微生物平板劃線試驗

平板劃線實驗實習(xí)

微生物平板劃線試驗一、相關(guān)基礎(chǔ)理論－－細(xì)菌的培養(yǎng)一般細(xì)菌均可用人工方法進(jìn)行培養(yǎng)，使其生長繁殖，以便進(jìn)一步觀察和研究他們的各種生物學(xué)特征。為了獲得良好的細(xì)菌培養(yǎng)物，在分離培養(yǎng)細(xì)菌時，除采用適宜的培養(yǎng)基，并考慮到其他的培養(yǎng)條件之外，掌握各種分離培養(yǎng)和接種的基本技術(shù)，也是重要環(huán)節(jié)。

微生物平板劃線試驗1、培養(yǎng)基

在土壤、水、食品、空氣以及人和動、植物中，不同種類的細(xì)菌混雜地生活在一起。若要研究其中某種細(xì)菌，就必須將各種細(xì)菌進(jìn)行分離，以得到只含有這一種細(xì)菌的純培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)菌分離成純種后，常需要接種到有關(guān)的培養(yǎng)基中，以測試其各種生物學(xué)性狀，不同的細(xì)菌需要不同的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

微生物平板劃線試驗1、培養(yǎng)基培養(yǎng)基按其物理性狀，分為固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基按用途，分基礎(chǔ)培養(yǎng)基、加富培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基。微生物平板劃線試驗按物理狀態(tài)不同劃分固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基中加入一定量凝固劑，使其成為固體狀態(tài)，瓊脂含量一般為1.5%-2.0%瓊脂含量一般為0.2%-0.7%不加任何凝固劑半固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基常用來進(jìn)行微生物的分離、鑒定、活菌計數(shù)及菌種保藏

觀察微生物的運動特征、分類鑒定及噬菌體效價滴定

大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)及在實驗室進(jìn)行微生物的基礎(chǔ)理論和應(yīng)用方面的研究微生物平板劃線試驗按用途不同劃分基礎(chǔ)培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基用來將某種或某類微生物從混雜的微生物群體中分離出來的培養(yǎng)基用于鑒別不同類型微生物的培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入某些特殊營養(yǎng)物質(zhì)制成的一類營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基微生物產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物，與培養(yǎng)基中的特殊化學(xué)物質(zhì)發(fā)生特定的化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生明顯的特征變化牛膏蛋白胨培養(yǎng)基是最常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基加富培養(yǎng)基微生物平板劃線試驗2、常見培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基肉浸液培養(yǎng)基：一般細(xì)菌都能在此培養(yǎng)基內(nèi)生長營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：一般細(xì)菌培養(yǎng)使用蛋白胨水培養(yǎng)基：靛基質(zhì)實驗微生物平板劃線試驗2、常見培養(yǎng)基加富培養(yǎng)基血瓊脂培養(yǎng)基：可作為肺炎球菌、鏈球菌、葡萄球菌、嗜血桿菌等的分離培養(yǎng)，還可用于某些菌落的溶血作用巧克力瓊脂培養(yǎng)基：淋球菌及腦膜炎雙球菌在此培養(yǎng)基上生長較佳微生物平板劃線試驗2、常見培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基亞硒酸鹽增菌液：作為沙門氏菌屬及某些志賀氏菌屬增菌用伊紅－美藍(lán)瓊脂：分離沙門氏及志賀氏菌屬細(xì)菌Baird-Parker培養(yǎng)基：用于金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)分離微生物平板劃線試驗2、常見培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基三糖鐵瓊脂：供鑒定腸道細(xì)菌用雙糖含鐵瓊脂：供鑒定腸道細(xì)菌用葡萄糖枸櫞酸鹽瓊脂：共作鑒別大腸桿菌與產(chǎn)氣桿菌之用微生物平板劃線試驗二、細(xì)菌的接種方法將混合的細(xì)菌分離的方法有多種，平板劃線法即是其中之一，該方法主要是借劃線而將混雜的細(xì)菌在瓊脂平板表面分散開，是單個細(xì)菌能固定在某一點，生長繁殖后形成單個的菌落以達(dá)到分離純種的目的。當(dāng)細(xì)菌分離成純種后，一般還可用斜面、液體和半固體培養(yǎng)基來檢驗細(xì)菌的培養(yǎng)特征，因此接種方法可相應(yīng)的分為四種。微生物平板劃線試驗表3常見的幾種細(xì)菌的培養(yǎng)和基接種方法舉例

