毛細(xì)管電泳和毛細(xì)管電色譜演示文稿

毛細(xì)管電泳和毛細(xì)管電色譜演示文稿目前一頁(yè)\總數(shù)三十三頁(yè)\編于十五點(diǎn)優(yōu)選毛細(xì)管電泳和毛細(xì)管電色譜目前二頁(yè)\總數(shù)三十三頁(yè)\編于十五點(diǎn)3.1．毛細(xì)管電泳和毛細(xì)管電色譜的基本理論．雙電層和Zeta電勢(shì)目前三頁(yè)\總數(shù)三十三頁(yè)\編于十五點(diǎn)．電泳

在電解質(zhì)溶液中，帶電粒子在電場(chǎng)作用下，以不同的速度或速率向其所帶電荷相反電場(chǎng)方向遷移的現(xiàn)象叫作電泳。陰離子向正極方向遷移，陽(yáng)離子向負(fù)極方向遷移，中性化合物不帶電荷，不發(fā)生電泳運(yùn)動(dòng)。在充滿(mǎn)自由溶液開(kāi)口管中球形粒子的電泳速率公式為：電泳淌度（μep)定義為單位場(chǎng)強(qiáng)下離子的平均電泳速率，即目前四頁(yè)\總數(shù)三十三頁(yè)\編于十五點(diǎn)．電滲流

電滲是毛細(xì)管中整體溶劑或介質(zhì)在軸向直流電場(chǎng)作用下發(fā)生的定向遷移或流動(dòng)。

電滲的產(chǎn)生和雙電層有關(guān)，當(dāng)在毛細(xì)管兩端施加高壓電場(chǎng)時(shí)，雙電層中溶劑化的陽(yáng)離子向陰極運(yùn)動(dòng)，通過(guò)碰撞作用帶動(dòng)溶劑分子一起向陰極移動(dòng)，形成電滲流(EOF)。度量電滲流大小是單位電場(chǎng)下的電滲流速率即電滲淌度(eo)或電滲速率(ueo)，可用Smoluchowski方程表示：目前五頁(yè)\總數(shù)三十三頁(yè)\編于十五點(diǎn)．電滲流

以電場(chǎng)力驅(qū)動(dòng)產(chǎn)生的溶液EOF，與高效液相色譜中由高壓泵產(chǎn)生的液體流型不同：電滲是CE的基本現(xiàn)象之一，它可以控制組分的遷移速率和方向，進(jìn)而影響CE的分離效率和重現(xiàn)性，所以電滲流控制是CE中的關(guān)鍵問(wèn)題或技術(shù)之一。目前六頁(yè)\總數(shù)三十三頁(yè)\編于十五點(diǎn)3.1.4.電滲流的控制影響電滲流的因素很多，直接影響因素有：1.電場(chǎng)強(qiáng)度2.溫度3.pH值4.緩沖液溶劑5.離子強(qiáng)度6.添加劑7.管壁涂層目前七頁(yè)\總數(shù)三十三頁(yè)\編于十五點(diǎn)3.1.5.分離原理

電泳和電滲流并存，在不考慮相互作用的前提下，粒子在毛細(xì)管內(nèi)電介質(zhì)中的遷移速率是兩種速率的矢量和：令μapp=μep+μeo，稱(chēng)之為表觀(guān)淌度，即從毛細(xì)管電泳測(cè)量中得到的淌度為粒子自身的電泳淌度和由電滲引起的淌度之和，并有在典型的毛細(xì)管電泳分離中，溶質(zhì)的分離基于溶質(zhì)間電泳速率的差異。電滲流的速率絕對(duì)值一般大于粒子的電泳速率，并有效地成為毛細(xì)管電泳的驅(qū)動(dòng)力。溶質(zhì)從毛細(xì)管的正極端進(jìn)樣，帶正電的粒子最先流出，中性粒子次之，帶負(fù)電的粒子在中性粒子之后流出。溶質(zhì)依次通過(guò)檢測(cè)器，得到與色譜圖極為相似的電泳分離圖譜。目前八頁(yè)\總數(shù)三十三頁(yè)\編于十五點(diǎn)3.1.5.分離原理

