食品生物工程

食品生物工程第1頁/共66頁內(nèi)容一、概述二、原料與預(yù)處理三、固液分離和細(xì)胞破碎四、初步純化五、精細(xì)純化六、成品加工第2頁/共66頁一、概述生物工程下游技術(shù)是指從基因工程獲得的動、植物和微生物的有機(jī)體或器官上，從細(xì)胞工程、發(fā)酵工程和酶工程產(chǎn)物（發(fā)酵液、培養(yǎng)液）中把目標(biāo)化合物分離純化出來，使之達(dá)到商業(yè)應(yīng)用目的的過程。第3頁/共66頁1.1生物工程下游技術(shù)的特點(diǎn)難度大：①原料液中目標(biāo)成分的含量較低②原料液是復(fù)雜的多相體系③目標(biāo)成分的穩(wěn)定性較差④要求產(chǎn)品的純度很高。第4頁/共66頁成本高：分離過程往往是步驟繁瑣，處理時間長，收率低并且重復(fù)性差，一般情況下，在生物工程產(chǎn)品的成本構(gòu)成中，分離純化部分的成本約占總成本的50%以上。第5頁/共66頁1.2下游工程的基本路線整個分離路線一般可分為以下五個主要步驟：預(yù)處理、固液分離、初步純化、精細(xì)純化、成品加工。第6頁/共66頁預(yù)處理：采用加熱、調(diào)整pH、絮凝等措施和單元操作改變發(fā)酵液的理化性質(zhì)，為固液分離作準(zhǔn)備。固液分離：采用珠磨、勻漿、酶溶、過濾、離心等單元操作除去固相，獲得包含目的產(chǎn)物的液相，供進(jìn)一步分離純化用。初步純化：采用萃取、吸附、沉淀、離心等單元操作，將目的成分與大部分雜質(zhì)分離開來。精細(xì)純化：采用層析、電泳、分子蒸餾等單元操作，將目的成分與雜質(zhì)進(jìn)一步分離，使產(chǎn)物達(dá)到預(yù)期標(biāo)準(zhǔn)。成品加工：采用結(jié)晶、濃縮、干燥等單元操作，將目的產(chǎn)物加工成適應(yīng)市場需要的商品。第7頁/共66頁目的產(chǎn)物提取與精制過程的一般工藝流程第8頁/共66頁內(nèi)容一、概述二、原料與預(yù)處理三、固液分離和細(xì)胞破碎四、初步純化五、精細(xì)純化六、成品加工第9頁/共66頁二、原料與預(yù)處理目前發(fā)酵液仍是下游工程的主要原料。發(fā)酵液的特性：①發(fā)酵產(chǎn)物濃度低，處理體積大。②微生物細(xì)胞的顆粒小，相對密度與液相相差不大。③細(xì)胞含水量大，可壓縮性大，一經(jīng)壓縮就會變形。④液相黏度大，容易吸附在濾布上。⑤產(chǎn)物性質(zhì)不穩(wěn)定。第10頁/共66頁發(fā)酵液的預(yù)處理加熱升溫法

凝聚與絮凝調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH第11頁/共66頁2.1加熱升溫法

原理：升高溫度可以有效降低液體黏度，提高過濾效率。注意事項：①加熱溫度和時間必須控制在不影響目的產(chǎn)物活性的范圍內(nèi)。②防止加熱導(dǎo)致的細(xì)胞溶解，胞內(nèi)物質(zhì)外溢，增加發(fā)酵液的復(fù)雜性和隨后的產(chǎn)物分離純化。第12頁/共66頁2.2凝聚與絮凝原理：有效地改變菌體細(xì)胞和蛋白質(zhì)等膠體粒子的分散狀態(tài)，使其凝聚成較大的顆粒，便于過濾。適用于菌體細(xì)小且黏度大的發(fā)酵液的預(yù)處理。凝聚：在中性鹽的作用下，由于膠體粒子之間雙電子層排斥電位的降低，而使膠體體系不穩(wěn)定出現(xiàn)聚集的現(xiàn)象。絮凝：是指在某些高分子絮凝劑存在的情況下，基于架橋作用，使膠粒形成絮凝團(tuán)的過程。第13頁/共66頁2.3調(diào)節(jié)發(fā)酵液pHpH直接影響發(fā)酵液中某些物質(zhì)的電離度和電荷性質(zhì)。