平板劃線接種法斜面培養(yǎng)基接種法液體培養(yǎng)基接種法穿刺接種法菌種葡萄球菌和大腸桿菌的混合菌液大腸桿菌培養(yǎng)物大腸桿菌培養(yǎng)物枯草桿菌培養(yǎng)物變形桿菌培養(yǎng)物痢疾桿菌培養(yǎng)物培養(yǎng)基普通瓊脂平板瓊脂斜面培養(yǎng)基普通肉湯培養(yǎng)基半固體瓊脂培養(yǎng)基微生物平板劃線試驗1、斜面培養(yǎng)基接種法

常用于細(xì)菌的大量繁殖，保存菌種，或觀察其某些生化特性。瓊脂斜面、尿素培養(yǎng)基、雙糖鐵培養(yǎng)基、檸檬酸鹽培養(yǎng)基等具有斜面外形的固體培養(yǎng)基均可用此法接種。

微生物平板劃線試驗1、斜面培養(yǎng)基接種法步驟：（1）用記號筆在待接種的培養(yǎng)管上寫明標(biāo)記。（2）點燃酒精燈。（3）左手拇指、食指、中指及無名指分別握持菌種與待接種的培養(yǎng)基管，使菌種管位于左側(cè)，斜面部均應(yīng)向上。（4）以右手拇指和食指捏持轉(zhuǎn)動兩管試管塞，以便在接種是易于拔取。（5）右手持接種環(huán)，在火焰上燒灼滅菌。微生物平板劃線試驗1、斜面培養(yǎng)基接種法（6）以右手手掌及小指，小指及無名指分別拔取并夾持兩管試管塞，將兩管管管口滅菌。（7）將已滅菌且已冷卻的接種環(huán)伸入菌種管內(nèi)，從斜面上輕輕挑取少量菌苔退出菌種管。再伸進(jìn)待接種的培養(yǎng)基管，進(jìn)行斜面培養(yǎng)基接種，從斜面底部輕輕向頂端彎曲劃線，不要觸破培養(yǎng)基表面。微生物平板劃線試驗1、斜面培養(yǎng)基接種法（8）接種完畢，滅菌兩試管的管口，塞好試管塞，并放至原來的位置上。重新燒灼接種環(huán)，滅菌后放回試管架上。接種好的試管放37℃溫箱培養(yǎng)，18～24小時候觀察生長情況。微生物平板劃線試驗1、斜面培養(yǎng)基接種法圖2-1斜面培養(yǎng)基接種法微生物平板劃線試驗2、液體培養(yǎng)基接種方法可用于觀察細(xì)菌不同的生長狀況，有的呈均勻混濁，有的呈沉淀生長，還有的在液體表面形成菌膜；另外還可以供測定細(xì)菌生化特性用。凡是肉湯、葡萄糖蛋白胨水以及各種單糖發(fā)酵管等液體培養(yǎng)基均用此法接種。

微生物平板劃線試驗2、液體培養(yǎng)基接種方法步驟:（1）用記號筆在待接種培養(yǎng)基上寫明標(biāo)記。（2）如斜面培養(yǎng)基的接種方法一樣，握持菌種管及接種的肉湯管。（3）接種環(huán)滅菌冷卻后，伸入菌種管取少量細(xì)菌再伸入肉湯管內(nèi)，在接近液面管壁處輕輕研磨，蘸取少量肉湯調(diào)和，使菌混于肉湯中。塞好試管塞后，搖動液體，使細(xì)菌在液體中均勻分布。（4）接種完畢，將接種環(huán)滅菌后放回試管架上。肉湯管放37℃溫箱培養(yǎng)，18～24小時后觀察生長情況。微生物平板劃線試驗2、液體培養(yǎng)基接種方法圖2-2液體培養(yǎng)基接種法