毛細(xì)管電色譜由于引入了色譜機(jī)制，其保留機(jī)理包括兩個(gè)方面:

其一，如同HPLC，基于溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)間分配過(guò)程；其二，如同CE，基于溶質(zhì)電遷移過(guò)程。CEC容量因子可用下式表示：由于CEC既能分離電中性溶質(zhì)，又能分離帶電溶質(zhì)，對(duì)復(fù)雜的混合樣品顯示出強(qiáng)大的分離潛力。目前九頁(yè)\總數(shù)三十三頁(yè)\編于十五點(diǎn)3.1.6.柱效和分離度

與色譜相同，CE和CEC的柱效一般也用塔板數(shù)N或塔板高度H來(lái)表示。實(shí)際應(yīng)用中，可根據(jù)以下公式計(jì)算：從理論上分析，CE分離的柱效可表示為

D為擴(kuò)散系數(shù)，樣品相對(duì)分子質(zhì)量越大，擴(kuò)散系數(shù)越小，柱效越高，所以毛細(xì)管電泳比色譜更適合于生物大分子分離分析。目前十頁(yè)\總數(shù)三十三頁(yè)\編于十五點(diǎn)3.1.6.柱效和分離度

類(lèi)似于HPLC，CEC的柱效可用vanDeemter方程表征：

作為一種重要的分離分析手段，CE和CEC仍沿用分離度R作為衡量分離程度的指標(biāo)，并定義如下：目前十一頁(yè)\總數(shù)三十三頁(yè)\編于十五點(diǎn)3.2.毛細(xì)管電泳和電色譜儀器裝置21.2.1.儀器基本結(jié)構(gòu)1高壓電源；2毛細(xì)管；3檢測(cè)器；4電極；5緩沖液瓶；6恒溫系統(tǒng)；7記錄儀目前十二頁(yè)\總數(shù)三十三頁(yè)\編于十五點(diǎn)3.2.2.進(jìn)樣系統(tǒng)

毛細(xì)管分離通道十分細(xì)小，整個(gè)柱體積一般只有4~5μL，所需的樣品區(qū)帶只有幾納升。毛細(xì)管電泳的進(jìn)樣方式一般是將毛細(xì)管的一端從緩沖液移出，放入試樣瓶中，使毛細(xì)管直接與樣品接觸，然后由重力、電場(chǎng)力或其他動(dòng)力來(lái)驅(qū)動(dòng)樣品流入管中。進(jìn)樣量可以通過(guò)控制驅(qū)動(dòng)力的大小或時(shí)間長(zhǎng)短來(lái)控制。CE進(jìn)樣技術(shù)均適用于CEC。目前有三種方法可以讓樣品直接進(jìn)入毛細(xì)管：電動(dòng)法、壓力法和濃差擴(kuò)散法。目前十三頁(yè)\總數(shù)三十三頁(yè)\編于十五點(diǎn)3.2.3.電源及其回路

電流回路系統(tǒng)包括高壓電源、電極、電極槽、導(dǎo)線(xiàn)和電解質(zhì)緩沖溶液等。CE和CEC一般采用0~±30kV連續(xù)可調(diào)的直流高壓電源。理想的電源應(yīng)具備：

1.能輸出單極直流高壓(一端接地)；

2.電壓、電流、功率輸出模式任意可選；

3.能控制電壓、電流或電功率的梯度；

4.電壓輸出精度應(yīng)高于1%。

CE的電極通常由直徑0.5~lmm的鉑絲制成。電極槽，即緩沖液瓶，通常是帶螺口的小玻璃瓶或塑料瓶(1~5mL不等)，要便于密封。緩沖液內(nèi)含電解質(zhì)，充于電極槽和毛細(xì)管中，通過(guò)電極、導(dǎo)線(xiàn)與電源連通，一同構(gòu)成整個(gè)電流回路。目前十四頁(yè)\總數(shù)三十三頁(yè)\編于十五點(diǎn)3.2.4.毛細(xì)管及其溫度控制

