6酶、細胞、原生質(zhì)體固定化

第二章酶與細胞的固定化

固定化生物技術(shù)——通過化學或物理的手段將酶或游離細胞定位于限定的空間區(qū)域內(nèi)，使其保持活性并可反復利用。第二頁，共八十五頁。1.酶是蛋白質(zhì)，穩(wěn)定性差〔熱、酸堿、有機溶劑對其有影響〕。2.不能回收，也使產(chǎn)物中混雜酶蛋白。3.別離純化困難。

游離酶的缺點：第三頁，共八十五頁。一、固定化酶和固定化細胞的定義及特點1.固定化酶(immobilizedenzyme)固定在載體上并在一定空間范圍內(nèi)進行催化反響的酶。

第一節(jié)酶與細胞的固定化第四頁，共八十五頁。什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性載體水不溶性酶〔固定化酶〕固定化技術(shù)第五頁，共八十五頁。優(yōu)點：(1)可提高穩(wěn)定性。(2)能回收，易與產(chǎn)物別離，可反復使用。缺點：(1)存在擴散限制。適于催化小分子物質(zhì)。(2)酶活性下降。第六頁，共八十五頁。2.固定化細胞〔immobilizedcell〕固定在載體上并在一定空間范圍內(nèi)進行生命活動〔生長、繁殖、新陳代謝〕的細胞。第七頁，共八十五頁。優(yōu)越性：(1)降低本錢，省去酶的別離純化工作;(2)既可作為單一酶，也可作為復合酶系完成局部代謝過程。局限性：(1)細胞內(nèi)多種酶的存在，會形成不需要的副產(chǎn)物。(2)細胞膜、細胞壁和載體都存在著擴散限制作用。第八頁，共八十五頁。3.固定化原生質(zhì)體意義：(1)固定化原生質(zhì)體去除了細胞壁的擴散障礙，有利于氧的傳遞，營養(yǎng)成分的吸收和胞內(nèi)產(chǎn)物的分泌。(2)原生質(zhì)體不穩(wěn)定，容易破裂，固定化后，由于載體的保護作用，穩(wěn)定性提高。第九頁，共八十五頁。

二、固定化方法固定化方法〔一〕酶的固定化方法吸附法共價偶聯(lián)法交聯(lián)法包埋法網(wǎng)格型微囊型離子交換吸附物理吸附法第十頁，共八十五頁。依據(jù)帶電的酶或細胞和載體之間的靜電作用，使酶吸附于惰性固體的外表或離子交換劑上。1.吸附法〔adsorption〕第十一頁，共八十五頁。根據(jù)吸附劑的特點分:1〕物理吸附法〔physicaladsortion〕作用力：氫鍵、疏水鍵常用載體：氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石、纖維素、活性碳等。2〕離子結(jié)合法〔ionbinding〕作用力：離子鍵常用載體：DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠、CM-纖維素第十二頁，共八十五頁。優(yōu)點：條件溫和，操作簡便，酶活力損失少。缺點：結(jié)合力弱，易解吸附。第十三頁，共八十五頁。借助共價鍵將酶的活性非必需側(cè)鏈基團和載體的功能基團進行偶聯(lián)。2.共價偶聯(lián)法〔covalentbindingorcovalentcoupling〕第十四頁，共八十五頁。1〕載體：親水載體優(yōu)于疏水載體如:天然高分子衍生物:纖維素葡聚糖凝膠親和性好，機械性能差瓊脂糖合成聚合物：聚丙烯酰胺 聚苯乙烯機械性能好，但有疏水結(jié)構(gòu)尼龍第十五頁，共八十五頁。2〕偶聯(lián)方法：偶聯(lián)成功與否取決于： 載體：功能基團：芳香氨基，羧基，羧甲基等。酶分子:側(cè)鏈非必需基團：羧基，巰基，羥基，酚基，咪唑基。 第十六頁，共八十五頁。

常用的偶聯(lián)反響有：重氮化法、疊氮法、溴化氰法、烷基化法等。第十七頁，共八十五頁。優(yōu)點：酶與載體結(jié)合牢固，不會輕易脫落，可連續(xù)使用。缺點：反響條件較劇烈，易影響酶的空間構(gòu)象而影響酶的催化活性。

第十八頁，共八十五頁。3.交聯(lián)法〔crosslinking〕借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)的固定化方法。雙功能試劑： 常用的是戊二醛 O O H—C—CH2—CH2—CH2—C—H第十九頁，共八十五頁。戊二醛有兩個醛基，均可與酶或蛋白質(zhì)的游離氨基反響,使酶蛋白交聯(lián)。

