進(jìn)染色（如苦味酸對于染色的媒染作用）可

使細(xì)胞各種部位易于著色，所以組織固定后有利于制片染色和在顯微鏡下的觀察。

此外，固定劑有時也會影響染色效果，導(dǎo)致著色效果不理想（如福爾馬林對水溶猩

紅S染色的影響）。

7、滲透和固定：

固定還可以使組織和細(xì)胞的各種滲透壓不再發(fā)生改變，在制片時就能在最大范圍內(nèi)

保持組織和細(xì)胞的原來形態(tài)。

三、固定的方法及注意事項(xiàng)：

為使組織固定充分，應(yīng)做到固定容器要合適、固定時間要充足，固定液量要足夠。

固定組織時，應(yīng)選擇合適的容器、一般容器的容積是組織的10~15倍以上。標(biāo)本

瓶應(yīng)選擇瓶口較大的為宜，這樣便于固定后的標(biāo)本經(jīng)小口瓶硬塞進(jìn)去，這樣不僅不

利于標(biāo)本易于取出，還可能造成人為擠壓組織而致形態(tài)變化，對大件的標(biāo)本應(yīng)按巨

檢常規(guī)切片后放于容器固定。

組織固定的時間要足夠，根據(jù)標(biāo)本體積大小不同，固定時間應(yīng)有所不同，組織越大

越厚，固定時間應(yīng)越長，反之。一般4—12小時或更長。在溫箱內(nèi)將固定液稍加

溫，可使固定作用加快而縮短固定時間。

固定組織時.，應(yīng)該使用足量的固定液，多比少好，一般應(yīng)為組織體積的5—10倍,

最少也不應(yīng)于五倍。標(biāo)本最好懸浮于固定液之中，漂浮于固定液之上或沉于固定用

器之底部，都不利于固定液對標(biāo)本的滲入。如標(biāo)本塊多時，固定時不應(yīng)重疊。不要

先將標(biāo)本塊放入容器后再注入固定液，以免標(biāo)本貼付于器皿，形成固定不均勻之弊。

新鮮標(biāo)本應(yīng)及時固定，否則或因組織陳舊，或因固定不當(dāng)，而使組織原有結(jié)構(gòu)消失

而影響觀察。

標(biāo)本經(jīng)固定后，應(yīng)及時制作切片，如不能及時制片，而該固定液又不能作為保存

液時，應(yīng)改換適當(dāng)?shù)谋４嬉骸?/p>

在配制混合液時，應(yīng)了解每種固定劑的理化性質(zhì)，氧化劑不能與還原劑混合，以免

引起化學(xué)反應(yīng)，失去固定作用。

對于某些需要制作神經(jīng)染色和酶反應(yīng)等組織的固定，要求較一般嚴(yán)格，組織的大小,

固定的時間，溫度的適當(dāng)都應(yīng)慎重考慮，尤其是對于酶反應(yīng)的固定液，一般都要置

于冰箱，在低溫的條件下進(jìn)行固定。固定不好，是得不到滿意的切片和合乎標(biāo)準(zhǔn)的

反應(yīng)效果的。

任何固定液對人體都有損害作用，因此固定液的容器必須密閉，以防揮發(fā)損傷器官

和眼睛，忌用手與固定劑直接接觸，以免損傷皮膚。

四、固定劑的選擇

理想的固定劑應(yīng)該具備下列兒種性能：

1、滲透性強(qiáng)：固定劑必須能迅速滲入組織，這樣組織內(nèi)各種成分才能盡快地被固

定在原位置，而不致彌散。

2、組織在固定液的作用下，不應(yīng)發(fā)生顯著的收縮和膨脹現(xiàn)象。實(shí)際上經(jīng)過固定后

的組織，由于蛋白質(zhì)發(fā)生凝固或沉淀，必然導(dǎo)致組織出現(xiàn)不同程度的收縮或膨脹。

因此，良好的固定劑應(yīng)盡量減少組織發(fā)生這類變化。

3、固定劑應(yīng)該有利組織切片和染色，這其中含有兩種意義；

（1）固定劑對固定后的組織應(yīng)有利于染色劑的染色。例如：重輅酸鉀對于類脂質(zhì)

具有一定媒染作用；中性福爾馬林比一般福爾馬林所固定組織更優(yōu)于核的染色。

（2）固定劑能將組織或細(xì)胞中某些必須觀察的成分予充分固定而保存下來，以便染

色。例如：酸可以滲入脂類物質(zhì)使其固定下來而不至在制片過程中為酒精和二甲苯

溶解或較少地溶解，并可用石蠟包埋進(jìn)行切片。糖原的證明，則宜使用非水溶性固

定劑如無水酒精、Camoy氏固定液等。

4、固定液應(yīng)該同時也是一種較好的保存液。

實(shí)際上，沒有哪一種固定液，無任是單一固定液或混合固定液都能夠完全達(dá)到上述

要求。各種固定劑性能和作用都不盡相同，因此，對標(biāo)本的固定應(yīng)根據(jù)組織的制片

目的和要求去選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌?/p>

五、固定劑的種類

組織制片技術(shù)上所使用的固定劑種類繁多，性能各有不同，有的為氧化劑，有的為

還原劑；有的呈酸性，有的呈堿性；有的滲透力強(qiáng)，有的滲透力弱；有些易使組織

收縮，有些則使組織發(fā)生輕微膨脹現(xiàn)象。一般地說，單一固定劑要想使組織固定后

達(dá)到某種特殊染色要求是比較困難的。因此，在標(biāo)本固定中常使用兩種以上成分（固

定劑）的混合固定液。

六、用做固定劑的試劑

1、單一固定劑：

僅由一種化學(xué)物質(zhì)加水溶解后用以固定標(biāo)本的固定液叫單一固定液。常用單一固定

試劑有甲醛，灑精，冰醋酸，苦味酸，重鋁酸鉀，餓酸，氧化汞，丙酮等。除福

爾馬林，酒精和丙酮常用作單一固定劑外，其它多作混合液中的一種成分。

甲醛formaldeloyde（H?CH。）

甲醛是一種氣體，約有40%重量溶于水。這是一種還原劑，頗易揮發(fā)，這種飽

和溶液稱為甲醛溶液；其商品名叫福爾馬林。

10%福爾馬林的組成系；

甲醛溶液（福爾馬林）10ml

水90ml

甲醛是一種使用廣泛、簡便的固定劑，同時又是一種良好別的標(biāo)本保存液。經(jīng)它固

定的標(biāo)本，可適應(yīng)一些特殊染色。它的滲透性較強(qiáng)，固定均勻，能增加組織的韌性,

組織縮輕微，硬性大于酒精。

福爾馬林主要是由甲醛的聚合形式構(gòu)成，然而聚合形式的固定效果低于單體形式構(gòu)

成的10%福爾馬林，為阻止在放置一定時間的重聚作用，一般將溶液的PH值調(diào)

