酶工程知識點

酶的分離純化需要考慮的幾點：1、目標(biāo)酶分子特性及其他物理、化學(xué)性質(zhì)；2、酶分子和雜質(zhì)的主要性質(zhì)差異；3、酶的使用目的和要求；4、技術(shù)施舍的難易程度5、分離成本的高低；6、是否會造成環(huán)境污染。誘導(dǎo)作用：加入某些物質(zhì)使酶的生物合成開始或加速進(jìn)行的現(xiàn)象，稱為酶生物合成的誘導(dǎo)作用。無誘導(dǎo)物時，調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的阻遏蛋白與操縱基因的結(jié)合較強(qiáng)。由于RNA聚合酶的結(jié)合位點與阻遏蛋白的結(jié)合位點相互重疊，當(dāng)他們結(jié)合時，就把RNA聚合酶結(jié)合部位覆蓋起來，在空間上排擠RNA聚合酶，使之脫離啟動基因部位，使結(jié)構(gòu)基因無法進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，酶的生物合成受阻。（不能轉(zhuǎn)錄）阻遏現(xiàn)象：酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物或代謝途徑的末端產(chǎn)物使該酶的生物合成收到阻遏。在沒有阻遏物存在時，調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的阻遏蛋白與操縱基因的親和力弱，不能與操縱基因結(jié)合，所以RNA聚合酶可以結(jié)合到其在啟動基因的位點上，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，而合成結(jié)構(gòu)基因所對應(yīng)的酶。（能夠轉(zhuǎn)錄）當(dāng)環(huán)境中色氨酸濃度增加，阻遏物達(dá)到一定濃度時，阻遏蛋白與阻遏物結(jié)合，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而使阻遏蛋白與操縱基因的結(jié)合力增強(qiáng)。阻遏蛋白與操縱基因結(jié)合，就排擠RNA聚合酶與啟動基因的結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄無法進(jìn)行，酶的生物合成因此受到阻遏。酶生物合成的模式：同步合成型、延續(xù)合成型、中期合成型、滯后合成型同步合成型（生長偶聯(lián)型）：是酶的生物合成與細(xì)胞生長同步進(jìn)行的一種酶生物合成模式。特點：在細(xì)胞進(jìn)入生長期時，酶大量合成、不受阻遏作用。延續(xù)合成型（部分生長偶聯(lián)型）：是酶的生物合成在細(xì)胞的生長階段開始，在細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期后酶還可以合成一段時間的一種酶生物合成模式。特點：在細(xì)胞進(jìn)入平衡期還可以合成一段時間、受誘導(dǎo)物作用，不受阻遏物作用、mRNA相當(dāng)穩(wěn)定。中期合成型（生長偶聯(lián)型）：在細(xì)胞生長一段時間后才開始，而在細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期以后，酶的生物合成也隨之停止。特點：酶的生物合成受到產(chǎn)物的反饋阻遏作用或分解代謝物阻遏作用，而酶所對應(yīng)的mRNA穩(wěn)定性差。滯后合成型（非生長偶聯(lián)型）：酶是在細(xì)胞生長一段時間或者進(jìn)入平衡期以后才開始其生物合成大量積累。特點：受到培養(yǎng)基中存在的阻遏物的阻遏作用、mRNA穩(wěn)定性好。酶所對應(yīng)的mRNA穩(wěn)定性以及培養(yǎng)基中的阻遏作用是影響酶的生物合成的主要因素。在酶的發(fā)酵生產(chǎn)中，最理想的合成模式是延續(xù)合成型。其中對于同步合成型的酶，要盡量提高其對應(yīng)的mRNA的穩(wěn)定性，為此適當(dāng)降低發(fā)酵溫度是可取的措施；對于滯后合成型的酶，要設(shè)法降低培養(yǎng)基中阻遏物的濃度，盡量減少甚至解除產(chǎn)物阻遏或分解代謝物阻遏作用，使酶的生物合成提早開始；而對于中期型的酶，則要在提高mRNA的穩(wěn)定性以及解除阻遏，使其是生物合成的開始時間提前，并盡量延遲其生物合成停止時間。微生物保藏方法：斜面保藏法、沙土管保藏法、真空冷凍干燥保藏法、低溫保藏法、石蠟油保藏法。細(xì)胞活化：保藏的菌種在用于發(fā)酵生產(chǎn)之前，必須接種于新鮮的固體培養(yǎng)基上，在一定的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，使細(xì)胞的生命活性得以恢復(fù)。培養(yǎng)基：是指人工配制的用于細(xì)胞培養(yǎng)和發(fā)酵的各種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。