對于氨基酸、蛋白質(zhì)等兩性物質(zhì)，在等電點(diǎn)下，溶解度最小，因此可利用此特性分離或除去兩性物質(zhì)。由于大多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)都在酸性范圍內(nèi)（pH4.0-5.5），利用酸性試劑來調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH使之達(dá)到等電點(diǎn)，可除去蛋白質(zhì)等兩性物質(zhì)。細(xì)胞、細(xì)胞碎片以及某些膠體物質(zhì)在某個pH下也可能趨于絮凝而成為較大顆粒，有利于過濾。第14頁/共66頁內(nèi)容一、概述二、原料與預(yù)處理三、固液分離和細(xì)胞破碎四、初步純化五、精細(xì)純化六、成品加工第15頁/共66頁三、固液分離和細(xì)胞破碎3.1固液分離發(fā)酵液或多或少存在懸浮固體，需要使用固液分離手段使清液和固態(tài)物質(zhì)得到很好的分離。常用的方法是過濾和離心分離。第16頁/共66頁3.1.1離心分離離心分離是在離心產(chǎn)生的重力場作用下使懸浮顆粒沉降下來的操作過程。需要根據(jù)發(fā)酵液的特性來選擇離心機(jī)。根據(jù)固體顆粒的大小選擇離心機(jī)第17頁/共66頁3.1.2過濾分離過濾：指在壓力（或真空）的情況下將懸浮液通過過濾介質(zhì)以達(dá)到固液分離的目的。應(yīng)用較廣的過濾設(shè)備有壓力過濾、真空過濾和錯流過濾三種。第18頁/共66頁3.1.2.1壓力過濾最常見的壓力過濾裝置是板框過濾機(jī)。它的過濾介質(zhì)為濾布，當(dāng)懸浮液通過濾布時，固體顆粒被濾布阻隔而形成濾餅，濾餅達(dá)到一定厚度時起過濾作用，壓力來自于液壓泵。與其他設(shè)備相比，它的優(yōu)點(diǎn)是：結(jié)構(gòu)簡單，過濾面積大；過濾的推動力（壓力差）能大幅度調(diào)整，并能耐受較高的壓力差，因而固相含水分低，并能適應(yīng)不同過濾特性的發(fā)酵液的過濾；輔助設(shè)備少、價格低、動力消耗少。主要缺點(diǎn)是：設(shè)備苯重、間歇操作、勞動強(qiáng)度大、輔助時間多、生產(chǎn)效率低。第19頁/共66頁3.1.2.2真空過濾最常見的真空過濾是真空轉(zhuǎn)鼓過濾機(jī)。工作部件是一個饒著水平軸轉(zhuǎn)動的鼓，在轉(zhuǎn)鼓內(nèi)維持一定的真空度，施加于轉(zhuǎn)鼓外邊的大氣壓力即為過濾的推動力。真空轉(zhuǎn)鼓過濾機(jī)工作原理示意圖第20頁/共66頁3.1.2.3錯流過濾切向流過濾又稱錯流過濾，是一種維持恒壓下高速過濾的技術(shù)。其操作特點(diǎn)是使懸俘液在過濾介質(zhì)表面作切向流動，利用流動的剪切作用將過濾介質(zhì)表面的固體（濾餅）移走。當(dāng)移走固體的速率與固體的沉積速率相等時，過濾速率就近似恒定。目前切向流過濾的主要缺點(diǎn)是：切向流所產(chǎn)生的剪切作用可使蛋白質(zhì)產(chǎn)物失活。第21頁/共66頁3.2細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎技術(shù)：是指利用外力破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)物釋放出來的技術(shù)。第22頁/共66頁3.2.1常用的細(xì)胞破碎方法按照作用方式的不同劃分，常用的細(xì)胞破碎方法可以分為兩類：機(jī)械類包括高速珠磨破碎法、高壓勻漿破碎法、超聲波破碎法等，非機(jī)械類包括化學(xué)滲透法，酶溶破碎法等。