節(jié)至中性或偏堿性。

甲醛與蛋白質(zhì)是在分子間的交聯(lián)上起反應(yīng)，最終產(chǎn)生一種不溶性產(chǎn)物。它經(jīng)過絡(luò)合

交聯(lián)，使蛋白質(zhì)固定，能較好地保存脂類；對肝糖也有固定作用，但必須及時固定

及時處理，以免產(chǎn)生水解。

甲醛當(dāng)長期貯存，特別于寒冷氣候下，自行分解，可變混濁，有白色沉淀物，這種

沉淀即三聚甲醛，是甲醛的一種聚合形式（加熱可重新分解成甲醛）。商品福爾馬

林用甲醇阻止聚合作用。有時由于溶液不純或甲醛氧化產(chǎn)生的甲酸成分使溶液呈酸

性，酸性的甲醛溶液使標(biāo)本嗜染酸性、嚴(yán)重時可導(dǎo)致細(xì)胞核的嗜酸性染色。因此，

在備用的甲醛中宜放入小量的碳酸鎂或碳酸鈉作為中和劑。如果每100毫升的福

爾馬林固定液中加入5ml的毗咤，則可調(diào)整PH為7。不過，這些方法不能永久保

持其PH值；欲望使其長期保持中性，則需以磷酸緩沖液作溶劑進(jìn)行配制。其配制

方法如下：

10%福爾馬林1000ml

磷酸二氫鈉(NaH2PO4)4g

磷酸氫二鈉(Na2Hpe)4)6.5g

固定小的組織塊數(shù)小時即可達(dá)到固定要求。如需要快速固定時，可加溫到70?

80℃,經(jīng)過10分鐘即可達(dá)到固定要求。在甲醛溶液中短時固定的標(biāo)本，沖洗時間

在10分鐘至2小時即可，但固定時間較長的標(biāo)本需要較長時間的流水沖洗。一般

要沖洗24小時，甚至延長48小時，否則，由于甲酸的沉淀將會影響染色的結(jié)果。

甲醛能保存脂肪和類脂體，對染色體，線粒體，高爾基體，具有良好的固定作用。

經(jīng)甲醛固定的陳舊組織，尤以多血的肝脾組織內(nèi)常'可出現(xiàn)棕黑色的福爾馬林色素顆

粒，這種色素不溶于水，酒精及丙酮等，如欲與含鐵血黃素加以區(qū)別，可用普魯士

蘭反應(yīng)進(jìn)行鑒別。福爾馬林色素不含有鐵，因此，福爾馬林色素呈陰性反應(yīng)，用中

性或微堿性福爾馬林固定的效果能顯著增加對鐵離子的檢出速度且可完全避免福

爾馬林色素的形成。此外也可以使用其他試劑以浸洗方法除去福爾馬林色素的沉

淀，如:

(1)苦味酸飽和酒精(90%)溶液浸洗30分鐘后經(jīng)70%酒精再水洗后進(jìn)行染

色。

(2)什端氏(Schriade)法：

70%酒精200ml

28%氨水1ml

將石蠟切片在脫蠟以后放于上述液體中30分鐘，再用流水沖洗，而后染色。若甲

醛產(chǎn)生的色素沉淀仍未被其洗去，則可在Schriade氏液中延長時間。此法并不損

害組織。

(3)費(fèi)羅氏(Verocay)法：

80%酒精100ml

1%KOHlml

將切片在脫蠟至80%酒精后，浸入上液10分鐘，再流水沖洗5分鐘，入80%酒

精之后水洗染色。

福爾馬林固定的標(biāo)本，經(jīng)酒精脫水收縮較大，是其缺點(diǎn)。

酒精(C2H5OH)

可單獨(dú)用作固定液；亦可作混合固定液，因?yàn)榫凭?乙醇)是一種還原劑，所以不

可與銘酸，重輅酸鉀或餓酸等氧化劑相混合使用。在氧量不足時酒精易氧化成乙醛;

氧量充足則能生成酯酸，所以在正常情況下，酒精是偏酸性試劑。

酒精為常用的有機(jī)溶劑，能溶解多種有機(jī)物，高濃度酒精能凝固白蛋白，球蛋白和

核蛋白，對肝糖有固定作用，核蛋白和肝糖經(jīng)酒精固定成水溶性狀態(tài)，因此，經(jīng)酒

精固定的標(biāo)本如果固定后用水洗滌，則核著色欠佳，肝糖也將被水解。作為一種脂

溶劑，濃度在50%以上的酒精可溶解脂肪和類酯體，因此，對脂類的證明，高爾

基氏體，線粒體等染色不宜使用酒精作固定劑。

酒精還可溶解血紅蛋白和損害多數(shù)其他色素，因此，如果證明組織蛋白的色素時也

不宜以酒精作為固定劑。

濃酒精有較大的收縮力，被它固定的組織收縮顯著，表面發(fā)硬，因而酒精較難滲入

到組織中去，組織必須用酒精固定時宜先用80%的酒精固定數(shù)小時，然后再換

95%酒精，這樣可以避免組織過度收縮，因此它的穿透力緩慢且與組織長期接觸

能使之硬化，如需要證明尿酸結(jié)晶和保存糖類，則須用100%酒精固定。

酒精既有固定作用，乂有脫水作用，經(jīng)酒精固定的標(biāo)本不需洗滌，可用較高濃度酒

精直接進(jìn)行脫水，也可暫存于70%酒精中。

醋酸(CH3COOH)

純醋酸為無色，具有強(qiáng)烈刺激性的酸性液體，溫度低于17c時呈固體狀，形成冰

樣結(jié)晶體。所以，一般稱為冰醋酸。

醋酸因使膠原纖維腫脹，故不能單獨(dú)使用：但在混合固定液中有抗其它試劑使細(xì)胞

皺縮的作用。因此，醋酸常同酒精配制成為混合固定液來抵消經(jīng)過固定所引起組織

的高度收縮和硬化的作用。

醋酸可與水，酒精等溶劑相混合。一般使用濃度為0.3?5%,以5%為備用液。

用醋酸固定后的組織不必水洗，即可直接投入50%或70%酒精之中。醋酸的滲透

性很強(qiáng)，一般較小的組織塊只須1小時即可。

醋酸可使核蛋白沉淀，因此染色質(zhì)固定很快，是染色質(zhì)良好的固定液。對蛋白質(zhì)具

有保存作用，對脂類、糖不產(chǎn)生影響，高濃度醋酸則可溶解脂肪及類脂，并使線粒

體和高爾基體被破壞或變形。所以，一般配制含醋酸的混合液時，其濃度都不超過

5%o

苦味酸(C6H2(NO2)3OH)

