計(jì)數(shù)平板菌細(xì)胞技術(shù)

計(jì)數(shù)平板菌細(xì)胞技術(shù)第1頁(yè)，共17頁(yè)，2023年，2月20日，星期四三、實(shí)驗(yàn)原理(一)酵母菌大小的測(cè)定原理所有微生物的大小需要用刻有一定刻度的測(cè)微尺來(lái)測(cè)量，先用絕對(duì)長(zhǎng)度的物鏡測(cè)微尺來(lái)校正不表示絕對(duì)長(zhǎng)度的目鏡測(cè)微尺，計(jì)算后者每格所代表的實(shí)際長(zhǎng)度，然后放上待測(cè)的標(biāo)本，用目鏡測(cè)微尺測(cè)定標(biāo)本上微生物細(xì)胞占目鏡測(cè)微尺的格數(shù)，就可計(jì)算該微生物的大小。酵母菌的直徑約8-10μm。第2頁(yè)，共17頁(yè)，2023年，2月20日，星期四(二)酵母細(xì)胞計(jì)數(shù)原理微生物常用的計(jì)數(shù)方法有兩種，即直接計(jì)數(shù)法和間接計(jì)數(shù)法。前者利用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，能立即得到數(shù)值，但死活細(xì)胞都計(jì)數(shù)在內(nèi)。后者是在乎板上長(zhǎng)成菌落后再計(jì)數(shù)，反應(yīng)較真實(shí)，但費(fèi)時(shí)太長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)是利用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行直接計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)前需對(duì)樣品做適當(dāng)稀釋，按照規(guī)定方法及計(jì)算公式運(yùn)算后，即可得出實(shí)際數(shù)值。

第3頁(yè)，共17頁(yè)，2023年，2月20日，星期四四、操作方法(一)酵母菌大小測(cè)定的操作方法1.測(cè)微尺的構(gòu)造和使用方法(1)目鏡測(cè)微尺的構(gòu)造目鏡測(cè)微尺是一塊圓形玻片，其中央刻有精確的刻度，通常是將5mm劃分為50格，實(shí)際每格等于100μm。刻度的大小是隨使用的接目鏡和接物鏡的放大倍數(shù)而改變，用前必須用物鏡測(cè)微尺來(lái)標(biāo)定，如圖。(2)物鏡測(cè)微尺的構(gòu)造

物鏡測(cè)微尺為一塊特制的載玻片，其中央有一小圓圈。圓圈內(nèi)刻有分度，將長(zhǎng)1mm的直線等分為100小格，每小格等于10μm，如圖

。第4頁(yè)，共17頁(yè)，2023年，2月20日，星期四2.目鏡測(cè)微尺的標(biāo)定(1)取下接目鏡，旋下目鏡上的目透鏡，將目鏡測(cè)微尺放人接目鏡的中隔板上，使有刻度的一面朝下，再旋上目透鏡，并裝入鏡筒內(nèi)。(2)將物鏡測(cè)微尺置于顯微鏡的載物臺(tái)上，使有刻度的一面朝上，同觀察標(biāo)本一樣，使具有刻度的小圓圈位于視野中央。(3)先用低倍鏡觀察，對(duì)準(zhǔn)焦距，待看清物鏡測(cè)微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡，使目鏡測(cè)微尺的刻度與物鏡測(cè)微尺的刻度相平行，并使兩尺的左邊第一條線相重合，再向右尋找兩尺的另外一條重合線。如圖

(4)記錄二條重合線間的目鏡測(cè)微尺的格數(shù)和物鏡測(cè)微尺的格數(shù)。

第5頁(yè)，共17頁(yè)，2023年，2月20日，星期四3.計(jì)算方式(1)目鏡測(cè)微尺每格長(zhǎng)度=兩個(gè)重疊刻度間物鏡測(cè)微尺格數(shù)×10／兩個(gè)重疊刻度間目鏡測(cè)微尺格數(shù)(2)以同樣方法，分別在不同倍率的物鏡下測(cè)定測(cè)微尺上每格的實(shí)際長(zhǎng)度。目鏡測(cè)微尺()格=物鏡測(cè)微尺()格目鏡測(cè)微尺每格=()(3)如此測(cè)定后的目鏡測(cè)微尺的尺度，僅適用于測(cè)定時(shí)所用的顯微鏡的目鏡和物鏡的放大倍數(shù)。若更換物鏡、目鏡的放大倍數(shù)時(shí)，必須再進(jìn)行校正標(biāo)定。

第6頁(yè)，共17頁(yè)，2023年，2月20日，星期四4.酵母菌大小的測(cè)定(1)取下物鏡測(cè)微尺，換上酵母菌水浸制片。(2)測(cè)量菌體的長(zhǎng)度和寬度各占目鏡測(cè)微尺幾格，然后換算出菌體的實(shí)際長(zhǎng)度。(3)在同一標(biāo)本上測(cè)定5-10個(gè)菌體，求其平均值。

