乳酸菌的益生及免疫調(diào)節(jié)作用

乳酸菌的益生及免疫調(diào)節(jié)作用第一頁，共21頁。InternationalJournalofFoodMicrobiologyAvailableonline13May2011Keywords:LactobacilliProbioticcharacteristicsImmunemodulation第二頁，共21頁。Inthecurrentstudy,theprobioticpotentialofapproximately350strainsoflacticacidbacteriaisolatedfromKoreaninfantfecesandKimchiwasinvestigated.Commonprobioticpropertiesofthebacterialstrains,suchasacidtolerance,biletoleranceandadhesiontohumanintestinalepithelialcells(HT-29cells),wereexamined.Somestrainswerefoundtohaveimmunemodulatoryandantimicrobialproperties.Antagonisticactivityagainstapanelofpathogenicbacteriawasfoundtobestraindependent.Toevaluatetheimmunemodulatoryactivityofthestrains,lymphocyteinterferon(IFN)-γsecretionwasdeterminedinconjunctionwithcellproliferation.SomestrainsofLactobacillusgasseri,L.fermentumandL.plantarumexhibitedincreasedIFN-γlevelsandlymphocyteproliferation.Toevaluatetheeffectsoftheseimmunemodulatinglactobacillionhostlifespan,Caenorhabditiseleganswasusedasaninvivomodel.Nematodesthatweresuppliedheat-killedlactobacilliasafoodsourceexhibitedobviousdifferencesinlifespancomparedwiththosefedEscherichiacoliOP50.Themeanlifespan(determinedasmeanpercentsurvival)ofwormsfedL.plantarumCJLP133andL.fermentumLA12was13.89%and13.69%greater,respectively,thanthatofcontrolnematodesafter21days(P=0.036and0.043,respectively).Inaddition,someofsafetyprofiles,includinghemolytictype,gelatinhydrationanddegradationofurea,werefoundtobepositive.Thesenewlyidentifiedlactobacilliholdpromiseforuseasprobioticagents,feedadditivesand/orinfoodapplications.第三頁，共21頁。Abstract研究發(fā)現(xiàn)，從韓國嬰兒的糞便及泡菜中分離出的乳酸菌大約有350株菌株有益生潛力。益生菌的普遍益生特性主要包括：耐酸性，耐膽鹽及對人腸上皮細(xì)胞的粘附性。還有一些菌株有免疫調(diào)節(jié)作用及抗菌作用。一些細(xì)菌對致病菌有一定的抵抗作用。為了評估這株菌的免疫調(diào)節(jié)作用，測定淋巴細(xì)胞干擾素（IFN）

-γ的分泌與增值。一些發(fā)酵乳桿菌和植物乳桿菌會使干擾素（IFN）

-γ分泌增加及淋巴細(xì)胞的增值。一些安全指標(biāo)，包括溶血性，明膠水化及尿素降解發(fā)現(xiàn)是陽性的。這些分離出來的菌株可以作為益生菌用于飼料及食物中。第四頁，共21頁。1Introduction

乳酸菌作為益生菌可以有益于人類健康及阻止人類疾病。乳酸桿菌是一個有較好益生效果的菌屬。大量的研究證實(shí)許多的乳酸桿菌都有益生特性。雖然在傳統(tǒng)的食品中乳酸桿菌作為益生菌有很長的歷史了，但它作為益生作用及用于食品加工之前一些指標(biāo)還是需要測定的。益生菌能夠抵抗胃酸和膽鹽，并能夠定植于人體的腸道中。已經(jīng)證實(shí)乳酸菌能夠抑制致病菌的生長，如大腸桿菌，李斯特菌，沙門氏菌等。臨床上也顯示出了乳酸桿菌的有益作用，如降低膽固醇，預(yù)防腹瀉，緩解乳糖不耐癥，抗癌及免疫調(diào)節(jié)作用，這些都說明它具有益生功能。近年來認(rèn)為免疫調(diào)節(jié)作用對宿主腸道健康有很重要的作用。益生菌的益生作用被應(yīng)用于功能性食品及藥物制劑中，主要是由于這些微生物能夠刺激宿主的免疫系統(tǒng)。對致病菌及微生物抗原的防御反應(yīng)能夠促進(jìn)腸道成熟及完整性。一些體外實(shí)驗也證明了乳酸桿菌具有抑制致病菌的作用。第五頁，共21頁。本實(shí)驗的研究主要集中在對從韓國嬰兒糞便及泡菜中分離出乳酸桿菌的益生特性的研究主要集中在耐酸性（acidtolerance），耐膽鹽（biletolerance）及人體上皮細(xì)胞的粘附性上（humanintestinalepithelialcells）。一些測試菌株表現(xiàn)出免疫調(diào)節(jié)作用及抗菌作用并且能夠延長宿主的壽命。主要應(yīng)用于亞洲人群的發(fā)酵乳桿菌和植物乳桿菌有潛在的益生特性。這些益生特性可以應(yīng)用于功能性食品及飼料中。第六頁，共21頁。2Materialsandmethods