苦味酸是一種具毒性的黃色結(jié)晶體，味苦，在空氣中干燥時有爆炸性，故需保濕保

存，最好是儲存在一層水下。一般情況下，制片室將苦味酸制成飽和溶液作為常備

用液，通常固定的濃度是飽和液，其飽和度為苦味酸溶于酒精，

二甲苯，固定后的組織經(jīng)酒精脫水即可?？辔端嵋彩且环N良好的組織染色劑，經(jīng)苦

味酸固定劑固定的組織作三色染色可使顏色對比鮮艷。

苦味酸能沉淀一切蛋白質(zhì)，并與其結(jié)合形成苦味酸鹽，遇水時，其中有的部分可溶

與水，因此在一般情況下，組織經(jīng)苦味酸或含有苦味酸的固定劑固定后，這種水溶

性苦味酸鹽在與水接觸前需先經(jīng)酒精處理使其呈不溶性，可以70%酒精浸洗，在

酒精內(nèi)加上少量碳酸鋰或氨水即可被洗去?；蛘呤遣唤?jīng)水洗，直接投入70%酒精

脫水。在脫水過程中，苦味酸可被各級酒精溶解洗去。即使不能全部洗去，亦不妨

礙染色，脫水酒精雖被染黃，但亦不失其脫水效果。

通?？辔端岢恋砑t細(xì)胞，可移走鐵離子，特別是僅少量存在時可使RNA抵抗核糖

核酸酶的消化。

重銘酸鉀(K2Cr207)

重鋸酸鉀為一種橘紅色有毒性的塊狀結(jié)晶體，溶于水，不溶于酒精，為一種強(qiáng)氧

化劑。所以其水溶液不應(yīng)與酒精，福爾馬林等還原劑相混合使用。在某些情況下，

同福爾馬林混合固定標(biāo)本時，只能在使用前相混合，過久即失去固定作用。經(jīng)重銘

酸鉀固定后的組織應(yīng)及時進(jìn)行水洗脫水，否則標(biāo)本變硬脆化，不易制成切片。如不

能當(dāng)即制作切片，可將標(biāo)本保存于福爾馬林液內(nèi)。

重銘酸鉀對蛋白質(zhì)的結(jié)合作用像福爾馬林一樣，固定胞漿不易引起沉淀作用。但在

溶液中加入醋酸，PH為3.75時，會使染色質(zhì)和細(xì)胞漿硬化，使之產(chǎn)生銘酸，才

能使蛋白質(zhì)呈網(wǎng)狀沉淀。重銘酸鉀對細(xì)胞質(zhì)，染色質(zhì)固定良好，但染色質(zhì)則被溶解。

未酸化的重鋁酸鉀雖不能沉淀蛋白質(zhì)，但可使蛋白質(zhì)變?yōu)椴蝗苄?，還可以保護(hù)磷脂

類，亦能固定類脂物，使其不溶解于脂溶劑。因此，可以固定高爾基氏體和線粒體。

重鋁酸鉀不是糖的固定液，用重鋁酸鉀(或格酸)固定的組織幾乎完全不會發(fā)生收

縮，但經(jīng)酒精脫水時，則收縮明顯。所以在脫水之前，組織需用流水沖洗16—12

小時。如把含銘組織直接轉(zhuǎn)移到酒精內(nèi)，會形成一種非溶性低氧化物而不易除去。

重銘酸鉀有溶解染色質(zhì)的缺點(diǎn)，一般備用液為5%水溶液，固定液使用濃度為1%

一3%水溶液。

倍酸(CrO3)

為暗紅色或帶暗紫色的塊狀結(jié)晶，具有強(qiáng)酸性及腐蝕性，劇毒，易潮解，為強(qiáng)氧化

劑，應(yīng)置于暗處。它是Orth氏液或ZenRer氏液等復(fù)合固定劑中的一種成分，不

應(yīng)同酒精、福爾馬林等還原劑混合使用。倍酸與乙醇，乙醛少許接觸即可引起爆炸。

格酸可沉淀所有的蛋白質(zhì)，使不溶于水，并可保存糖類。輅酸水解DNA系將其戊

糖轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N醛；亦可將糖類轉(zhuǎn)變?yōu)槿Ｒ虼薉NA和糖類不需經(jīng)過常規(guī)PAS或

Feulgen反應(yīng)的預(yù)先處理即與Sch肝試劑呈陽性染色。

格酸的滲透力較低，對標(biāo)本收縮輕微，經(jīng)鋁酸固定劑固定的組織像用重格酸鉀固定

一樣需徹底水洗，將組織中銘酸全部洗去，否則在脫水過程中，銘酸與酒精作用生

成氧化鋁的沉淀，使組織脆化，且不易于組織的著色。銘酸適合固定的濃度為

0.5%-l%o

四氧化鉞(0s04)

為微黃色結(jié)晶，通常密裝于安甑內(nèi)出售，為強(qiáng)氧化劑，一般認(rèn)為它使未飽和鍵氧化。

對飽和脂肪不起反應(yīng)，未飽和脂類可還原0s04,易氧化為黑色氫氧化物，溶液呈

中性，揮發(fā)性強(qiáng)，在操作四氧化鉞時應(yīng)小心，因其氣體有刺激性，會引起結(jié)膜炎。

遇熱和光時易還原，故應(yīng)貯于冷暗處。平時溶液密閉有色瓶中，并置于冰箱內(nèi)。

四氧化鉞是脂肪和類脂質(zhì)的固定液，用以顯示脂類(例如髓脂類)。能使單個細(xì)胞

或小組織的微細(xì)構(gòu)造得以極好地保存，因此幾乎是用于電子顯微術(shù)最佳固定劑。組

織經(jīng)固定后，脂肪，類脂呈黑色，微溶于二甲苯及酒精，脫水后最好以苯作透明劑。

四氧化鉞的滲透力弱。組織塊如過2—3厘米厚度則穿透不良和不均。所有含四氧

化鉞固定劑的固定作用皆很不均勻；固定不良的組織切片表現(xiàn)周圍有一圈過度固定

的暗色區(qū)帶；中心為固定不足致使細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)不清的區(qū)域。有些成分變暗是由于

無色的0s04轉(zhuǎn)變?yōu)楹谏衔颫sO4?5H2O形式。

四氧化鉞常與輅酸，醋酸，重銘酸鉀等混合使用，固定后的組織需經(jīng)流水沖洗，否

則在脫水酒精中易被還原產(chǎn)生沉淀，不利于核著色，在每10毫升溶液中內(nèi)加入1

滴飽和氯化汞水溶液有助于制止還原作用。

氯化汞(又名升汞或二氯化汞HgCL2)

氯化汞為白色粉末或針狀結(jié)晶，后者為化學(xué)純品，易升華，能溶于水和酒精。一般

固定用其飽和溶液。

氯化汞是一種能迅速透入并使組織硬化的蛋白沉淀劑。通常像別的金屬離子那樣，

它與蛋白質(zhì)的酸基以及核蛋白的磷酸基相結(jié)合，亦特異地與氫硫基起反應(yīng)。因而經(jīng)