擴(kuò)大培養(yǎng)注意事項：1、氮源豐富2、培養(yǎng)到對數(shù)生長期，及時培養(yǎng)到發(fā)酵罐中3、減少傳代次數(shù)，降低菌種衰退和污染的可能4、嚴(yán)格控制培養(yǎng)溫度、pH、溶氧量。耗氧速率Ko2：指的是單位體積培養(yǎng)液中的細(xì)胞在單位時間內(nèi)所消耗的氧氣量。Qo2：是指單位細(xì)胞量在單位時間內(nèi)的耗氧量。細(xì)胞呼吸強(qiáng)度Cc:指的是單位體積培養(yǎng)液中細(xì)胞的量。Ko2=Qo2·Cc溶氧速率Kd：是指單位體積的發(fā)酵液在單位時間內(nèi)溶解氧的量。調(diào)節(jié)溶解氧的方法：1、調(diào)節(jié)通氣量2、調(diào)節(jié)氧的分壓3、調(diào)節(jié)氣液接觸時間4、調(diào)節(jié)氣液接觸面積5、改變培養(yǎng)基的性質(zhì)提高酶產(chǎn)量的措施：1、添加誘導(dǎo)物2、控制阻遏物的濃度3、添加表面活性劑4、添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑5、基因突變提高酶產(chǎn)量固定化細(xì)胞：又稱為固定化活細(xì)胞或固定化增殖細(xì)胞，指采取各種方法固定在載體上，在一定的空間范圍進(jìn)行生長、繁殖和新陳代謝的細(xì)胞。固定化細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的特點：1、提高產(chǎn)酶率2、可以反復(fù)使用或連續(xù)使用較長時間3、基因工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定，不易丟失4、發(fā)酵穩(wěn)定性好5、縮短發(fā)酵周期，提高設(shè)備利用率6、產(chǎn)品容易分離純化7、適用于胞外酶等胞外產(chǎn)物的生產(chǎn)固定化細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝條件及控制：1、固定化細(xì)胞的培養(yǎng)2、溶解氧的供給3、溫度的控制4、培養(yǎng)基的組分控制固定化原生質(zhì)體的特點：1、變胞內(nèi)產(chǎn)物為胞外產(chǎn)物2、提高酶產(chǎn)率3、穩(wěn)定性好4、易于分離純化固定化原生質(zhì)體發(fā)酵產(chǎn)酶的工藝條件及其控制：1、滲透壓的控制2、防止細(xì)胞壁再生3、保證原生質(zhì)體的濃度端粒酶：是催化端粒合成和延長的酶，是一種核糖核蛋白，包含蛋白質(zhì)和RNA兩種基本成分。在合成端粒的過程中，端粒酶以其本身的RNA組分作為模板把端粒重復(fù)序列加到染色體DNA的末端，使端粒延長。端粒延伸主要包括三個步驟：1、結(jié)合：端粒酶分子的RNA重復(fù)序列與DNA端粒末端按照互補配對原則2、延伸：以端粒酶分子的RNA為模板，通過反轉(zhuǎn)錄作用，使DNA分子上的端粒延伸3、移位：端粒酶移動到延伸后的獨立末端。重復(fù)上述過程，反復(fù)進(jìn)行，使端粒不斷延伸?；驍U(kuò)增是通過增加基因數(shù)量來調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一種方式。它可以發(fā)生在個體發(fā)育的某一階段或在細(xì)胞分化的某一過程。增強(qiáng)子：又稱調(diào)變子，是一段能高效增強(qiáng)或促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列?？贵w酶：又稱為催化性抗體，是一類具有生物催化功能的抗體分子?？贵w酶的制取方法有誘導(dǎo)法和修飾法。修飾法是對抗體進(jìn)行分子修飾，在抗體與抗原的結(jié)合部位引進(jìn)催化基因而成為抗體酶的方法；誘導(dǎo)法是利用特定的抗原誘導(dǎo)抗體酶合成的方法。植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶的特點：1、提高產(chǎn)率2、縮短周期3、易于管理，減輕勞動強(qiáng)度4、提高產(chǎn)品質(zhì)量5、具有對剪切力敏感、生長周期長，許多植物細(xì)胞的生長和代謝需要一定的光照。植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶的工藝過程：1、外植體的選擇和處理2、植物細(xì)胞的獲?。