熔融石英毛細(xì)管在CE中應(yīng)用最廣泛，熔融石英拉制得到的毛細(xì)管很脆，易折斷，一般在外表面涂有聚酰亞胺保護(hù)層，使之變得富有彈性，不易折斷。內(nèi)徑越小，表面積/體積比越大，散熱效果越好。內(nèi)徑小，樣品負(fù)載小，檢測(cè)、進(jìn)樣、清洗等操作困難。一般使用的毛細(xì)管柱內(nèi)徑在25~100μm之間，目前最常用的是50μm和75μm兩種。檢測(cè)窗口部位的外涂層剝離。焦耳熱效應(yīng)產(chǎn)生徑向溫度梯度，還會(huì)導(dǎo)致分離重現(xiàn)性差。商品儀器大多有溫度控制系統(tǒng)，主要采用風(fēng)冷和液冷兩種方式。一般采用物理吸附或化學(xué)鍵合兩種方式形成毛細(xì)管內(nèi)壁涂層，對(duì)石英毛細(xì)管進(jìn)行改性或修飾，可有效控制電滲流、抑制吸附進(jìn)而優(yōu)化分離。

目前十五頁(yè)\總數(shù)三十三頁(yè)\編于十五點(diǎn)3.2.5.檢測(cè)系統(tǒng)目前十六頁(yè)\總數(shù)三十三頁(yè)\編于十五點(diǎn)3.2.5.檢測(cè)系統(tǒng)目前十七頁(yè)\總數(shù)三十三頁(yè)\編于十五點(diǎn)3.3.毛細(xì)管電泳分離模式及應(yīng)用3.3.1.毛細(xì)管區(qū)帶電泳（capillaryzoneelectrophoresis;CZE）3.3.1.1.基本操作條件毛細(xì)管區(qū)帶電泳也稱(chēng)為毛細(xì)管自由溶液區(qū)帶電泳，是毛細(xì)管電泳最基本、也是應(yīng)用最廣的一種操作模式。其分離原理是基于樣品組分荷質(zhì)比的差異。需要控制的操作變量主要是電壓、緩沖液濃度、pH值和添加劑等。緩沖液的選擇通常須遵循下述要求：

1．在所選擇的pH范圍內(nèi)有合適的緩沖容量。

2．本底檢測(cè)響應(yīng)低。

3．自身的淌度低，即離子大而荷電小。目前十八頁(yè)\總數(shù)三十三頁(yè)\編于十五點(diǎn)3.3.1.毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）

在CZE分離中，除了背景電解質(zhì)外，常常還在緩沖溶液中加入某些添加劑：

1.中性鹽

2.表面活性劑

3.手性添加劑

對(duì)于許多水難溶的樣品，如果在緩沖液中加入少量的有機(jī)溶劑，常常能有效改善分離度。在極端情況下，可完全使用有機(jī)溶劑，或以有機(jī)溶劑為主體，這就是非水毛細(xì)管電泳技術(shù)。圖21-6電滲流反向示意圖目前十九頁(yè)\總數(shù)三十三頁(yè)\編于十五點(diǎn)3.3.1.毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）3.3.1.2.應(yīng)用毛細(xì)管區(qū)帶電泳特別適合分離帶電化合物，包括無(wú)機(jī)陰離子、無(wú)機(jī)陽(yáng)離子、有機(jī)酸、胺類(lèi)化合物、氨基酸、蛋白質(zhì)等，不能分離中性化合物。毛細(xì)管區(qū)帶電泳3分鐘內(nèi)分離30種陰離子電泳圖