2.1Isolationandpreliminaryidentification乳酸桿菌來自于韓國嬰兒的糞便及泡菜中。乳酸桿菌用改良的MRS固體培養(yǎng)基，37℃厭氧培養(yǎng)48h。從平板中挑取單菌落在純化的MRS固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并進(jìn)行革蘭氏染色。在-80℃條件下用含15%甘油的MRS液體培養(yǎng)基儲存。傳代三次。第七頁，共21頁。2.2Specieslevelidentification通過16rDNA序列分析對209個分離菌株進(jìn)行測定。從每個菌株中提取DNA進(jìn)行引物擴(kuò)增。PCR引物序列如下：正向引物，5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3';反向引物5'-GGTTACCTTTGTTACGACTT-3'；94℃下變性5min。然后進(jìn)行30個循環(huán)，持續(xù)一分鐘。退火：50-55℃,1min,72℃，40s聚合反應(yīng)，最后72℃聚合5min。擴(kuò)增產(chǎn)物使用凝膠提取試劑盒進(jìn)行純化。最終產(chǎn)品的序列通過ABI377DNA自動測序儀進(jìn)行分析。將得到的序列與DNA數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行比較進(jìn)行同源性分析。第八頁，共21頁。2.3pHandbiletolerance耐酸性：含有1000單位/毫升的胃蛋白酶的酸化MRS液體培養(yǎng)基

37℃培養(yǎng)3h，觀察活菌存活數(shù)。膽鹽耐受性：含0.3%膽汁的MRS液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24h,觀察活菌數(shù)第九頁，共21頁。2.4AdhesionassayHT-29腸上皮細(xì)胞儲存于24孔培養(yǎng)板中并供給補(bǔ)充10%的胎牛血清的RPMI-1640，細(xì)胞濃度為4×104個細(xì)胞/孔。所用細(xì)胞濃度大約為約1×107CFU/毫升。在37℃培育兩個小時后，用PBS洗滌單層膜6次。用無菌水吹打粘附的細(xì)菌，使其分離，進(jìn)行平板計數(shù)。重復(fù)兩次。第十頁，共21頁。2.5Inhibitionofintestinalpathogens六個代表性的腸道致病菌：大腸桿菌O157和H7ATCC43894，鼠傷寒沙門氏菌KCCM11806，糞腸球菌，金黃色葡萄球菌，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌和李斯特菌。致病菌在37℃BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h。取1ml細(xì)菌培養(yǎng)液與100ml含有1.2%瓊脂的BHI一起倒入平板中。將乳酸桿菌（40微升）涂在平板的表面，37℃培養(yǎng)12h。不含乳酸桿菌的MRS作為陰性對照組。培養(yǎng)后，測定抑菌圈的范圍。出現(xiàn)明顯的超過2mm的抑菌圈為陽性。重復(fù)三次。第十一頁，共21頁。2.6Lymphocyteproliferationassay采用MTT法。淋巴細(xì)胞取自六周齡小鼠的脾臟，將其接種于96孔板中，加入200微升的RPMI-1640（補(bǔ)充10%FBS），培養(yǎng)24h。將乳酸桿菌加入到每孔中，在37℃含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)菌細(xì)胞的準(zhǔn)備：在MRS液體培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)18小時后，將細(xì)胞懸浮液以8000r/min離心10min,用PBS洗滌兩次。每個細(xì)菌細(xì)胞數(shù)的調(diào)整6×106CFU/毫升。72h后，將培養(yǎng)液從每孔移出，并在每孔加入20微升的MTT溶液。1h后，有色甲臜結(jié)晶溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定490nm的吸光度（OD值）。重復(fù)三次。陽性對照組，淋巴細(xì)胞培養(yǎng)在含有刀豆蛋白A（10微克/毫升），植物血凝素（