ㄖ苯臃蛛x法—機(jī)械法和酶解法愈傷組織的誘導(dǎo)法原生質(zhì)再生法）3、細(xì)胞懸浮液培養(yǎng)4、分離純化植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶的工藝條件及其控制：培養(yǎng)基的配制控制：1、溫度的控制2、pH的控制3、溶解氧的調(diào)節(jié)控制4、光照的控制5、前提的添加6、刺激劑的應(yīng)用動物細(xì)胞培養(yǎng)具有如下特點：1、動物細(xì)胞培養(yǎng)主要用于各種功能蛋白質(zhì)和多肽的生產(chǎn)2、動物細(xì)胞的生長緩慢3、為了防止微生物污染，在培養(yǎng)過程中需要添加抗生素4、動物細(xì)胞體積大，無細(xì)胞壁保護(hù)，對剪切力敏感5、大多數(shù)細(xì)胞具有錨地依賴性，適宜采用貼壁培養(yǎng)6、動物細(xì)胞培養(yǎng)基成分復(fù)雜，一般要添加血清或其代用品7、原代細(xì)胞繼代培養(yǎng)50代后，即會退化死亡，需要重新分離細(xì)胞動物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶的工藝過程及其控制：1、懸浮培養(yǎng)2、貼壁培養(yǎng)3、固定化細(xì)胞培養(yǎng)、分離和純化4、培養(yǎng)基組成成分5、培養(yǎng)基的配制6、溫度的控制7、pH的控制8、滲透壓的控制9、溶解氧的控制細(xì)胞破碎法：1、機(jī)械破碎法2、物理破碎法3、化學(xué)破碎法4、酶促破碎法機(jī)械破碎法：搗碎發(fā)、研磨法、勻漿法原理：通過機(jī)械運動產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎物理破碎法：溫度差破碎法、壓力差破碎法、超聲波破碎法原理：通過各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎化學(xué)破碎法：添加有機(jī)溶劑、添加表面活性劑原理：通過各種化學(xué)試劑對細(xì)胞膜的作用，從而使細(xì)胞破碎酶促破碎法：自溶法、外加酶制劑法原理：通過細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，從而達(dá)到細(xì)胞破碎。酶的提?。菏侵冈谝欢ǖ臈l件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑或溶液中的過程，也稱酶的抽取。酶的主要提取方法：鹽溶液提取酸溶液提取堿溶液提取有機(jī)溶液提取鹽溶液提?。河糜谔崛≡诘蜐舛塞}溶液中溶解度較大的酶酸溶液提取：用于提取在稀酸溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶堿溶液提?。河糜谔崛≡谙A溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶有機(jī)溶液提?。河糜谔崛∧切┡c脂質(zhì)結(jié)合牢固或含有較多非極性基因的酶鹽溶：大多數(shù)蛋白類酶都溶于水，而且在低濃度的鹽存在的條件下，酶的溶解度隨濃度的升高而增加，這種現(xiàn)象叫鹽溶現(xiàn)象。鹽析：當(dāng)鹽濃度達(dá)到某一界限后，酶的溶解度隨鹽濃度升高而降低的現(xiàn)象，這稱為鹽析現(xiàn)象。沉淀分離法：鹽析沉淀法：利用不同蛋白質(zhì)在不同的特性，通過在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中洗出沉淀，從而使酶與雜質(zhì)分離。等電點沉淀法：利用兩性電解質(zhì)在等電點時溶解度最低，以及不同的兩性電解質(zhì)有不同的等電點這一特性，通過調(diào)節(jié)溶液的pH，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，使酶或雜質(zhì)分離。有機(jī)溶劑沉淀法：利用酶與其他雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同，通過添加一定量的某種有機(jī)溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離。復(fù)合沉淀法：在酶液中加入某些物質(zhì)，使它與酶形成復(fù)合物而沉淀下來，從而使酶與雜質(zhì)分離。選擇性變形沉淀：選擇一定條件使酶液中存在的某些雜質(zhì)變形而沉淀而不影響所需的酶，從而使酶與雜質(zhì)分離出來。過濾：借住過濾介質(zhì)將不同大小、不同形狀的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。非膜過濾：采用高分子膜以外的材料，如濾紙、濾布、纖維、多空陶瓷、燒結(jié)金屬等作為過濾介質(zhì)的分離技術(shù)稱為非膜過濾，包括粗濾和部分微濾。膜分離技術(shù)：借住一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、不同形狀和不同特性的物質(zhì)顆?；蚍肿舆M(jìn)行分離的技術(shù)稱為膜分離技術(shù)。在酶生產(chǎn)中的應(yīng)用：在酶分離純化過程中，可以除去酶液中含有的微生物細(xì)胞，還能達(dá)到酶液濃縮的目的，使用與酶制劑的生產(chǎn)，還可用于酶液的脫鹽。