第23頁/共66頁3.2.1.1高速珠磨法原理：微生物細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的研磨劑（通常是直徑<1mm的無鉛玻璃珠）在攪拌漿的作用下充分混合、珠子之間以及珠子和細(xì)胞之間的相互剪切、碰撞促進(jìn)細(xì)胞壁破裂，釋放出內(nèi)含物。在珠液分離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)，漿液流出，從而實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作。破碎中產(chǎn)生的熱量由夾套中的冷卻液帶走。主要缺點(diǎn)：溫度升高較多，對熱敏感的成分易失活，細(xì)胞碎片較小，清除碎片困難，給后續(xù)操作增加難度。第24頁/共66頁3.2.1.2高壓勻漿破碎法原理：高壓勻漿法所用設(shè)備是高壓勻漿器，它由高壓泵和勻漿閥組成。細(xì)胞在一系列過程中經(jīng)歷了高速造成的剪切、碰撞以及由高壓到常壓的變化，從而造成細(xì)胞的破碎。其實(shí)質(zhì)是將細(xì)胞壁和膜撕裂，靠胞內(nèi)的滲透壓使其內(nèi)含物全部釋放出來。除了較易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌以及較小的革蘭氏陽性菌不適于用高壓勻漿器處理外，其他微生物細(xì)胞都可以用高壓勻漿法破碎。高壓勻漿法破碎微生物細(xì)胞速度快，胞內(nèi)產(chǎn)物損失小，設(shè)備容易放大。第25頁/共66頁3.2.1.3超聲破碎原理：超聲波細(xì)胞破碎儀由超聲波發(fā)生器和換能器兩大部分組成。超聲波發(fā)生器將50Hz、220V電流變成20kHz電能供給換能器。換能器隨之做縱向機(jī)械振動。振動波通過浸入在生物溶液中的鈦合金變幅桿產(chǎn)生空化效應(yīng)，激發(fā)介質(zhì)里的生物顆粒劇烈振動，引起的沖擊波和剪切力使細(xì)胞破碎。超聲波破碎法操作簡便，可連續(xù)操作，最適合實(shí)驗室規(guī)模的細(xì)胞破碎。超聲振蕩會使懸浮液溫度升高，因而使用受到限制。第26頁/共66頁3.2.1.4生物酶溶法主要是利用生物酶將細(xì)胞壁和細(xì)胞膜消化溶解的方法。常用的溶酶有溶菌酶、蛋白酶、幾丁質(zhì)酶等，細(xì)胞壁溶解酶是幾種酶的復(fù)合物。溶酶同其他酶一樣具有高度的專一性，蛋白酶只能水解蛋白質(zhì)，葡聚糖酶只對葡聚糖起作用，因此利用溶酶系統(tǒng)處理細(xì)胞必須根據(jù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成選擇適當(dāng)?shù)拿?，并確定相應(yīng)的使用次序。自溶是一種特殊的酶溶方式。控制條件（溫度、pH、添加激活劑等）可以增強(qiáng)系統(tǒng)自身的溶酶活性，使細(xì)胞壁自發(fā)地溶解。第27頁/共66頁3.2.2包含體的處理包含體基本上是由蛋白質(zhì)構(gòu)成，其中大部分（50%以上）是克隆表達(dá)的產(chǎn)物，這些產(chǎn)物在一級結(jié)構(gòu)上正確的，但在立體構(gòu)型上卻是錯誤的，因此沒有生物學(xué)活性。要分離出具有活性的蛋白質(zhì)，一般要經(jīng)歷下列步驟：破碎細(xì)胞→分離出包含體→溶解包含體→目標(biāo)產(chǎn)物的構(gòu)型復(fù)原。第28頁/共66頁①包含體的分離用溶菌酶或超聲波法處理基因工程菌，破碎細(xì)胞，離心取沉淀，得包含體。再用蔗糖溶液、尿素緩沖液或溫和的表面活性劑沖洗包含體，清除附在包含體上的雜蛋白、DNA、RNA和酶，得到較純的包含體。②包含體的溶解用弱變性劑尿素和表面活性劑十二烷基磺酸鈉溶解包含體，使蛋白質(zhì)肽鏈分離。加入還原劑二巰基蘇糖醇或GSH，使二硫鍵可逆地斷裂。