Hg固定后的蛋白質(zhì)不溶于水，大多數(shù)蛋白反應(yīng)可被利用?？上В耐溉胨俣扔?/p>

最初兒毫米后就急驟降低，因此組織塊厚度如超過5毫米常使外圍過度固定致堅(jiān)硬

而中心固定不足仍柔軟，只宜固定薄片組織。由于此缺點(diǎn)加之使組織收縮劇烈，很

少單獨(dú)使用；當(dāng)與拮抗此缺點(diǎn)的試劑如醋酸，福爾馬林，重倍酸鉀等結(jié)合使用時;

氯化汞仍是很多優(yōu)良常規(guī)固定劑的一種成分。用氯化汞固定的組織使染色特別對胞

漿著色比較鮮麗。

凡用含氯化汞的固定劑固定的組織如超過規(guī)定時間會使組織過度硬化，而難切薄

片。組織內(nèi)常存有汞鹽，切片時能損傷切片刀，所以在脫水前應(yīng)予以洗去。常用方

法是用70%酒精加入少量碘（0.5%）浸洗，再進(jìn)行充分的沖洗或以70%酒精洗

后進(jìn)行脫水。也可在切片染色前用含碘的70%酒精漂洗數(shù)分鐘，再以5%硫代硫

酸鈉漂洗，水洗后進(jìn)行染色。

氯化汞常備溶液為飽和（約7%）水溶液，固定用濃度常為5%水溶液。用升汞飽

和液固定組織時，臨時須加5%冰醋酸。固定2—3mm厚的組織塊須經(jīng)6—18小

時，然后用水洗24小時，再保存于80%酒精中。

氯化汞腐蝕金屬，混有此試劑的固定液不能使用金屬容器盛裝或用金屬鑲子夾持。

氯化汞有劇毒，應(yīng)妥善保管。

固定劑的選擇取決于研究工作當(dāng)時和下一步的需要，在選擇混合固定劑時，應(yīng)注意

各種試劑的平衡，如使組織收縮的試劑可配以使組織膨脹的試劑，滲透力弱的可與

滲透力強(qiáng)的混合使用。但是，氧化劑原則上不與還原劑混用，如需要時，只能在使

用前臨時混合。一種混合固定劑內(nèi)不宜有兩種以上的鹽類，以免產(chǎn)生復(fù)鹽影響對組

織的固定，如氧化納和氯化鈉同時應(yīng)用時，常將氯化鈉改用硫酸鈉。技術(shù)工作者和

病理工作者都應(yīng)了解各種固定劑的性能。固定液的選擇恰當(dāng)，才能獲得滿意的制片

結(jié)果。

混合固定液的種類很多，本章內(nèi)所述的固定劑皆是較常用的，特殊染色所需的固定

劑皆列在相應(yīng)的標(biāo)題下。

Miiller氏液

配方：重銘酸鉀2.5g

硫酸鈉1.0g

蒸播水加至100ml

此液固定作用緩慢，但頗均勻，收縮亦小。多用于媒染和硬化神經(jīng)組織，在這種固

定溶液中，重鋁酸鉀未經(jīng)酸化，所以對染色質(zhì)無固定作用。不適用于一般細(xì)胞學(xué)染

色。除用于骨骼標(biāo)本外，此液是一種不常用的固定劑。固定時間數(shù)天至數(shù)周，在固

定過程中，需要每日更換新液并置暗處，固定后的組織用流水沖洗，再放入酒精中

脫水。

Orth氏液（Mullr氏液+福爾馬林）

配方：重格酸鉀2.5g

硫酸鈉1.0g

福爾馬林10ml

蒸儲水加至100ml

一般以Mullr氏液為備用液，用前以9份Mullr氏液加1份福爾馬林混合而成，因

為重銘酸鉀是氧化劑，福爾馬林為還原劑，混合后久放即失去固定作用。

固定0.5厘米的標(biāo)本塊約需3—4日，每日需更換新液，標(biāo)本固定后要充分水洗，

然后進(jìn)行脫水包埋。如固定過久，標(biāo)本變脆，顏色由棕黃轉(zhuǎn)變?yōu)楹谏瑒t不能制作

切片，標(biāo)本經(jīng)固定后如不能及時制片時，應(yīng)將標(biāo)本保存于福爾馬林內(nèi)或70%酒精

中。

Orth氏液對染色質(zhì)，線粒體有較好的固定效果。硫酸鈉在固定液中有助于滲透作

用，在一般情況下，可省去不用。

Zenker氏液（以Muller液為基液加入氯化汞在臨用前再加醋酸混合而成）

配方：重銘酸鉀2.5g

硫酸鈉1.0g

氯化汞5.0g

蒸儲水加至100ml

冰醋酸（臨用時加入）5ml

Muller液加入醋酸后則不能貯存，未加醋酸的溶液（ZenRer氏原液）可保存較

久。此液加入冰醋酸后，與重鋁酸鉀作用生成餡酸，是蛋白質(zhì)的良好固定劑，其穿

透力迅速而均勻硬化組織能力強(qiáng)，經(jīng)它固定后的標(biāo)本利于鹽基性染色劑著色，胞核

和胞漿染色頗為清晰，是一種優(yōu)良的常規(guī)固定劑。

Zenker氏固定液中含有兩種蛋白質(zhì)和三種染色質(zhì)的固定劑：

所以Zenker氏液在組織學(xué)和病理學(xué)方面均較廣泛使用，固定作用通常于12小時

內(nèi)完成。固定薄組織塊2—4毫米時，固定12—14小時，然后用流水沖洗過夜（以

除去多余的銘化物，汞色素須用碘來脫除）后進(jìn)行脫水，或保存于80%酒精中。

Heely氏液

Heely氏液將Zenker氏液中的醋酸以福爾馬林替代，并名之為Helly氏液。液中

重銘酸鉀未經(jīng)酸化，對細(xì)胞質(zhì)固定較好，對造血系統(tǒng)（骨、髓、脾、肝）等為一良

好固定液。用于結(jié)締組織染色效果也好。

配方：重銘酸鉀2.5g

硫酸鈉1.0g

氯化汞5.8g

蒸儲水加至100ml

臨用前加福爾馬林5ml

此液配好后24小時內(nèi)有效，組織固定12—24小時后，流水沖洗，脫水。

Bouin氏固定液

配方：苦味酸飽和水溶液75ml

福爾馬林（40%甲醛液）25ml

冰醋酸5ml

此固定液保存性良好，滲透速度快，穿透力迅速而均勻，且很少引起收縮，不使

組織變硬和變脆，固定后的組織用三色染色法著色鮮艷絢麗，過量苦味酸使組織呈

黃色，但并不妨礙染色，毋須洗凈除去。

此液也是皮膚組織較好的固定液，它可以軟化表皮不使其變硬變脆。利于切片，對

蛋白質(zhì)核酸有較好的固定作用，一般固定時間為數(shù)小時至一日。

Carrnoy氏固定液

配方：無水酒精60ml

氯仿30ml

冰醋酸10ml

此液穿透力非常塊、固定力強(qiáng)，對核固定良好，并可保存糖原也用于糖類的固定。

于脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）的固定。一般組織固定2—3小時后

即可直接投入95%酒精和純酒精中進(jìn)行脫水，因此也可作快速固定的固定劑，厚

度2—9毫米的小塊組織僅需15分鐘即可，外檢胸腹水經(jīng)過離心沉淀后，將沉淀

物用Carrnoy氏液固定可制作石蠟切片。

醋酸一酒精一福爾馬林混合固定液

配方：福爾馬林10ml

冰醋酸5ml

70%酒精85ml

這種混合固定液通常簡稱、'AAF”固定液。使用較廣泛，配制時一般可以酒精作為

溶劑，然后加入福爾馬林，醋酸。酒精可因組織種類不同而采用不同的濃度，在常

規(guī)切片中，我們常采用濃度為95%酒精。

此液對糖原的固定佳良，就是說在蛋白質(zhì)成分完全固定之前可以防止糖類溶解，

加入醋酸以保證蛋白質(zhì)的固定，由于酒精和福爾馬林二者皆為迅速穿透的試劑，這

是一種相當(dāng)好的快速固定劑，對臨床外檢工作特別有利，福爾馬林對組織染色效果

較好，醋酸可以防止酒精而引起的收縮。常溫下，5毫米厚的組織固定4小時即可,

加溫（60℃）條件下，一般組織半小時內(nèi)可固定良好，固定后組織直接放入95%

酒精中脫水。

AAF固定液的缺點(diǎn)是組織固定后對細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)的某些結(jié)構(gòu)有一定

