WB實(shí)驗(yàn)步驟詳細(xì)總結(jié)材料

WB實(shí)驗(yàn)步驟詳細(xì)總結(jié)材料(總8頁(yè))-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-CompanyOne1-CAL-本頁(yè)僅作為文檔封面，使用請(qǐng)直接刪除#蛋白提?。ㄋ胁僮髟诒线M(jìn)行）裂解1）配裂解液：PMSF=100：1,（裂解液和PMSF在-20℃保存，提前一天4℃解凍）取2ml裂解液，加20*PMSF混勻2）稱取30mg組織，切碎放入標(biāo)記好的AP管中，加入600口上述1中液體（加入液體與組織比例為20：1），冰上靜置10min勻漿先用超純水潤(rùn)洗一下勻漿機(jī)的鋼頭，（同時(shí)進(jìn)行幾組勻漿時(shí)，組間也要潤(rùn)洗鋼頭）在勻漿機(jī)（在生化室）上每次勻漿10s，兩次（間隔5s），冰上靜置30min離心（在基礎(chǔ)4樓416室）1）自帶1ml槍以及藍(lán)槍頭和黃槍頭，三個(gè)1.5的離心管（①，②兩個(gè)標(biāo)記，③加少量超純水，③號(hào)是為了離心平衡，對(duì)稱放置）2）將離心機(jī)預(yù)冷至4℃為止，以1200乂10”巾皿離心15巾皿用移液槍將上層清液取出放入①②號(hào)管中變性（上樣緩沖液：樣品=4：1）將樣品轉(zhuǎn)移至2~3個(gè)0.5mlAP管中加上樣緩沖液，100℃變性10min儀器屏幕：S500：10S5100.000：10溫度 時(shí)間（時(shí)：分保存變性結(jié)束后，打開(kāi)AP管蓋放一下氣，然后4℃保存，點(diǎn)樣是取出即可用WB實(shí)驗(yàn)步驟清洗玻璃板：清洗玻璃板后風(fēng)干，將玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊，操作時(shí)要使兩玻璃對(duì)齊，以免漏膠。

配制分離膠1）準(zhǔn)備：1ml槍（藍(lán)色槍頭），200U1槍（黃色槍頭）10U1（白色槍頭）10%分離膠的配置：（用50ml燒杯。1.0mm板配1.5塊膠，1.5mm板配2塊板）5.91ml超純水4.95ml丙烯酰胺（30%）避光保存極易失效3.75mlPh8.8Tris?HCL150Ul10%SDS150UlAP（催化劑促凝作用）9UlTEMED混合搖勻（用移液槍抽吸混勻液體，不要將液體完全打出防止氣泡）灌膠沿玻璃板右上角緩慢勻速加入分離膠（用1ml移液槍，不要將移液管內(nèi)液體完全打出防止氣泡）保持液面平穩(wěn)上升至上方綠色線為止水封立即用1ml超純水進(jìn)行水封（利用重力把膠壓平），如有氣泡則用針頭吸出防止影響電泳效果，等待20-30min濃縮膠的配制（5%）4.13ml超純水1ml丙烯酰胺（30%）避光保存極易失效750UlPh6.8Tris?HCL60Ul10%SDS60UlAP（催化劑促凝作用）6UlTEMED攪拌混勻立即灌膠至溢出，插入梳子（10孔或15孔）凝膠30min或20min電泳（電泳液最多使用兩次）安裝電泳裝置低板對(duì)內(nèi)，上方夾住，往兩板中加入電泳液至黑線并觀察是否漏液，緩慢拔掉梳子（注意兩手平衡拔出防止拔歪）點(diǎn)樣（不易時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，防止樣品條帶擴(kuò)散）