此時重組蛋白呈現(xiàn)可溶解和單體肽鏈的狀態(tài)。③蛋白質(zhì)的復(fù)性變性蛋白經(jīng)初步純化濃縮以后，透析除去變性劑和還原劑。大部分蛋白質(zhì)即重新折疊，被空氣中的氧氧化，重建二硫鍵，恢復(fù)活性。第29頁/共66頁內(nèi)容一、概述二、原料與預(yù)處理三、固液分離和細(xì)胞破碎四、初步純化五、精細(xì)純化六、成品加工第30頁/共66頁四、初步純化目的：把目的產(chǎn)物與大部分雜質(zhì)分離開來，使雜質(zhì)數(shù)量低于目的產(chǎn)物的數(shù)量。初步純化的單元操作有萃取、吸附、沉淀、膜分離等。第31頁/共66頁4.1萃取萃取是利用溶質(zhì)在互不相溶的兩相溶劑之間分配系數(shù)的不同而使得溶質(zhì)得到純化或濃縮的方法。在萃取操作中至少有一相為流體，一般稱該流體為萃取劑。以液體為萃取劑時，如果含有目標(biāo)產(chǎn)物的原料也為液體，則稱此操作為液液萃??；如果含有目標(biāo)產(chǎn)物的原料為固體，則稱此操作為液固萃取或浸取。在液液萃取中，根據(jù)萃取劑的種類和形式的不同又分為有機(jī)溶劑萃?。ê喎Q溶劑萃?。?、雙水相萃取和反膠團(tuán)萃取等。第32頁/共66頁4.1.1溶劑萃取溶劑萃取是把目標(biāo)物質(zhì)從第一個液相中依靠更強(qiáng)大的溶解力抽提到第二個液相中。溶劑萃取的關(guān)鍵是萃取溶劑的選擇，而選擇的依據(jù)是“相似相溶”的原則。即分子結(jié)構(gòu)相似和分子間相互作用力相似。在生物工業(yè)上，對后一點(diǎn)考察較多的是分子極性。萃取操作流程可分為單級萃取和多級萃取。單級萃取即使用一個混合器和一個分離器的萃取操作。單級萃取的流程最簡單，但因只萃取一次，一般萃取收率不高，特別是分配系數(shù)不是特別高時。為提高收率常常采用多級萃取。多級萃取中又有多級錯流蘋取和多級逆流萃取之分。第33頁/共66頁4.1.2超臨界二氧化碳流體萃取基本原理：較低溫度下，不斷增加氣體壓力時，氣體會轉(zhuǎn)化成液體，當(dāng)溫度增高時，液體的體積增大。對于某一特定的物質(zhì)而言，總存在一個臨界溫度(Tc)和臨界壓力(Pc)，高于臨界溫度和臨界壓力后，物質(zhì)不會成為液體或氣體，這一點(diǎn)就是臨界點(diǎn)。在臨界點(diǎn)以上的范圍內(nèi)，物質(zhì)狀態(tài)處于氣體和液體之間，這個范圍之內(nèi)的流體成為超臨界流體（SF）。超臨界流體具有類似氣體的較強(qiáng)穿透力和類似于液體的較大密度和溶解度，具有良好的溶劑特性，對許多物質(zhì)有很強(qiáng)的溶解能力，可作為溶劑進(jìn)行萃取。超臨界流體對物質(zhì)進(jìn)行溶解和分離的過程就叫超臨界流體萃?。⊿FE）?？勺鳛镾F的物質(zhì)很多，如二氧化碳、乙烷、氨等，其中多選用CO2。因為CO2臨界溫度接近室溫，且無色、無毒、無味、不易燃、化學(xué)惰性、價廉、易制成高純度氣體，因此特別適合天然產(chǎn)物有效成分的提取，對于天然物料的萃取，其產(chǎn)品真正稱得上是100%純天然的“綠色產(chǎn)品”。第34頁/共66頁超臨界流體萃取分離過程的原理：在超臨界狀態(tài)下，超臨界流體具有很好的流動性和滲透性，將超臨界流體與待分離的物質(zhì)接觸，使其有選擇性地把極性大小、沸點(diǎn)高低和分子量大小的成分依次萃取出來。當(dāng)然，對應(yīng)各壓力范圍所得到的萃取物不可能是單一的，但可以控制條件得到最佳比例的混合成分，然后借助減壓、升溫的方法使超臨界流體變成普通氣體，被萃取物質(zhì)則完全或基本析出，從而達(dá)到分離提純的目的，所以在超臨界流體萃取過程是由萃取和分離組合而成的。