破壞作用，而對免疫組織化學(xué)染色有一定影響（詳見免疫組織化學(xué)技術(shù)一章）。

其它常用固定液配方

10%甲醛生理鹽水液

配方：福爾馬林100ml

氯化鈉9.0g

蒸鐳水900ml

Gendre液

配方：苦味酸飽和于95%酒精溶液80ml

福爾馬林15ml

冰醋酸5ml

用此液在室溫下3-4小時即可使糖原固定良好。

緩沖福爾馬林液

配方：福爾馬林10ml

磷酸二氫鈉（NaH2Po4?2H2O）0.4g

磷酸氫二鈉（Na2HPO4）0.65g

蒸儲水100ml

緩沖福爾馬林固定劑具有能較好地保存細(xì)胞結(jié)構(gòu)和某些細(xì)微結(jié)構(gòu)，適于免疫組織

化學(xué)染色和電鏡觀察，并且可較長時間保存組織（半年至一年）而又不影響制片和

染色。是近年來越來越受到重視的固定劑。

第三節(jié)大體標(biāo)本的處理和固定

解剖所得的臟器標(biāo)本，可提供臨床病理討論及教學(xué)和科研之用，除對有典型的病變

臟器制成標(biāo)本外，對有重要病變的臟器亦應(yīng)固定保存，條件允許可將全部臟器切成

需要的大小保留。

通常所用的固定液是10%甲醛（即福爾馬林）水溶液（市售甲醛溶液用水稀釋1：

9）。這樣既可使組織內(nèi)的蛋白和脂類等成分凝固，又可使組織不致腐爛。為了保

存組織內(nèi)的各種水溶性成分、如粘液、肝淀粉和尿酸鹽結(jié)晶等，應(yīng)在剖驗(yàn)當(dāng)時將部

分臟器切成組織塊放入純酒精液固定，切不可著水。

只有細(xì)心且有計(jì)劃地進(jìn)行尸體剖檢，并在切除器官后仔細(xì)處理才能獲得良好地陳

列標(biāo)木。剖檢過程中的粗心和草率，很容易破壞一個有價值的標(biāo)本。因?yàn)榻裉斓某?/p>

見病明天會成為罕見病例，為此重要的是保持這些病理標(biāo)本原有的形態(tài)和色澤。有

時外科手術(shù)摘除的標(biāo)本，如經(jīng)適當(dāng)處理也可以成為最好的陳列標(biāo)本。

常規(guī)的福爾馬林固定后，大體標(biāo)本常呈灰褐色，用下述方法擬可保存大體標(biāo)本的

色澤，使之更接近自然色彩。

配方：甲醛20ml

硝酸鉀3g

醋酸鉀3g

生理鹽水加至100ml

固定時間視標(biāo)本的大小而定，一般24—72小時。固定后經(jīng)充分的流水沖洗后再放

入下述保存液中長期保存。

甘油20ml

醋酸鉀4g

麝香草酚0.2g

蒸播水加至100ml（PH=8）

第四節(jié)陳列標(biāo)本的固定

一.為供日后臨床病理討論、教學(xué)和研究用的標(biāo)本，必須將有關(guān)主要病變的臟器和

其它繼發(fā)變化的臟器一并保留，這樣就保持了各臟器病變的聯(lián)系性和整體性。

二,將每一尸體的內(nèi)臟放入一個較大的玻璃缸內(nèi)。這種園缸應(yīng)有緊密的玻璃蓋，使

之不漏氣。缸內(nèi)先裝半缸10%甲醛液，再將需要保留的各臟器放入，一定要浸在

固定劑內(nèi)，若聽任露在液面外的組織變干，則會造成一塊永久的暗色區(qū)。

三.各標(biāo)本如肝、脾和腎等應(yīng)具有一光滑平整地切面（須以鋒利的長刃刀一次切出）。

輕放在缸內(nèi)，以免彎曲變形，缸內(nèi)切不可多裝標(biāo)本，特別是新鮮的軟標(biāo)本和對有教

學(xué)價值的標(biāo)本要分別固定，以免擠壓、防止固定不足和變形而失去原有的特征。缸

內(nèi)固定液的量是標(biāo)本體積的4-5倍。一般實(shí)質(zhì)性臟器制作標(biāo)本時，其厚度宜在1.5

厘米左右，過厚則固定液不易滲透入內(nèi)，過薄則易變形翹起。

四.肺臟標(biāo)本比重較輕，易漂浮在液面，可用薄層脫脂棉花覆蓋其表面、借以棉花

纖維的虹吸現(xiàn)象，可不斷地浸濕標(biāo)本。在有條件的情況下，為保證充分固定，應(yīng)盡

可能向標(biāo)本內(nèi)灌注固定劑。

五.標(biāo)本放入固定液12小時后應(yīng)加以翻轉(zhuǎn)，以使標(biāo)本與缸底或缸壁接觸部分能很好

浸透固定液。

六.具有空腔的臟器（如大、小腸）膜組織（如胸膜、腹膜等），皮膚等則應(yīng)在剪

開后用扣針將其邊沿釘在硬紙板上，標(biāo)本朝下浸到固定液內(nèi)，以保持病變的形態(tài),

使用的扣針需防銹(也可用玻璃，竹簽或不銹鋼針)以免污染標(biāo)本。

七.囊腔組織如果沒有打開可用注射器注入固定液使之充盈；如已打開則需填入浸

有固定劑的脫脂棉以保持其自然狀態(tài)。

八.被膽汁污染或含膽汁的標(biāo)本，必須分別固定貯存，否則會污染別的標(biāo)本。

九.標(biāo)本的外觀、標(biāo)簽和目錄也同樣重要，大體標(biāo)本的編號最好用布條，用碳素墨