目前二十頁(yè)\總數(shù)三十三頁(yè)\編于十五點(diǎn)3.3.2.膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜（MEKC）MEKC是在電泳緩沖溶液中加入表面活性劑，當(dāng)溶液中表面活性劑濃度超過(guò)臨界膠束濃度時(shí)，表面活性劑分子之間的疏水基團(tuán)聚集在一起形成膠束，成為分離體系的準(zhǔn)固定相，溶質(zhì)基于在水相和膠束相之間的分配系數(shù)不同而得到分離。目前二十一頁(yè)\總數(shù)三十三頁(yè)\編于十五點(diǎn)3.3.2.膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜（MEKC）MEKC是在電泳緩沖溶液中加入表面活性劑，當(dāng)溶液中表面活性劑濃度超過(guò)臨界膠束濃度時(shí)，表面活性劑分子之間的疏水基團(tuán)聚集在一起形成膠束，成為分離體系的準(zhǔn)固定相，溶質(zhì)基于在水相和膠束相之間的分配系數(shù)不同而得到分離。

電泳流和電滲流的方向相反，且ν電滲流>ν電泳，負(fù)電膠束以較慢的速度向負(fù)極移動(dòng)；可用來(lái)分離中性物質(zhì)色譜與電泳分離模式的結(jié)合。目前二十二頁(yè)\總數(shù)三十三頁(yè)\編于十五點(diǎn)3.3.3.毛細(xì)管凝膠電泳（CGE）

毛細(xì)管凝膠電泳(capillarygelelectrophoresis;CGE)是在毛細(xì)管中充填多孔凝膠作為支持介質(zhì)進(jìn)行電泳，其分離是基于篩分機(jī)理。

CGE常用于蛋白質(zhì)，寡聚核苷酸、RNA及DNA片段的分離和測(cè)定。凝膠是毛細(xì)管電泳的理想介質(zhì)，粘度大，抗對(duì)流，能減少溶質(zhì)的擴(kuò)散，因此能限制譜帶的展寬，所得的峰型尖銳，柱效高，有可能使組分在短柱上實(shí)現(xiàn)極好的分離。常用的凝膠有聚丙烯酰胺和瓊脂糖，應(yīng)用最多的是前者。目前二十三頁(yè)\總數(shù)三十三頁(yè)\編于十五點(diǎn)3.3.4.毛細(xì)管等電聚焦（CIFF）

1.根據(jù)等電點(diǎn)差別分離生物大分子的高分辨率電泳技術(shù)；

2.毛細(xì)管內(nèi)充有兩性電解質(zhì)（合成的具有不同等電點(diǎn)范圍的脂肪族多胺基多羧酸混合物），當(dāng)施加直流電壓（6～8V）時(shí)，管內(nèi)將建立一個(gè)由陽(yáng)極到陰極逐步升高的pH梯度；

3.氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽等的所帶電荷與溶液pH有關(guān)，在酸性溶液中帶正電荷，反之帶負(fù)電荷。在其等電點(diǎn)時(shí)，呈電中性，淌度為零；目前二十四頁(yè)\總數(shù)三十三頁(yè)\編于十五點(diǎn)3.3.4.毛細(xì)管等電聚焦（CIFF）

1.根據(jù)等電點(diǎn)差別分離生物大分子的高分辨率電泳技術(shù)；

2.毛細(xì)管內(nèi)充有兩性電解質(zhì)（合成的具有不同等電點(diǎn)范圍的脂肪族多胺基多羧酸混合物），當(dāng)施加直流電壓（6～8V）時(shí)，管內(nèi)將建立一個(gè)由陽(yáng)極到陰極逐步升高的pH梯度；

3.氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽等的所帶電荷與溶液pH有關(guān)，在酸性溶液中帶正電荷，反之帶負(fù)電荷。在其等電點(diǎn)時(shí)，呈電中性，淌度為零；

4.聚焦：具有不同等電點(diǎn)的生物試樣在電場(chǎng)力的作用下遷移，分別到達(dá)滿(mǎn)足其等電點(diǎn)pH的位置時(shí)，呈電中性，停止移動(dòng)，形成窄溶質(zhì)帶而相互分離。目前二十五頁(yè)\總數(shù)三十三頁(yè)\編于十五點(diǎn)3.3.4.毛細(xì)管等電聚焦（CIFF）