第35頁/共66頁超臨界二氧化碳流體萃取裝置第36頁/共66頁4.1.3雙水相萃取某些親水性高分子聚合物的水溶液超過一定濃度后可形成兩相，并且在兩相中水分均占很大比例，即形成雙水相系統(tǒng)。利用親水性高分子聚合物水溶液的雙水相性質(zhì)進(jìn)行物質(zhì)分離的方法稱雙水相萃取技術(shù)。聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dx）是雙水相萃取中常用的雙聚合物系統(tǒng)，該雙水相的上相富含PEG，下相富含Dx。雙水相萃取最大的優(yōu)勢在于雙水相體系可為生物活性物質(zhì)提供一個溫和的活性環(huán)境，因而可在萃取過程中保持生物物質(zhì)的活性及構(gòu)象。尤其適用于直接從含有菌體等雜質(zhì)的混合物中提純目標(biāo)蛋白（如酶、抗體等）。第37頁/共66頁4.1.4反膠團(tuán)萃取反膠團(tuán)的構(gòu)造表面活性劑在水溶液中所形成的聚集體，親水性的極性端向外指向水溶液，疏水性的非極性“尾”向內(nèi)相互聚集在一起。表面活性劑在非極性溶劑中所形成的聚集體，疏水性的非極性尾部向外，指向非極性溶劑，而極性頭向內(nèi)。由于與在水相中形成的微膠團(tuán)方向相反，因而稱之為反膠團(tuán)。第38頁/共66頁反膠團(tuán)萃取原理是從主體水相向溶解于有機(jī)溶劑相中納米級的、均一且穩(wěn)定的、分散的反膠團(tuán)微水相中的分配萃取?？僧?dāng)作“液膜”分離操作的一種。其特點(diǎn)是表面活性劑能不斷包圍水相中的蛋白質(zhì)，形成反膠團(tuán)，并引導(dǎo)入有機(jī)相中，完成對蛋白質(zhì)的萃取和分離。在反膠團(tuán)中蛋白質(zhì)不與有機(jī)溶劑直接接觸，而是通過水化層與表面活性劑的極性頭接觸，從而避免了蛋白質(zhì)的變性、失活。蛋白質(zhì)向反膠團(tuán)溶解的水殼模型第39頁/共66頁反膠團(tuán)萃取中常用的表面活性劑有AOT、CTAB、TOMAC、PTEA，其中以AOT最為常用。AOT具有雙鏈，形成反膠團(tuán)時無需添加輔助表面活性劑且有較好的強(qiáng)度；它的極性基團(tuán)較小，所形成的反膠團(tuán)空間較大，有利于生物大分子進(jìn)人。常用于反膠團(tuán)萃取系統(tǒng)的有機(jī)溶劑有環(huán)已烷、辛烷、異辛烷等。反膠團(tuán)萃取不能用于萃取相對分子量較大的蛋白質(zhì)如牛血清蛋白，最適宜于萃取相對分子量較小或中等的蛋白質(zhì)如-糜蛋白。在使用陰離子表面活性劑時，在萃取前應(yīng)調(diào)節(jié)水相的pH值比目標(biāo)蛋白等電點(diǎn)pI值低2-4個單位，以增加蛋白質(zhì)分子的表面電荷，提高萃取效率。在使用陽離子表面活性劑時，應(yīng)調(diào)節(jié)水相的pH值高于蛋白質(zhì)的pI值，使蛋白質(zhì)凈電荷為負(fù)值。第40頁/共66頁4.2吸附吸附作用是物體表面的一個重要物理性質(zhì)，理論上講，任何兩相都可以形成界面，其中一相的物質(zhì)在另一相的表面發(fā)生密集行為，稱為吸附。通過吸附作用從液體或氣體中提取回收有用目標(biāo)產(chǎn)物的分離方法稱為吸附分離法。凡是能夠?qū)⒅車渌肿泳奂侥骋晃镔|(zhì)表面上的物質(zhì)，就稱為吸附介質(zhì)。第41頁/共66頁4.2.1普通吸附劑吸附普通吸附劑有活性炭、氧化鋁、硅藻土等?；钚蕴窟@是常用的一種吸附介質(zhì)，活性炭能對化合物產(chǎn)生吸附力主要是活性炭分子中的活性基團(tuán)（如羥基等）與被分離物質(zhì)分子中的某些基團(tuán)產(chǎn)生范德華力形成的吸附作用?；钚蕴吭谒嵝匀芤褐形搅^強(qiáng)，因此吸附前應(yīng)調(diào)節(jié)水相pH值在5左右。