水書寫解剖號碼，然后將布條浸漬溶化的石蠟，冷卻后將標(biāo)簽系于標(biāo)本上或投入缸

內(nèi)，標(biāo)本缸外面亦須貼上解剖號碼，以便隨時取驗(yàn)。

十.大體標(biāo)本的保存和管理必須予以重視，應(yīng)定期加入甲醛溶液以補(bǔ)充平時之揮發(fā)。

液體內(nèi)混和少量麝香草酚，作為防霉劑。平時也勤加管理，以防止發(fā)霉和標(biāo)本腐爛。

除有明確病變需要保留的標(biāo)本外，對廢舊標(biāo)本亦須妥善處理。一般相隔3—6個月

后，集中裝于草包內(nèi)焚化或深埋。

第五節(jié)脫鈣

組織里存有鈣鹽可妨礙用常規(guī)方法制作良好切片。骨組織及鈣化病灶，經(jīng)過固定后,

必先將鈣鹽除去使組織軟化，才能進(jìn)行常規(guī)切片。如脫鈣不全則切片易撕開或碎裂

并損傷切片刀刃。脫去鈣鹽的過程一一稱為脫鈣。脫鈣時應(yīng)注意：

1.骨組織固定24小時后，鋸下不超過0.5mm厚的薄骨片，再以10%福爾馬林

固定后進(jìn)行脫鈣。(未固定的組織在酸性脫鈣液中受到的損傷比已固定的組織約大

三倍)。骨組織過厚則需延長脫鈣時間，長時間浸于強(qiáng)酸影響切片染色效果。

2.在不影響診斷的條件下，應(yīng)將骨組織周圍的軟組織全部剝?nèi)?。如果切片目的在?/p>

觀察骨髓病變或骨組織腫瘤，最好除去一部分正常的致密的骨組織，以利于脫鈣和

制片。

3.脫鈣前最好先將骨組織進(jìn)行脫脂。

4.脫鈣要徹底，脫水應(yīng)充分，在脫水過程中，要注意不使其過度硬化。

脫鈣劑

優(yōu)質(zhì)脫鈣劑的標(biāo)準(zhǔn)是：

(a)完全脫鈣。

(b)不損傷組織細(xì)胞或纖維。

(O不妨礙以后的染色技術(shù)。

(d)適當(dāng)?shù)拿撯}速度。

一、強(qiáng)酸脫鈣劑

1.含甲酸脫鈣液

Gooding和Stewart氏液(甲酸一福爾馬林液)

配方：甲酸5-25ml

福爾馬林5ml

蒸儲水加至100ml

5%的甲酸是一種良好的常規(guī)脫鈣劑，速度適當(dāng)，組織損害小。當(dāng)甲酸成分增至25%

則增快脫鈣速度，加入甲醛可適當(dāng)保護(hù)組織不受酸損害，但應(yīng)切記，增加脫鈣速度

只能靠犧牲細(xì)胞微細(xì)構(gòu)造來獲得。

根據(jù)組織的厚度和鈣化程度，在5%甲酸液內(nèi)2—4天可完全脫鈣，橫切的肋骨

需36-48小時。

2.含鹽酸脫鈣液

VonEbner氏液

配方：濃鹽酸15ml

氯化鈉7.5ml

蒸儲水加至100ml

鹽酸脫鈣易使組織收縮，作用速度較快，用氯化鈉作為溶劑則效果良好，牙齒脫

鈣時鹽酸可增至10—20%。脫鈣時，每日應(yīng)加鹽酸（0.5%）直至完成脫鈣，橫

切的人肋骨（5毫米厚度）于36-72小時內(nèi)脫鈣。

3.硝酸脫鈣液

是最常用的脫鈣劑，用硝酸作脫鈣液的缺點(diǎn)是形成亞硝酸而使溶液呈黃色，產(chǎn)生顏

色即迅速影響脫鈣速度，且組織的黃染會妨礙隨后的染色反應(yīng)。在硝酸內(nèi)加入

0.1%尿素可以防止變黃而使之無色，但尿素僅有暫時作用，一旦硝酸顯淡黃時需

要加入。

福爾馬林一硝酸液（Qayden氏液）

配方：福爾馬林5ml

硝酸（比重1.41）7.5-15ml

蒸儲水加至100ml

此處方中甲醛可部分地抑制硝酸的浸軟作用，這即具有脫鈣作用，又具有固定作

用，硝酸脫鈣迅速，組織不膨脹，掌握好脫鈣時間可直接脫水，不影響染色效果。

但最好先洗去硝酸。

橫切人肋骨（5mm）用含7.5%硝酸液于1—2天內(nèi)脫鈣。

硝酸水溶液

配方：硝酸（用0.1尿素穩(wěn)定）5-10ml

蒸饋水加至100ml

此液用作常規(guī)脫鈣劑，作用迅速，對組織不膨脹，對細(xì)胞的保存和染色比前者更好,

能適用多種染色技術(shù)，但每日需要更換新鮮溶液，最好早晚各一次，一般1—3天

完成。

橫切人肋骨（5mm）在12—24小時內(nèi)脫鈣。

二、螯合劑脫鈣

乙二胺四乙酸（EDTA）是用以脫鈣地螯合劑。為有機(jī)化合物，有結(jié)合某些金屬

的能力，能結(jié)合鈣鹽，15%的溶液即起脫鈣作用，組織用此方法脫鈣，對組織破

壞性小，即放置數(shù)月亦不致引起對組織的破壞，對以后大多數(shù)的染色技術(shù)皆可得到

滿意結(jié)果。

經(jīng)10%中性福爾馬林鹽固定后，將組織移到50倍用磷酸鹽緩沖劑緩沖至PH值

等于7的5.5%EDTA內(nèi)。

不超過5毫米厚度的小塊組織在此液內(nèi)每4-5天換液一次，更換三次后再每天

換液一次以便較準(zhǔn)確的確定脫鈣終點(diǎn)。脫鈣''終點(diǎn)"可用X射線方法或用草酸鹽化學(xué)