PHA，

10微克/毫升）或脂多糖（

LPS，

10微克/毫升）；陰性對照組：不含乳酸桿菌的的細(xì)胞第十二頁，共21頁。2.7Determinationofinterferon(IFN)-gammaproduction此實(shí)驗使用活菌體及熱滅活的細(xì)菌?；罹w的制備同上，細(xì)菌的懸浮液的體積調(diào)節(jié)到105菌落形成單位/毫升。熱滅火細(xì)胞的制備：37℃MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h，8000r/min離心10min,用PBS洗滌兩次。調(diào)整細(xì)胞懸浮液的體積到105菌落形成單位/毫升的密度~108菌落形成單位/毫升；最后細(xì)胞在70℃熱滅活10min，在-20℃儲存待用。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）測定培養(yǎng)上清液中的IFN-γ的水平。從小鼠取出的脾淋巴細(xì)胞，將其接種于96孔板中，加入200微升的RPMI-1640（補(bǔ)充10%FBS），將細(xì)菌細(xì)胞加入其中，37°C在含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3天后，回收培養(yǎng)上清，通過酶聯(lián)免疫吸附法（

ELISA）測定IFN-γ釋放量。在酶聯(lián)免疫吸附法（

ELISA）中，微量滴定板涂覆有5微克/毫升純化的抗IFN-γ抗體，室溫下反應(yīng)4小時，然后孔板用PBS洗滌三次。用1％牛血清白蛋白（BSA）的PBS封存。重復(fù)三次?？装逶谑覝叵屡囵B(yǎng)2h，之后用PBS洗滌5次。IFN–γ通過生物素標(biāo)記的抗IFN-γ抗體來測定。將孔板洗滌，加入辣根過氧化物酶。加入100微升的鹽酸終止反應(yīng)。在450nm處測定OD值。對于陽性對照組，淋巴細(xì)胞培養(yǎng)在含有刀豆蛋白A（10微克/毫升），植物血凝素（

PHA，

10微克/毫升）或脂多糖（

LPS，

10微克/毫升）；陰性對照組：不含乳酸桿菌的的細(xì)胞。第十三頁，共21頁。2.8Safetyevaluation

在含5％羊血瓊脂平板上培養(yǎng)48h后，測定溶血性和菌落形態(tài)。明膠液化程度在25°C冷凍的營養(yǎng)明膠管中測定至少72h。第十四頁，共21頁。3Results

3.1pH值及膽鹽耐受性350株菌株中有118株在含有1000單位/ml，pH2.5的條件下存活。一些菌株能夠在膽鹽環(huán)境中存活24h以上?？偨Y(jié)起來，共有59株乳酸桿菌在酸性及膽鹽條件下有較強(qiáng)的存活性。第十五頁，共21頁。3.2粘附力測定用上述59株菌株粘附HT-29腸上皮細(xì)胞（表1）。菌株間的差異性很大。在測試菌株中，有29株對上皮細(xì)胞有較強(qiáng)的粘附性，粘附性高于或接近陽性對照組鼠李糖乳桿菌。其余30株表現(xiàn)出低度或中度的粘附性。第十六頁，共21頁。3.3腸道致病菌的抑制乳酸桿菌對腸道致病菌的抑制作用有很大的不同。許多的菌數(shù)顯示出對腸道致病菌有弱的或沒有致病性，但是一些菌株，包括發(fā)酵乳桿菌LA12和CJMA3，植物乳桿