氧化鋁氧化鋁是一種呈化學(xué)惰性且具有較高的吸附容量的吸附劑，主要是用于分離非極性化合物。吸附原理一般認(rèn)為是被分離的物質(zhì)與氧化鋁表面的一些羥基相互作用形成氫鍵，而鋁原子提供一個親電子中心，吸引電子供體的某些基團(tuán)，如-OH、-NH2等。氧化鋁的優(yōu)點(diǎn)是吸附容量大，分離效果好，尤其對于脂溶性的天然小分子，如醛、酮、醌類化合物的分離效果好，應(yīng)用廣泛，價格低廉。第42頁/共66頁4.2.2離子交換吸附離子交換吸附是基于離子交換劑上可電離的離子與溶液中具有相同電荷的溶質(zhì)離子進(jìn)行可逆交換，借助離子交換劑上電荷基團(tuán)對溶液中離子或離子化合物的吸附作用進(jìn)行。離子交換樹脂是一種不溶于酸、堿和有機(jī)溶劑的固態(tài)高分子化合物，它的化學(xué)穩(wěn)定性良好，且具有離子交換能力。其巨大的分子可以分成兩部分，即樹脂的骨架和活性離子，它在樹脂骨架中的進(jìn)進(jìn)出出就發(fā)生離子交換現(xiàn)象。高分子的惰性骨架和單分子的活性離子，帶有相反的電荷，而共處于離子交換樹脂中。第43頁/共66頁離子交換吸附的操作（1）離子交換劑的處理

加水浸泡，待充分膨脹后即可進(jìn)行處理。常規(guī)的處理步驟是：加過量的水懸浮除去細(xì)顆粒，再改用酸堿浸泡，以便除去雜質(zhì)并使其帶上需要的反離子。酸堿處理的次序決定了離子交換劑攜帶反離子的類型。在每次用酸（或堿）處理后，均應(yīng)先用水洗滌至近中性，再用堿（或酸）處理。最后用水洗滌至中性，經(jīng)緩沖液平衡后即可使用或裝柱。（2）分離物質(zhì)的交換

使用離子交換劑的方法有兩種：一是柱色譜法，也叫動態(tài)法，即將離子交換劑裝入色譜柱內(nèi)，讓溶液連續(xù)通過。該法交換效率高，應(yīng)用范圍廣。另一種是分批法，也叫靜態(tài)法，即使離子交換劑置入盛溶液的容器內(nèi)不斷緩慢攪拌。該法交換率低，不能連續(xù)進(jìn)行，但需要的設(shè)備簡單，操作容易。（3）物質(zhì)的洗脫與收集

洗脫條件和吸附條件相反，在酸性條件下吸附的在堿性條件下洗。（4）離子交換劑的再生

使用過的離子交換劑，可采用一定的方法令其恢復(fù)原來的性狀，這一過程叫做再生。再生可以通過上述的酸、堿反復(fù)處理完成。第44頁/共66頁4.3沉淀沉淀是物理環(huán)境的變化引起溶質(zhì)的溶解度降低，生成固體凝聚物的過程。沉淀分離方法有多種，如鹽析沉淀法、有機(jī)溶劑沉淀法、等電點(diǎn)沉淀法等。第45頁/共66頁4.3.1鹽析沉淀法鹽析沉淀是根據(jù)各種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)差異性來改變?nèi)芤旱哪承┬再|(zhì)，進(jìn)而導(dǎo)致目標(biāo)蛋白質(zhì)的溶解度發(fā)生變化。在溶液中加入中性鹽，利用鹽離子與蛋白質(zhì)分子表面的帶相反電荷的極性基團(tuán)的互相吸引作用，中和蛋白質(zhì)分子表面的電荷，降低蛋白質(zhì)分子與水分子之間的相互作用，蛋白質(zhì)分子表面的水化膜逐漸被破壞。當(dāng)鹽濃度達(dá)到一定的濃度時，蛋白質(zhì)分子之間的排斥力降到很小，于是它們很容易相互聚集，溶解度就會降到很低，形成沉淀顆粒，從溶液中析出。工業(yè)上常用的中性鹽是硫酸銨，它的優(yōu)點(diǎn)是溫度系數(shù)小而溶解度大。第46頁/共66頁4.3.2有機(jī)溶劑沉淀有機(jī)溶劑能降低蛋白質(zhì)溶解度的原因主要是一方面與鹽溶液一樣具有脫水作用，其次有機(jī)溶劑的介電常數(shù)比水小，導(dǎo)致溶劑的極性減小。常用的有機(jī)溶劑是甲醇、乙醇和丙酮。