方法。

完全脫鈣后將組織直接移到70%酒精內(nèi)常規(guī)脫水，浸蠟，石蠟或火棉膠包埋。

三、脫鈣步驟

1.取材：骨組織固定于10%福爾馬林24小時后再鋸取厚度約0.5厘米骨片。

2.固定：再以10%福爾馬林固定2天。

3.將組織置于脫鈣劑中，每日更換新鮮液、直至組織軟化為止。

4.流水沖洗24小時（除酸）。

5.進(jìn)行常規(guī)脫水，透明，浸蠟，切片。

四、鑒定脫鈣是否徹底

確定脫鈣''終點(diǎn)"三種方法：

1.最常用的是最簡單的方法一一針刺，如果很容易被刺透，而且不感到阻力時，

說明組織基本上脫鈣完全，否則應(yīng)繼續(xù)脫鈣?？拷M織的柔軟性測驗(yàn)脫鈣作用靠不住,

而且這種插入一根針以察覺鈣沉淀的方法會造成組織損傷。

2.用X射線檢查：看組織內(nèi)是否仍有鈣質(zhì)。

3.用化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢查：

取5ml脫鈣液用2M的NaOH（氫氧化鈉）調(diào)整至中性，再加5%草酸鈉或草酸

鍍1mL液體混濁表示有鈣質(zhì)。遲至5分鐘仍不混濁表示脫鈣液中不含有鈣質(zhì)。

組織中仍有鈣質(zhì)時，一定量的鈣離子會溶于脫鈣液中，游離的鈣會干擾脫鈣作用的

完成。顯然，應(yīng)在每次試驗(yàn)時完全更換，再試驗(yàn)中必須經(jīng)過2—3小時間隔讓鈣溶

解。

五.酸的中和

脫鈣后水洗24小時，目的是除去組織中經(jīng)無機(jī)酸浸漬后過多的酸，以免影響染色。

再沖洗前應(yīng)將組織用一種堿處理以使之脫酸呈中性，可用5%硫酸鉀或硫酸鈉處理

過夜。（否則會引起組織膨脹）但直接轉(zhuǎn)移到稀酒精（70%）內(nèi)過12—18小時

換液2次，再繼續(xù)脫水，經(jīng)無水酒精，氯仿透明，石蠟包埋，切片，整個過程其酸

已全部除去，在多數(shù)情況下不僅不膨脹且對染色反應(yīng)能有所改善。因此不沖洗對染

色也沒大礙，只是脫水劑被酸化。

第六節(jié)組織的沖洗

組織經(jīng)過固定后，脫水之前應(yīng)進(jìn)行沖洗，將組織內(nèi)的固定液洗干凈，否則殘留組織

內(nèi)的固定液有礙制片和染色，而有些固定液則可在組織中繼續(xù)起到脆化組織的作

用，以至于損壞組織，給制片工作帶來不利。在沖洗時，沖洗劑的選擇應(yīng)依固定液

的種類和性質(zhì)而有所不同。

沖洗時應(yīng)注意以下事項(xiàng)：

1.水溶性的固定劑：需用流水沖洗。

2.酒精溶劑的固定劑：應(yīng)用同濃度的酒精浸洗。

3.含苦味酸的固定劑：（苦味酸與甲醛混合液除外），須用70%酒精浸洗，以

免水洗后固定作用消失。

4.含有升汞固定劑：組織經(jīng)固定后應(yīng)在沖洗劑一水或酒精中加碘以洗去組織內(nèi)

汞的沉淀。

5.含有格酸的固定劑：組織在沖洗時最好置于暗處，以免產(chǎn)生沉淀或使組織硬

化而影響制片。

第二章石蠟包埋技術(shù)

制作石蠟切片，切片前須將石蠟滲透組織包埋于石蠟中，而水與石蠟又是不相混合

的，所以在浸蠟，包埋前必須將組織內(nèi)所含的水分脫去。而大多數(shù)的組織固定劑是

水溶液，隨后的水沖洗也使其含有大量水分，因此必須先行脫水，一般是浸入逐級

增加濃度的酒精來完成。由于酒精和石蠟不能混合，須再用一種石蠟的溶劑來置換

酒精，因大多數(shù)石蠟溶劑有使組織的折光率增高并表現(xiàn)為透明或半透明狀，所以此

步驟又稱透明。最后用石蠟浸漬組織并鑄制成堅(jiān)實(shí)的蠟塊。

常規(guī)的石蠟包埋過程包括五個基本步驟，即固定，脫水，透明，浸蠟和包埋，前一

章中已述過固定。

第一節(jié)脫水

脫水就是用脫水劑完全除去組織內(nèi)的水分，為下一步透明及浸蠟創(chuàng)造條件。此外，

脫水還可以使組織再次發(fā)生一定的硬化，脫水劑必須是與水在任何比例下均能混合

的液體。

常用的脫水劑

1.酒精：是制片最常用的試劑，可與水在任何比例下相混合，酒精的脫水能力比

較強(qiáng)，又能硬化組織。但是酒精的船頭速度很快，對于組織會有明顯的收縮作用。

因此在以酒精作為脫水劑時，應(yīng)該先從濃度較低的酒精開始，然后遞增其濃度，這

樣可以避免組織過度收縮。

第一瓶酒精濃度隨固定劑，脫水組織的大小和種類而異，經(jīng)水溶性固定劑固定的細(xì)

柔組織需要慢慢脫水，從50%酒精開始。如眼球，組胚組織等大多數(shù)組織標(biāo)本則

是從70%酒精開始，再經(jīng)80%,95%以至無水酒精。但是有時為了某種特殊要

求，例如要做糖元的切片標(biāo)本或是要做尿酸結(jié)晶染色切片標(biāo)本，為了防止糖元和尿

酸結(jié)晶在水中消失卻要直接投入無水酒精中固定，而不需要經(jīng)過水洗和低濃度酒精

的脫水過程。經(jīng)無水酒精固定后的組織只需要再經(jīng)過換一次無水酒精脫水即可。

用AAF固定液固定的組織可直接置于95%酒精開始脫水。用醇性固定劑（如

Carnoy）則可置于高濃度無水酒精內(nèi)，但應(yīng)多次換液以除酸。

一般情況下，組織經(jīng)過70%,80%,90%,95%,以至無水酒精的脫水程序，

即可達(dá)到脫水的要求。但是為了能使大量的組織塊同時進(jìn)行脫水，則要求保持液體

的濃度以保證脫水的作用，最好是以兩次95%酒精，兩次100%酒精重復(fù)進(jìn)行脫

水，以保證組織的水分脫凈。脫水時間應(yīng)視組織種類，組織塊大小，厚薄和固定劑

的不同而異。如脫鈣的骨組織，實(shí)質(zhì)性臟器等的脫水過程宜短，而疏松結(jié)締組織，

脂肪組織等，脫水過程則宜適當(dāng)延長。水分必須脫干凈，脂肪必須溶去。含有銘酸

的固定劑固定的組織，脫水時間不宜過長，而鍍銀組織更應(yīng)注意，脫水時間應(yīng)比為

鍍銀的同類組織要短。

脫水的基本原則：從低濃度酒精開始逐漸升到高濃度酒精，以保持組織中的水分完

全脫凈。一般lcmXlcmX0.2cm大小的組織,脫水全過程僅需要數(shù)小時即可達(dá)到

完全脫水。在各級濃度酒精內(nèi)處理的最短時間分別減少到2—4小時也能獲得滿意

的結(jié)果。如果組織脫水不盡，隨后的透明，浸蠟都會受到影響，致使切片很難以完成。

較差質(zhì)量的切片，很容易造成在染色時脫片，這樣的組織蠟塊，因其含有一定的水分,

一經(jīng)與空氣接觸即干燥而凹陷。脫水不盡的組織是不能切出很好的切片的。

外檢標(biāo)本的制作，目前都采用快速脫水的方法?？蒲袠?biāo)本，教學(xué)標(biāo)本的脫水時間比較

長，其目的在于更充分脫水,并適當(dāng)加強(qiáng)了組織的硬度。

酒精脫水劑使用不宜太久，應(yīng)適時更換新液。當(dāng)酒精混濁，變黃或酒精滴于水中出現(xiàn)