微生物平板劃線試驗3、穿刺接種法常用于半固體瓊脂培養(yǎng)基、醋酸鉛培養(yǎng)基、雙糖鐵培養(yǎng)基等的接種，前者用于測定細(xì)菌的動力，后二者則用于觀察細(xì)菌的生化反應(yīng)。微生物平板劃線試驗3、穿刺接種法步驟:（1）用記號筆在待接種培養(yǎng)基上寫明標(biāo)記。（2）如斜面培養(yǎng)基接種法，握持菌種管及待接種的半固體瓊脂培養(yǎng)基。（3）右手持接種針，滅菌冷卻后，以針挑取菌苔，垂直刺入半固體瓊脂培養(yǎng)基的中心，刺達(dá)近管底部，但不必及于管底，然后循原路退出。（4）接種完畢，接種針重新滅菌后放至試管架上，塞好試管塞，37℃培養(yǎng)18～24小時后取出觀察細(xì)菌的生長情況。微生物平板劃線試驗3、穿刺接種法圖2-3穿刺接種法微生物平板劃線試驗4、平板劃線接種法

常用于分離單個菌落，也可用于觀察細(xì)菌的生長狀況和觀察某些生化反應(yīng)。沙門氏菌的各屬在亞硫酸鉍瓊脂平板上呈黑色，具有金屬光澤；志賀氏菌屬在HE瓊脂平板、SS瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板上呈現(xiàn)無色透明不發(fā)酵乳糖的菌落。微生物平板劃線試驗4、平板劃線接種法——接種方法（1）標(biāo)記在培養(yǎng)皿底面，用記號筆注明接種的菌名、接種者姓名、日期等。

微生物平板劃線試驗4、平板劃線接種法

（2）滅菌接種環(huán)點燃酒精燈，右手以持筆式握持接種環(huán)，并放置火焰中燒灼滅菌，先將接種環(huán)的接種絲部分置于火焰中，待金屬絲燒紅并蔓延至金屬端，再直接燒灼金屬環(huán)直至燒紅，然后由金屬環(huán)至金屬桿方向快速通過火焰，隨后再反方向通過火焰，如此2~3次。然后將接種環(huán)移開火焰，待其冷卻。微生物平板劃線試驗4、平板劃線接種法

圖2-4滅菌接種環(huán)微生物平板劃線試驗4、平板劃線接種法

（3）取菌種左手持裝有金黃色葡萄球菌或大腸桿菌菌液的試管，用持有接種環(huán)的右手手掌及小指拔取試管塞，將試管管口迅速通過火焰2~3次進(jìn)行滅菌。將已滅菌且已冷卻的接種環(huán)伸入菌種管中，取一接種環(huán)的菌液，然后退出菌種管，將菌種管管口再次通過火焰2~3次滅菌，塞好試管塞，放至原來的位置。微生物平板劃線試驗4、平板劃線接種法

（4）分離劃線接種細(xì)菌（四區(qū)接種法）

①左手持瓊脂平板培養(yǎng)基（將皿蓋反放在桌上酒精燈附近），盡量使之直立以免空氣中的細(xì)菌落入其中，并靠近火焰。右手持接種環(huán)在瓊脂平板上端來回劃線，涂成一細(xì)菌薄膜（約占平板的1/10），視為一區(qū)。劃線時使接種環(huán)與接種平板面呈30~40度角，以腕力在平板表面行輕而快地來回滑動動作。②旋轉(zhuǎn)瓊脂平板90度，燒灼接種環(huán)，以殺滅環(huán)上的殘留細(xì)菌，將接種環(huán)觸及培養(yǎng)基表面以使其冷卻。滅菌接種環(huán)通過薄膜處作連續(xù)平行劃線（約占平板1/5），此視為二區(qū)。微生物平板劃線試驗4、平板劃線接種法