有機(jī)溶劑沉淀法的優(yōu)點(diǎn)是溶劑溶液蒸發(fā)除去，不會殘留在成品中，而且有機(jī)溶劑密度低，與沉淀物密度差大，便于離心分離。該方法的缺點(diǎn)是易使蛋白質(zhì)變性失活，且有機(jī)溶劑易燃易爆，安全要求高。第47頁/共66頁在實(shí)際操作時，還應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：1）降低操作溫度能增加收率和減少蛋白質(zhì)的變性。2）所選擇的溶劑必須能與水互溶，而和蛋白質(zhì)不起化學(xué)反應(yīng)。3）蛋白質(zhì)的分子量越大，產(chǎn)生沉淀所需加入的有機(jī)溶劑量越少。4）沉淀的蛋白質(zhì)不能再溶解，就可能已經(jīng)變性。5）一般認(rèn)為離子強(qiáng)度在0.05或稍低為最好，既能有一定的沉淀速度，又能對蛋白質(zhì)起保護(hù)作用，防止變性。所以，由鹽析法制得的粗蛋白質(zhì)，用有機(jī)溶劑沉淀法進(jìn)一步精制時，先必須經(jīng)過透析。第48頁/共66頁4.4膜分離膜分離技術(shù)是指利用天然或人工合成的無機(jī)或有機(jī)薄膜,以外界能量或化學(xué)位差為推動力,對雙組分或多組分溶質(zhì)和溶劑進(jìn)行分離、分級、提純和富集的方法。膜分離技術(shù)是人類最早應(yīng)用的分離技術(shù)之一，根據(jù)膜的孔徑大小可細(xì)分為透析、微濾、超濾、納濾、反滲透五種。第49頁/共66頁透析分離透析膜一般是孔徑為5-10nm的親水膜，例如纖維素膜、聚酰胺膜等。一般制成管狀透析袋使用，將含有高分子溶質(zhì)的料液裝入透析袋中，封口后浸入到純水或緩沖液中，由于透析膜內(nèi)外的溶質(zhì)濃度不同，在濃度差的作用下，透析袋內(nèi)的小分子溶質(zhì)（如無機(jī)鹽）透向膜外，透析袋外部的水透向袋內(nèi)，這就是透析。溶質(zhì)以擴(kuò)散的形式移動。在生物分離方面，主要用于生物大分子溶液的脫鹽。透析過程以濃度差為傳質(zhì)推動力，膜的透過通量很小，因此不適于大規(guī)模生物分離過程，僅在實(shí)驗室中應(yīng)用較多。第50頁/共66頁內(nèi)容一、概述二、原料與預(yù)處理三、固液分離和細(xì)胞破碎四、初步純化五、精細(xì)純化六、成品加工第51頁/共66頁五、精細(xì)純化采用一些特殊的高新技術(shù)進(jìn)一步把雜質(zhì)與目的產(chǎn)物分離開來，包括層析、電泳、分子蒸餾等。第52頁/共66頁5.1層析層析技術(shù)又叫色譜分離技術(shù)。常見有紙層析、薄層層析、柱層析等。紙層析和薄層層析操作簡便，分辨率高，但分離量太少，主要用于定性和定量分析。柱層析進(jìn)樣量大，回收容易，可用于分離純化。第53頁/共66頁5.1.1凝膠層析凝膠層析是利用生物大分子的分子量差異進(jìn)行的色譜分離的方法。凝膠色譜介質(zhì)主要是以葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺等為原料，通過特殊工藝合成的色譜介質(zhì)。目前已成為生物化工和生物制藥領(lǐng)域研究和生產(chǎn)中必不可少的分離介質(zhì)。第54頁/共66頁凝膠色譜基本原理凝膠色譜介質(zhì)是一種在球體內(nèi)部具有大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠微粒，可以把大小不同的生物大分子按一定的順序進(jìn)行分離，分子量大的生物分子由于不能進(jìn)入或不能完全進(jìn)入凝膠內(nèi)部的網(wǎng)狀孔，沿著凝膠顆粒間的空隙或大的網(wǎng)狀孔通過，大分子相對于小分子遷移的路徑近，在柱內(nèi)的停留時間短、保留值小，所以在色譜過程中遷移率最快，走在小分子的前面，先從色譜柱中流出。