乳白色混濁時，說明酒精中溶解了過量的脂類，這種情況一出現(xiàn),將會影響脫水，則應(yīng)

及時更換。

各種濃度酒精的配制：

切片室內(nèi)應(yīng)常備有70%,80%,85%等各種濃度的酒精。配制時應(yīng)以95%酒精作

為基液加水稀釋，不要用無水酒精去配制，因無水酒精的價格較高，極不經(jīng)濟(jì)。

配制方法如下：

1.先將高濃度酒精注入量杯，其量同將要稀釋酒精濃度數(shù)字相等。

2.加入蒸儲水，致總量達(dá)到原酒精濃度的數(shù)字量。例如：

(一)用95%酒精配制成70%酒精時：

(1)取95%酒精70毫升；

(2)加蒸儲水使達(dá)到95毫升；

稀釋后的酒精既為70%的酒精。

(-)用80%酒精配制成60%酒精時：

(1)取80%酒精60毫升;

(2)加蒸儲水使達(dá)到80毫升；

稀釋后的酒精既為濃度為60%的酒精.其余類推，其他的試劑的稀釋也均可以參照

此方法進(jìn)行配制。

2.丙酮(Acetone)：可用作固定液，也是一種比較好的脫水劑。脫水能力強(qiáng)、速度

快,可配制不同濃度進(jìn)行脫水。但一般情況下，多用在無水酒精的補(bǔ)充脫水。

丙酮脫水時間比酒精強(qiáng)，但容易使組織過度硬化,所以應(yīng)適當(dāng)掌握脫水時間。

3.正丁醇(丫-Butyalcohol)：正丁醇脫水能力較酒精弱，可與水、酒精相混合，而且

也能溶解石蠟，因此正丁醇不僅可以替代酒精使組織脫水，還可以代替二甲苯使組織

透明。平常在稀釋時都與酒精按照一定比例配制使用，或?qū)⒔M織脫水至90%酒精后

移入正丁醇，正丁醇再脫水后可直接投入石蠟。用正丁醇脫水,組織比較少引起收縮

和硬化等不良結(jié)果。

4.二氧乙環(huán)(Dioxan)：二氧乙環(huán)是一種有毒物質(zhì),易揮發(fā)(使用場所必須通風(fēng))，能同

水、酒精、二甲苯相混合并能溶解石蠟，是一種既可以脫水，也具有透明效果的液體。

脫水一般可以70%開始,再經(jīng)過90%至純二氧乙環(huán)，然后浸入石蠟。二氧乙環(huán)脫水

對組織無收縮和硬化等不良現(xiàn)象,對較硬的組織或易收縮的組織可使用二氧乙環(huán)。

二.組織的搖震

為加快脫水進(jìn)程可將標(biāo)本放入各級酒精內(nèi)借助機(jī)器或手工震搖，還可以加溫促進(jìn)脫

水。即將標(biāo)本裝在塞緊的玻璃瓶置于包埋箱或溫箱內(nèi)，因液體受熱產(chǎn)生的正壓可增

加溶液的對流。但熱酒精會使組織過硬，并有爆裂危險，除急診外，最好不用此方

法。

第二節(jié)透明

組織脫水后，還要經(jīng)過一個浸蠟的媒劑透明過程。目的是使石蠟滲透到組織中去，

達(dá)到包埋的支持作用。常用的脫水劑如酒精等，不能溶解石蠟與之相混合，因此必

須使用一種既可以同酒精又能同石蠟相混合的媒劑，當(dāng)組織脫水后，浸蠟之前將組

織投入這種媒劑中。由于兩劑能相混合，另一方面也由于這種媒劑比酒精比重大，

組織中的酒精就被該媒劑取代，待酒精完全被該媒劑完全取代后，組織即成透明狀

態(tài)，因此我們長稱這種媒劑為透明劑，在制片中的這一過程就稱為透明過程。實(shí)質(zhì)

上透明僅是一種過程而非目的，其所以出現(xiàn)透明現(xiàn)象使因其折光系數(shù)改變的緣故。

從組織的狀態(tài)上看，由于組織經(jīng)過媒劑的作用之后，其折射系數(shù)近于組織蛋白的折

射系數(shù)，從而顯示出透明狀態(tài)。組織一旦呈現(xiàn)透明狀態(tài)，也說明脫水劑已被媒劑所

取代。透明后就可以將組織浸入溶解的石蠟進(jìn)行浸蠟。

透明劑

透明劑很多，一般常用的有二甲苯，苯，甲苯，氯仿，香柏油等。

1.二甲苯：是最為常用的一種透明劑，它能與酒精，丙酮相混合，又是石蠟的溶

劑。在透明過程中，組織繼續(xù)發(fā)生硬化，由于二甲苯對組織的收縮性強(qiáng)，作用迅速,

因此，組織在二甲苯中時間不宜過長，否則組織容易變脆變硬，一般是達(dá)到組織的

透明為度，小塊組織在半至一小時內(nèi)透明。為了不使組織過度硬化，苯則。是更好

的一種透明劑，它較甲苯和二甲苯的作用稍緩，對組織收縮較少，不易變脆。但苯

較二甲苯毒性大，揮發(fā)快，故應(yīng)注意安全使用。

2.氯仿：也是一種很好的媒劑，它的作用緩和。組織在此液內(nèi)過夜也不至于過硬

變脆，這一點(diǎn)較苯，二甲苯和甲苯優(yōu)良。但氯仿比重較大，折光率較小，不能改變

組織的折光率，組織在氯仿中不易呈現(xiàn)二甲苯那樣的透明現(xiàn)象，所以組織要比實(shí)際

需要浸漬更長一些時間保證完全滲透和置換出酒精。

3.香柏油：是研究處理細(xì)柔組織的最佳透明劑，因它的硬化作用極小，組織在此

液體內(nèi)較長時間甚至幾個月也可無妨。過硬的組織脫水后，（如皮膚和致密纖維組

織）用香柏油透明，經(jīng)此處理后的組織容易切片。不過香柏油的濃度大，滲透力弱，

同石蠟混合不及其他透明劑效果好，故常規(guī)石蠟切片一般不用。

透明時間的