1.根據(jù)等電點(diǎn)差別分離生物大分子的高分辨率電泳技術(shù)；

2.毛細(xì)管內(nèi)充有兩性電解質(zhì)（合成的具有不同等電點(diǎn)范圍的脂肪族多胺基多羧酸混合物），當(dāng)施加直流電壓（6～8V）時(shí)，管內(nèi)將建立一個(gè)由陽(yáng)極到陰極逐步升高的pH梯度；

3.氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽等的所帶電荷與溶液pH有關(guān)，在酸性溶液中帶正電荷，反之帶負(fù)電荷。在其等電點(diǎn)時(shí)，呈電中性，淌度為零；

4.聚焦：具有不同等電點(diǎn)的生物試樣在電場(chǎng)力的作用下遷移，分別到達(dá)滿(mǎn)足其等電點(diǎn)pH的位置時(shí)，呈電中性，停止移動(dòng)，形成窄溶質(zhì)帶而相互分離。目前二十六頁(yè)\總數(shù)三十三頁(yè)\編于十五點(diǎn)3.3.5.毛細(xì)管等速電泳（CITP）

1.將兩種淌度差別很大的緩沖液分別作為前導(dǎo)離子(充滿(mǎn)毛細(xì)管)和尾隨離子，試樣離子的淌度全部位于兩者之間，并以同一速度移動(dòng)。

2.負(fù)離子分析時(shí)，前導(dǎo)電解質(zhì)的淌度大于試樣中所有負(fù)離子的。所有試樣都按前導(dǎo)離子的速度等速向陽(yáng)極前進(jìn)，逐漸形成各自獨(dú)立的區(qū)帶而分離。陰極進(jìn)樣，陽(yáng)極檢測(cè)。

3.不同離子的淌度不同，所形成區(qū)帶的電場(chǎng)強(qiáng)度不同(ν=μE)，淌度大的離子區(qū)帶電場(chǎng)強(qiáng)度??；沿出口到進(jìn)口，將不同區(qū)帶依次排序1、2、3、4電場(chǎng)強(qiáng)度依次增大。假設(shè)“2”號(hào)中離子擴(kuò)散到“3”號(hào)，該區(qū)電場(chǎng)強(qiáng)度大，離子被加速，返回到“2”區(qū)；當(dāng)“2”號(hào)中離子跑到“1”號(hào)區(qū)，離子被減速使之歸隊(duì)；

4.特點(diǎn)：界面明顯，富集、濃縮作用；目前二十七頁(yè)\總數(shù)三十三頁(yè)\編于十五點(diǎn)3.4.毛細(xì)管電色譜柱技術(shù)

毛細(xì)管電色譜（CEC）是毛細(xì)管電泳與高效液相色譜的有機(jī)結(jié)合，其基本理論、儀器裝置與毛細(xì)管電泳大致類(lèi)似。最大的不同是毛細(xì)管柱引入了色譜固定相，使CEC同時(shí)具有CE與HPLC的分離機(jī)理，對(duì)中性物質(zhì)和荷電物質(zhì)都能達(dá)到理想的分離效果。因此毛細(xì)管柱是CEC的心臟，制柱技術(shù)是CEC的關(guān)鍵。按照固定相不同形式，CEC可分為填充柱、開(kāi)管柱和整體柱（連續(xù)床）。目前二十八頁(yè)\總數(shù)三十三頁(yè)\編于十五點(diǎn)3.4.1.填充柱

填充柱在CEC中應(yīng)用最廣泛，其最大優(yōu)點(diǎn)是可以利用眾多的HPLC固定相，根據(jù)化合物與固定相作用不同實(shí)現(xiàn)高效分離。1入口柱塞;2填充部分;3出口柱塞;4檢測(cè)窗口;5開(kāi)管部分目前二十九頁(yè)\總數(shù)三十三頁(yè)\編于十五點(diǎn)3.4.1.填充柱