分子量小的分子由于能夠進(jìn)入凝膠內(nèi)部的網(wǎng)狀孔，沿著凝膠顆粒不同大小的網(wǎng)狀孔流過，相對于大分子的遷移路徑長，在柱內(nèi)的停留時間長、保留值大，所以，在色譜過程中遷移率最慢，走在大分子的后面，最后從柱中流出。樣品中分子量大小不同的各種分子在流過凝膠內(nèi)部的網(wǎng)狀孔時就受到凝膠介質(zhì)排阻效應(yīng)，也稱為分子篩效應(yīng)，將它們一個個分離，從而達(dá)到分離的目的。第55頁/共66頁5.2電泳原理是：蛋白質(zhì)分子是兩性大分子，在一定的pH緩沖液中，蛋白質(zhì)或帶正電，或帶負(fù)電，或在等電點(diǎn)不帶電。在電場作用下，帶正電荷的蛋白質(zhì)向負(fù)極移動，帶負(fù)電的蛋白質(zhì)向正極移動，處于等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)不移動。據(jù)此，可將兩性大分子分離開來。電泳技術(shù)有凝膠電泳、等電點(diǎn)聚焦電泳等。第56頁/共66頁5.3分子蒸餾原理：液體分子受熱會從液面逸出，而不同種類的分子在氣相中運(yùn)動的平均自由程不同來達(dá)到分離的目的。分子蒸餾的原理是根據(jù)分子運(yùn)動理論，液體混合物的分子受熱后運(yùn)動會加劇，當(dāng)接受到足夠能量時，就會從液面逸出而成為氣相分子。隨著液面上方氣相分子的增加，有一部分氣體就會返回液體。在外界條件保持恒定情況下，最終會達(dá)到分子運(yùn)動的動態(tài)平衡。分子運(yùn)動的平均自由程與分子的有效直徑的平方成反比。即分子有效直徑大的分子運(yùn)動的平均自由程短，分子有效直徑小的分子運(yùn)動的平均自由程大。此時如果在小分子能達(dá)到而大分子不能達(dá)到的距離上放一冷凝器，將小分子冷凝為液體，不斷從氣相中分離，平衡就被打破，液相混合物中的分子又會逸出成為氣相分子。只要時間足夠長，混合物就被分離提純了。第57頁/共66頁液體混合物沿加熱板自上而下流動，被加熱后能量足夠的分子逸出液面，輕分子的分子運(yùn)動平均自由程大

;重分子的分子運(yùn)動平均自由程小。如果在離液面距離小于輕分子運(yùn)動的平均自由程而大于重分子運(yùn)動的平均自由程處，設(shè)置一冷凝板，此時氣體中的輕分子能夠到達(dá)冷凝板，并不斷地被冷凝，從而破壞了體系中輕分子的動態(tài)平衡，而使混合液中的輕分子不斷逸出;相反，氣相中的重分子因不能到達(dá)冷凝板，很快與液相中的重分子趨于動態(tài)平衡，表觀上重分子不再從液相中逸出，這樣液體混合物便達(dá)到了分離的目的。下圖為分子蒸餾的原理示意圖，其主要結(jié)構(gòu)由加熱器、捕集器、高真空系統(tǒng)組成。液體混合物沿加熱板自上而下流動，被加熱后能量足夠的分子逸出液面，輕分子的分子運(yùn)動平均自由程大

;重分子的分子運(yùn)動平均自由程小。如果在離液面距離小于輕分子運(yùn)動的平均自由程而大于重分子運(yùn)動的平均自由程處，設(shè)置一冷凝板，此時氣體中的輕分子能夠到達(dá)冷凝板，并不斷地被冷凝，從而破壞了體系中輕分子的動態(tài)平衡，而使混合液中的輕分子不斷逸出;相反，氣相中的重分子因不能到達(dá)冷凝板，很快與液相中的重分子趨于動態(tài)平衡，表觀上重分子不再從液相中逸出，這樣液體混合物便達(dá)到了分離的目的。下圖為分子蒸餾的原理示意圖，其主要結(jié)構(gòu)由加熱器、捕集器、高真空系統(tǒng)組成。液體混合物沿加熱板自上而下流動，被加熱后能量足夠的分子逸出液面，輕分子的分子運(yùn)動平均自由程大

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