第7頁(yè)，共17頁(yè)，2023年，2月20日，星期四(二)酵母細(xì)胞數(shù)的測(cè)定操作方法1.血球計(jì)數(shù)板的構(gòu)造

血球計(jì)數(shù)板是由一塊比普通載玻片厚的特制玻片制成的。玻片中有四條下凹的槽，構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)。中間的平臺(tái)較寬，其中間又被一短橫槽隔為兩半，每半邊上面?zhèn)€刻有一個(gè)方格網(wǎng)。方格網(wǎng)上刻有9個(gè)大方格，其中只有中間的一個(gè)大方格為計(jì)數(shù)室，供微生物計(jì)數(shù)用。這一大方格的長(zhǎng)和寬各為1m，深度為，其體積為0.1mm3。

第8頁(yè)，共17頁(yè)，2023年，2月20日，星期四計(jì)數(shù)室通常有兩種規(guī)格。一種是大方格內(nèi)分為16中格，每一中格又分為25小格；另一種是大方格內(nèi)分為25中格，每一中格又分為16小格。但是不管計(jì)數(shù)室是哪一種構(gòu)造；它們都有一個(gè)共同的特點(diǎn)，即每一大方格都是由16×25=25×16=400個(gè)小方格組成，見(jiàn)圖。2.血球計(jì)數(shù)板的使用(1)用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)酵母菌懸液的酵母菌個(gè)數(shù)。(2)樣品稀釋的目的是便于酵母菌懸液的計(jì)數(shù)，以每小方格內(nèi)含有4-5個(gè)酵母細(xì)胞為宜，一般稀釋10倍即可。

第9頁(yè)，共17頁(yè)，2023年，2月20日，星期四(3)將血球計(jì)數(shù)板用擦鏡紙擦凈，在中央的計(jì)數(shù)室上加蓋專用的厚玻片。(4)將稀釋后的酵母菌懸液，用吸管吸取一滴置于蓋玻片的邊緣，使菌液緩緩滲入，多余的菌液用吸水紙吸取，捎待片刻，使酵母菌全部沉降到血球計(jì)數(shù)室內(nèi)。(5)計(jì)數(shù)時(shí)，如果使用16格×25格規(guī)格的計(jì)數(shù)室，要按對(duì)角線位，取左上、右上、左下、右下4個(gè)中格（即100個(gè)小格）的酵母菌數(shù)。如果規(guī)格為25格×16格的計(jì)數(shù)板，除了取其4個(gè)對(duì)角方位外，還需再數(shù)中央的一個(gè)中格(即80個(gè)小方格)的酵母菌數(shù)。

第10頁(yè)，共17頁(yè)，2023年，2月20日，星期四(6)當(dāng)遇到位于大格線上的酵母菌，一般只計(jì)數(shù)大方格的上方和右方線上的酵母細(xì)胞(或只計(jì)數(shù)下方和左方線上的酵母細(xì)胞)。(7)對(duì)每個(gè)樣品計(jì)數(shù)三次，取其平均值，按下列公式計(jì)算每1ml菌液中所含的酵母菌個(gè)數(shù)。

第11頁(yè)，共17頁(yè)，2023年，2月20日，星期四3.計(jì)算公式(1)16格×25格的血球計(jì)數(shù)板計(jì)算公式：酵母細(xì)胞數(shù)／ml=100小格內(nèi)酵母細(xì)胞個(gè)數(shù)／100×400×104×稀釋倍數(shù)(2)25格x16格的血球計(jì)數(shù)板計(jì)算公式：酵母細(xì)胞數(shù)／ml=80小格內(nèi)酵母細(xì)胞個(gè)數(shù)／80×400×104×稀釋倍數(shù)第12頁(yè)，共17頁(yè)，2023年，2月20日，星期四4.血球計(jì)數(shù)板的清潔血球汁數(shù)板使用后，用自來(lái)水沖洗，切勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干，或用95％的乙醇、無(wú)水乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑脫水使其干燥。通過(guò)鏡檢觀察每小格內(nèi)是否殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)清洗直到干凈為止。

第13頁(yè)，共17頁(yè)，2023年，2月20日，星期四五、思考題及實(shí)驗(yàn)作業(yè)1.若更換不同放大倍數(shù)的目鏡和物鏡時(shí)，必須用物鏡測(cè)微尺標(biāo)定目鏡測(cè)微尺，這是為什么?2.利用血球計(jì)數(shù)板時(shí)，注入的菌液為什么不能過(guò)多?3.測(cè)定酵母細(xì)胞大小的結(jié)果。

(1)接目鏡倍數(shù)是

；低倍鏡倍數(shù)

；高倍鏡倍數(shù)

。

(2)低倍鏡下，接目鏡測(cè)微尺

格=物鏡測(cè)微尺

格。目鏡測(cè)微尺每格=

μm。

(3)高倍鏡下，接目鏡測(cè)微尺

格=鏡臺(tái)測(cè)微尺

格。目鏡測(cè)微尺每格=

μm。

(4)酵母菌測(cè)量結(jié)果填表

(5)酵母菌直