此法與共價偶聯(lián)法利用的均是共價鍵，不同之處：交聯(lián)法不使用載體。第二十頁，共八十五頁。交聯(lián)反響既能發(fā)生在分子間，也可發(fā)生在分子內(nèi)。酶濃度低時，交聯(lián)發(fā)生在分子內(nèi)，酶仍保持溶解狀態(tài)。酶濃度高時，交聯(lián)發(fā)生在分子間，酶變?yōu)椴蝗軕B(tài)。第二十一頁，共八十五頁。缺點：(1)反響條件劇烈，酶分子的多個基團被交聯(lián)，酶活力損失大。(2)制備的固定化酶顆粒較小，給使用帶來不便。

第二十二頁，共八十五頁。4.包埋法〔entrapment〕將酶用物理的方法包埋在各種載體〔高聚物〕內(nèi)。分為：網(wǎng)格型：將酶包埋在高分子凝膠細微網(wǎng)格中。微囊型：將酶包埋在高分子半透膜中。第二十三頁，共八十五頁。1〕網(wǎng)格型包埋法〔gel(lattic)entrapment〕又稱凝膠包埋法使用的多孔載體及其特點第二十四頁，共八十五頁。海藻酸鈣凝膠包埋法：滴至海藻酸鈉溶液＋E(orcell)CaCl2溶液中IE(orIC)

角叉菜膠包埋法：滴至角叉菜膠＋E(orcell)KCl

溶液中IE(orIC)聚丙烯酰胺凝膠包埋法：APAcr+Bis+E(orcell)IE(orIC)TEMED第二十五頁，共八十五頁。2〕微囊型包埋法〔microencapsulation〕又稱半透膜包埋法將一定量酶液包在半透性的高分子微孔膜內(nèi)。半透膜：直徑幾十微米到幾百微米，厚約25nm。半透膜孔徑<酶分子孔徑，小于半透膜孔徑的小分子底物和產(chǎn)物可以自由進出，被稱為“人工細胞〞。第二十六頁，共八十五頁。與網(wǎng)格型包埋法相比，微囊型包埋法的優(yōu)點：1〕固定化酶顆粒小，有利于底物和產(chǎn)物擴散。2〕半透膜能阻止蛋白質(zhì)分子滲漏和進入，注入體內(nèi)既可防止引起免疫過敏反響，也可使酶免遭蛋白水解酶的降解，具有較大的醫(yī)學價值。缺點：反響條件要求高,制備本錢也較高。

第二十七頁，共八十五頁。包埋法是目前應用最多的一種較理想的方法，與其它固定化方法相比：優(yōu)點：不與酶蛋白氨基酸殘基反響，很少改變酶的高級結(jié)構(gòu)，酶活回收率高。缺點：只適合作用于小分子底物和產(chǎn)物的酶。第二十八頁，共八十五頁。

吸附法共價偶聯(lián)法交聯(lián)法包埋法

酶的四種固定化方法第二十九頁，共八十五頁。第三十頁，共八十五頁。第三十一頁，共八十五頁。各種固定化方法的優(yōu)缺點比較第三十二頁，共八十五頁。〔二〕細胞的固定化方法1.固定化細胞的分類第三十三頁，共八十五頁。1)直接固定法不使用載體，借助物理〔如加熱、冰凍〕、化學方法〔如檸檬酸、各種絮凝劑〕將細胞直接固定。一般只用于單酶或少數(shù)幾種酶催化的反響。2)吸附法3)包埋法2.固定化方法第三十四頁，共八十五頁。

例如：葡萄糖異構(gòu)酶(白色鏈霉菌)，是一種胞內(nèi)酶。在50--80℃加熱10分鐘，使菌體自溶作用的酶失活，而葡萄糖異構(gòu)酶仍然保持活性，長期使用酶活力不減少。第三十五頁，共八十五頁。

第三十六頁，共八十五頁。實驗：2.4%左右的卡拉膠，70℃溶解,再冷卻到42℃,+10%左右的細菌菌體(預熱到42℃〕

迅速混合均勻4℃冰箱放置大約30min取出后切成3×3mm的小顆粒

第三十七頁，共八十五頁。一般采用網(wǎng)格包埋法〔即凝膠包埋法〕。常用凝膠：瓊脂凝膠，海藻酸鈣凝膠，角叉菜膠和光交聯(lián)樹脂。注意：一般要加滲透壓穩(wěn)定劑，以防止原生質(zhì)體破裂?！踩吃|(zhì)體的固定化方法第三十八頁，共八十五頁。