③旋轉(zhuǎn)瓊脂平板90度，灼燒接種環(huán)滅菌并使之冷卻。將滅菌接種環(huán)接二區(qū)連續(xù)平行劃線（約占平板1/4），此為三區(qū)。④旋轉(zhuǎn)瓊脂平板90度，接種環(huán)不必再滅菌，接三區(qū)連續(xù)平行劃線，劃滿平板其余部分，此視為四區(qū)。各區(qū)接種線間盡量互不交接，以達(dá)到細(xì)菌逐漸稀釋的目的。

微生物平板劃線試驗4、平板劃線接種法

圖2-5四區(qū)劃線微生物平板劃線試驗4、平板劃線接種法微生物平板劃線試驗4、平板劃線接種法

（5）劃線完畢，將瓊脂平板放進(jìn)皿蓋，將培養(yǎng)皿倒放，送進(jìn)37℃溫箱培養(yǎng)。（6）培養(yǎng)18~24h后將培養(yǎng)皿取出。觀察瓊脂平板表面生長的各種菌落，注意其大小、形狀、邊緣、表面結(jié)構(gòu)、透明度、顏色等性狀。微生物平板劃線試驗三、金黃色葡萄球菌和普通大腸桿菌

平板劃線接種實驗1、實驗內(nèi)容2、實驗?zāi)康?、實驗用品4、實驗步驟5、觀察結(jié)果微生物平板劃線試驗1、實驗內(nèi)容

（1）四區(qū)劃線法接種金黃色葡萄球菌至血瓊脂培養(yǎng)基平皿一個

（2）四區(qū)劃線法接種普通大腸桿菌至伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基平皿一個微生物平板劃線試驗2、實驗?zāi)康模?）熟悉四區(qū)劃線法接種細(xì)菌（2）培養(yǎng)嚴(yán)格的無菌操作意識微生物平板劃線試驗3、實驗用品（1）菌液：金黃色葡萄球菌和普通大腸桿菌菌液各一管。（2）實驗器械：酒精燈一個、血平板一個、伊紅美藍(lán)平板一個、接種環(huán)一支。微生物平板劃線試驗4、實驗步驟參照前面介紹的四區(qū)劃線法的操作步驟操作，一定要在無菌條件下，養(yǎng)成無菌意識。（1）標(biāo)記（2）滅菌接種環(huán)（3）取菌種（4）分離劃線接種細(xì)菌（5）劃線完畢，送進(jìn)37℃溫箱培養(yǎng)（6）培養(yǎng)18~24h，觀察結(jié)果微生物平板劃線試驗5、觀察結(jié)果結(jié)果觀察在18~24小時以后菌落：標(biāo)本或液體培養(yǎng)物劃線接種到固體培養(yǎng)基表面后，單個細(xì)菌經(jīng)分裂繁殖可形成一個肉眼可見的細(xì)菌集團，稱為菌落。微生物平板劃線試驗5、觀察結(jié)果

(1)菌落的形態(tài)特征：大小、形狀（露滴狀、圓形、菜花樣、不規(guī)則等）、突起或扁平、凹陷、邊緣（光滑、波形、鋸齒狀、卷發(fā)狀等）、顏色（紅色、灰白色、黑色、綠色、無色、黃色等）、表面（光滑、粗糙等）、透明度（不透明、半透明、透明等）和粘度等。微生物平板劃線試驗5、觀察結(jié)果

(2)菌落溶血特征：菌落溶血有下列3種情況。①α溶血：又稱草綠色溶血，菌落周圍培養(yǎng)基出現(xiàn)1~2mm的草綠色環(huán)，為高鐵血紅蛋白所致；②β溶血：又稱完全溶血，菌落周圍形成一個完全清晰透明的溶血環(huán)，是細(xì)菌產(chǎn)生的溶血素使紅細(xì)胞完全溶解所致；③γ溶血：即不溶血，菌落周圍的培養(yǎng)基沒有變化，紅細(xì)胞沒有溶解或缺損。

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