層析分離方法：吸附層析法：利用吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物種各組分分離分配層析法：利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同而使各組分分離離子交換層析：利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)對各種離子的親和力不同而達(dá)到分離目的凝膠層析：以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的相對分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離親和層析：利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，使生物分子分離純化層析聚焦：將酶等兩性物質(zhì)的等電點特性與離子交換層析的特性結(jié)合在一起，實現(xiàn)組分分離萃?。河袡C(jī)溶劑萃取、雙水相萃取、超臨界萃取、反膠束萃取有機(jī)溶劑萃?。河袡C(jī)溶劑萃取的兩相分別為水相和有機(jī)溶劑相，利用溶質(zhì)在水和溶劑中的溶解度不同而達(dá)到分離。雙水相萃取：雙水相萃取的兩相分別為互不相溶的兩個水相。利用溶質(zhì)在兩個互不相溶的水相中的溶解度不同而達(dá)到分離超臨界萃取：又稱為超臨界流體萃取，是利用欲分離物質(zhì)與雜質(zhì)在超臨界流體中的溶解度不同而達(dá)到分離的一種萃取技術(shù)反膠束萃?。豪梅茨z束將酶或其他蛋白質(zhì)從混合液中萃取出來的一種分離純化技術(shù)。結(jié)晶：鹽析結(jié)晶法、有機(jī)溶劑結(jié)晶法、透析平衡結(jié)晶法、等電點結(jié)晶法鹽析結(jié)晶法：在適當(dāng)?shù)臏囟群蚿H等條件下，于接近飽和的酶液中緩慢增加某種中性鹽的濃度，使酶的溶解度慢慢降低，到達(dá)稍微過飽和狀態(tài)，析出酶晶體的過程。有機(jī)溶劑結(jié)晶法：在接近飽和的酶液中慢慢加入某種有機(jī)溶劑，使酶的溶解度降低，析出酶晶體的過程。透析平衡結(jié)晶法：將酶液裝進(jìn)透析袋，對一定濃度的鹽溶液進(jìn)行透析，使酶液逐步達(dá)到過飽和狀態(tài)而析出晶體的過程。等電點結(jié)晶法：通過緩慢改變濃酶液的pH使之達(dá)到逐漸達(dá)到酶的等電點，從而使酶析出結(jié)晶的過程。干燥：真空干燥、冷凍干燥、噴霧干燥、氣流干燥、吸附干燥酶分子修飾：通過各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某種改變，從而改變酶的催化特性的技術(shù)過程。作用：通過酶分子修飾，可以使酶分子結(jié)構(gòu)發(fā)生某些合理的改變，就有可能提高酶的催化效率、增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性、降低或消除酶的抗原性、改變酶的底物專一性等。同時通過酶分子修飾，研究和了解酶分子中主鏈、側(cè)鏈、組成單位、金屬離子和各種物理因素對酶分子空間構(gòu)象的影響，可以進(jìn)一步探究其結(jié)構(gòu)和催化特性之間的關(guān)系。酶分子修飾：金屬離子置換修飾、大分子結(jié)合修飾、側(cè)鏈基團(tuán)修飾、肽鏈有限水解修飾、核苷酸鏈剪切修飾、氨基酸置換修飾、核苷酸置換修飾、物理修飾金屬離子置換修飾：把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶的催化特性發(fā)生改變的修飾方法。過程：1、酶的分離純化2、除去原有的金屬離子3、加入置換離子作用：1,、闡明金屬離子置換修飾的作用2、提高酶的催化效率3、增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性4、改變酶的動力學(xué)特性大分子結(jié)合修飾：采用水溶性大分子與酶的側(cè)鏈基團(tuán)共價結(jié)合，使酶分子的空間構(gòu)像發(fā)生改變，從而改變酶的催化特性的方法。作用：1、通過修飾提高酶的催化效率2、通過修飾可以增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性3、通過修飾降低或消除酶蛋白的抗原性肽鏈有限水解修飾：在肽鏈的限定位點進(jìn)行水解，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細(xì)的改變，從而改變酶的催化特性的方法。核苷酸鏈剪切修飾：在核苷酸的限定位點進(jìn)行剪切，使酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而改變酶的催化特性的方法。氨基酸置換修飾：將酶分子肽鏈上的某一個氨基酸置換成另一種氨基酸，從而改變酶的催化特性的修飾方法。作用：1、通過修飾可以提高酶的催化效率2、通過修飾可以增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性3、通過修飾可以使酶的專一性發(fā)生改變核苷酸置換修飾：將酶分子核苷酸上的某一個核苷酸置換成另一種核苷酸，從而改變酶的催化特性的修飾方法。物理修飾：通過各種物理方法使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生某些改變，從而改變酶的催化特