第二節(jié)

固定化酶和固定化細胞的性質(zhì)與表征一、固定化酶的性質(zhì)

影響酶催化活性的因素1.構(gòu)象改變或立體屏蔽以及微擾2.分配效應和擴散限制效應第三十九頁，共八十五頁。第四十頁，共八十五頁。第四十一頁，共八十五頁?！惨弧趁傅幕钚裕和ǔ５陀谔烊幻浮灿欣狻?。〔二〕酶的穩(wěn)定性酶的耐熱性、對變性劑、抑制劑、蛋白酶的抵抗力增加。第四十二頁，共八十五頁?？赡艿脑颍孩俟潭ɑ黾恿嗣富钚詷?gòu)象的牢固程度，可防止酶分子伸展變形；②抑制酶的自身降解。③固定化局部阻擋了外界不利因素對酶的侵襲。第四十三頁，共八十五頁。如：氨基酰化酶，70℃，15分鐘，酶失去活性。而固定化后，70℃，15分鐘，有>80%活性。第四十四頁，共八十五頁?！踩趁傅淖钸m溫度最適溫度與酶穩(wěn)定性有關。多數(shù)酶固定化后熱穩(wěn)定性上升，最適溫度也上升〔有例外〕。〔四〕酶的最適pH帶負電荷載體：最適pH向堿性偏移。帶正電荷載體：最適pH向酸性偏移。第四十五頁，共八十五頁。第四十六頁，共八十五頁。

固定化酶的表觀米氏常數(shù)Km隨載體的帶電性能變化。固定化載體與底物電荷相反,固定化酶的表觀Km值降低。固定化載體與底物電荷相同,固定化酶的表觀Km值顯著增加?！参濉趁傅膭恿W特征第四十七頁，共八十五頁。與自然酶根本相同。但大分子底物難于接近酶分子，導致酶的專一性發(fā)生改變。〔六〕酶的作用專一性第四十八頁，共八十五頁。與固定化酶相比，固定化細胞的情況比較復雜?！?〕有活性升高的現(xiàn)象?！?〕穩(wěn)定性的增加?！?〕最適溫度和最適pH常保持不變。二、固定化細胞的性質(zhì)

第四十九頁，共八十五頁。(一)酶(細胞)的活力固定化酶通常呈顆粒狀，一般用于測定自然酶活力的方法改進后才能用于測定固定化酶。(二)蛋白總量1.雙辛可寧酸法(BCA法)2.考馬斯亮藍法

三、固定化酶〔細胞〕的評價指標第五十頁，共八十五頁。(三)偶聯(lián)率及相對活力偶聯(lián)率=(參加蛋白活力一上清液蛋白活力)/參加蛋白活力×100%活力回收=固定化酶總活力/參加酶的總活力×100%相對活力=固定化酶總活力/(參加酶的總活力-上清液中未偶聯(lián)酶活力)×100%第五十一頁，共八十五頁。

(四)半衰期

在連續(xù)測定條件下，固定化酶(細胞)的活力下降為最初活力一半所經(jīng)歷的連續(xù)工作時間，以t1/2表示。是衡量穩(wěn)定性的一項重要指標。第五十二頁，共八十五頁。不同固定化方法的比較第五十三頁，共八十五頁。乙酰-DL—AlaL—Ala+乙酸 乙酰-D—Ala第三節(jié)固定化酶與固定化細胞的應用一、在工業(yè)生產(chǎn)上的應用1.氨基?；浮睞minoacylase〕世界上第一種工業(yè)化生產(chǎn)的固定化酶第五十四頁，共八十五頁。泵儲罐反應產(chǎn)物離心機消旋反應器固定化酶柱子晶體L-AlaL-AlaA-D-AlaA-L-AlaA-D-Ala第五十五頁，共八十五頁。

2.葡萄糖異構(gòu)酶世界上生產(chǎn)規(guī)模最大，應用最為成功的一種固定化酶。第五十六頁，共八十五頁。二、固定化酶在醫(yī)學上的應用1.消血栓：纖溶酶是異源蛋白質(zhì)，在人體內(nèi)引起免疫反響，無法長期使用。酶的不穩(wěn)定性使其在較短的時間內(nèi)失活。用包埋法制備的酶固定化技術(shù)可克服上述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物質(zhì)能自由進出。第五十七頁，共八十五頁。2.人工腎：原理：將病人血液中的尿素經(jīng)脲酶水解成氨，再用活性炭吸附。即：用固定化脲酶和微膠囊活性炭組成人工腎。第五十八頁，共八十五頁。第五十九頁，共八十五頁。酶傳感器固定化酶和電化學傳感器的結(jié)合。優(yōu)點：①既有不溶性酶體系的優(yōu)點，又具有電化學電極的高靈敏度；②酶的專一反響性，使其具有較高的選擇性，能夠直接在復雜試樣中進行測定。三、在分析檢測中的應用第六十頁，共八十五頁。SensitiveandspecificRapidSimpleBiosensor第六十一頁，共八十五頁。

1967年Updike等采用酶的固定化技術(shù)，將葡萄糖氧化酶固定在疏水膜上，然后再和氧電極結(jié)合，組裝成了世界上第一個生物傳感器——葡萄糖氧化酶電極。第六十二頁，共八十五頁。葡萄糖酶電極酶電極示意圖?－D－葡萄糖＋O2 D－葡萄糖酸－1，5－內(nèi)酯＋H2O2半透膜酶膠層感應電極第六十三頁，共八十五頁。GlucoseGluconicacidGlucoseoxidaseOxygenHydrogenperoxideMembraneElectrode根據(jù)反響中消耗的O2、生成的葡萄糖酸和H2O2的量，可以用氧電極、pH電極和H2O2電極來測定葡萄糖的含量。第六十四頁，共八十五頁。繼酶傳感器〔enzymesensor〕后，又出現(xiàn)：細胞器傳感器〔cellorganellesensor〕組織傳感器〔tissuesensor〕微生物傳感器〔microbesensor〕免疫傳感器〔immunosensor〕第六十五頁，共八十五頁。1〕酶傳感器的原理生物傳感器由生物識別單元〔如酶、微生物、抗體等〕和物理轉(zhuǎn)換器相結(jié)合所構(gòu)成的分析儀器。第六十六頁，共八十五頁。第六十七頁，共八十五頁。生物識別元件

(Biologicalrecognitionelement)是酶、抗原(體)、細胞器、組織切片和微生物細胞等生物分子經(jīng)固定化后形成的一種膜結(jié)構(gòu)，對被測定的物質(zhì)有選擇性的分子識別能力。第六十八頁，共八十五頁。換能器(Transducer)將識別元件上進行的生化反響中消耗或生成的化學物質(zhì)，或產(chǎn)生的光或熱等轉(zhuǎn)換為電信號，并呈現(xiàn)一定的比例關系。第六十九頁，共八十五頁。第七十頁，共八十五頁。酶傳感器工作原理示意圖酶傳感器主要由固定化酶膜和變換器組成：固定化酶膜：選擇性地“識別〞并催化被檢測物質(zhì)發(fā)生化學反響；變換器：把催化反響中底物或產(chǎn)物的變量轉(zhuǎn)換成電信號，通過儀表顯示出來。

第七十一頁，共八十五頁。第七十二頁，共八十五頁。2〕酶傳感器的應用水質(zhì)監(jiān)測

用化學法測定酚時，硫化物、油類等可干擾其測定。從馬鈴薯中提純、經(jīng)吸附交聯(lián)得到的固定化多酚氧化酶與氧電極構(gòu)成酚傳感器，可檢測大多數(shù)酚類化合物。第七十三頁，共八十五頁。德國研發(fā)的環(huán)境廢水BOD分析儀第七十四頁，共八十五頁。醫(yī)療方面葡萄糖傳感器和血糖測定儀用葡萄糖氧化酶〔glucoseoxidase,GOD〕制成葡萄糖傳感器，可測定血液中葡萄糖濃度。第七十五頁，共八十五頁。手掌型葡萄糖(glucose)分析儀第七十六頁，共八十五頁。SBA-50型單電極生物傳感分析儀第七十七頁，共八十五頁。SBA-70型血糖乳酸自動分析儀第七十八頁，共八十五頁。食品鮮度魚鮮度傳感器在日本、加拿大等國廣泛用于魚類鮮度的測定。魚死后體內(nèi)ATP經(jīng)酶解依次形成ADP、AMP、IMP、肌苷、次黃嘌呤和尿酸。鮮度可用K值表示：K=肌苷+次黃嘌呤/ATP+ADP+AMP+IMP+肌苷+