Mark4ul(Proternladder)推薦9u,實(shí)際4u已經(jīng)足夠樣品8ul7-10ul均可內(nèi)參挑齊即可組數(shù)少時(shí)盡量靠中間點(diǎn)樣，邊緣易跑歪連接電泳儀電泳池與電泳蓋連接：黑對(duì)黑，紅對(duì)紅電永池的兩個(gè)電極插入電極蓋孔內(nèi)，打開(kāi)開(kāi)關(guān)恒壓電泳先調(diào)電壓至70mV,跑約20min°（Mark跑開(kāi)，分出彩帶即可）再調(diào)電壓至120mV,跑約60min。（不能跑過(guò)下面的玻璃板）注：Mark的條帶從紅色條帶往下依次為：70T55T40T35T20,待測(cè)蛋白的分子量再哪一區(qū)域就在哪一段剪。用綠色的切板切割待測(cè)區(qū)域，邊緣留點(diǎn)空余，以防止切到條帶。放入裝有轉(zhuǎn)移液的皿中浸泡轉(zhuǎn)膜（轉(zhuǎn)移液可用3-4次）剪四層濾紙（大小與膜相，近可大不可小）浸入轉(zhuǎn)移液皿中。然后再講其剪成與膠一致大小（膠始終保持濕潤(rùn)）剪PVDF膜（用上述濾紙，勿用手直接接觸PVDF膜），然后用甲醇活化10s以上“夾三明治”再大塑料盆中加入少量轉(zhuǎn)移液，將夾板、海綿、濾紙、膜均放入浸泡，夾板黑板在下、兩層濾紙T膠T膜T兩層濾紙（膠的大分子量條帶在上方，即在右上方）安裝轉(zhuǎn)膜裝置：黑板對(duì)黑板，電極黑對(duì)黑，紅對(duì)紅。加入轉(zhuǎn)膜液至滿（否則儀器無(wú)法啟動(dòng)）打開(kāi)開(kāi)關(guān)，調(diào)節(jié)電流至100mA，轉(zhuǎn)膜2h（恒流）盆中加滿冰轉(zhuǎn)膜成功標(biāo)志：膠上的條帶均轉(zhuǎn)移的膜上，膠呈無(wú)色封閉配制5%脫脂奶粉：＞小燒杯中混勻加入皿中2.5g＞小燒杯中混勻加入皿中50mlTBST2）將膜取出放入上述加入了5%脫脂奶粉中的皿中常溫慢搖60min（轉(zhuǎn)移液回收其余清理掉，轉(zhuǎn)移液可以重復(fù)利用2次）一抗1）用TBST配，每一格加5mlTBST,再分別加入抗體抗體的量：2l(Psmad2l)免抗1:10005ul：5ml58（分子量）2l(Psmad2l)免抗1:50010ul：5ml58Jnk免抗1:10005ul：5ml雙帶內(nèi)參（小鼠抗GAPH）單抗，中杉金橋1:50001ul：5ml36膜上用圓珠筆標(biāo)記，分別放入小格中（正面朝上）4℃冰箱中，慢搖過(guò)夜（正面朝上，搖床416室）洗脫用TBST在皿中洗脫，搖床10min每次，洗三次。二抗用3%的脫脂奶粉1.5g的脫脂奶粉5> 小燒杯中混勻加入皿中50mlTBST 」2）每格吸入5ml3%脫脂奶粉，抗體與奶粉比例均為1:5000,即加入1口l注意：吸入微升時(shí)，一定要檢查是否吸到液體，一抗用鼠抗則二抗用鼠抗，一抗用免抗二抗用免抗3）膜分別加入小格，慢搖1-2h（常溫）洗脫用TBST在皿中洗脫，搖床10min每次，洗三次。顯影：1U盤A液，B液（顯影液。4℃保存）200ul槍+槍頭（黃）膜（置于皿中）開(kāi)機(jī)后自動(dòng)預(yù)冷，溫度降到1-20℃才可顯影液現(xiàn)配現(xiàn)用(A液：B液=1：1)膜正面朝上放于暗箱，(即大分子量再左上角)用移液槍吧顯影液均勻涂在膜上先點(diǎn)擊自動(dòng)曝光，看下效果，顯示不清晰再手動(dòng)該曝光時(shí)間，內(nèi)參一般顯影15s(影像的條帶粗細(xì)深淺一致則說(shuō)明已調(diào)齊)內(nèi)參好說(shuō)明各步實(shí)驗(yàn)操作均無(wú)誤，目的蛋白結(jié)果好壞就取決于抗體的專一性。每張圖保存多張不同清晰度的以備用，拷貝至U盤試劑配方：30%AcrZBicC37,5:1)丙烯酰胺(Acr) 28,1g甲叉雙丙烯眈胺(Bic)0.75g超純水至 100ml取AuC&lg,加超純水(約80M)，攪拌『待Acr溶解后.力1Bk0.75gt溶解后定容至100ml,轉(zhuǎn)移至硬質(zhì)玻璃瓶(100ml)中，F(xiàn)C避光保存口LSMItisHC1CpH8.8)Tris(MW12114J 45.43g超純水 200ml溶解后，用濃鹽酸調(diào)pH至&&室溫保存..OMTrisIIC1(pII7.5)Tris(MW121,14) 30.29g超純水 200ml溶解后，用濃鹽般調(diào)pH至73(濃船酸加入體積約16mL),室溫保存匚0.5MTrisHC1卬H6.8)Tris（MW12114^ 15,14g超純水 200nil溶解后，用濃鹽酸調(diào)pH至68室溫保存。W%SDS（十：烷基硫酸鈉）SDS 10g超純水 100nil5OY水浴，至充分溶解，空溫保存口（如果長(zhǎng)期保存中出現(xiàn)沉淀，水浴溶化后，可繼續(xù)使用）10510%AP（過(guò)流酸錢）AP 0」g超純水 1ml溶解后，4℃避光保存，保存時(shí)間為1周。1J）20%Tweeii2OTweeii20 20ini超存水 80nil混為后，4℃保存。12）10%分離膠（1塊膠）TOC\o"1-5"\h\z超燉水 ：94ml30%AcrBic 3.33 mlL5MTrisHCI（pH8,8> 2,5 ml10%SDS 100 貝10%AP 100 blTENTED 6 pl13515蛛分離膠<1塊膠）超純水 23ml30%AcrBk 5.0ml1.5MTiisHC1（pHS.8） 2.5ml

10%SDS100id1U%APloomTEMED6Lil14）5%儂縮膠（2塊膠）超純水4.13ml30%AcrBic1.0ini05MTiisRC1(pH6.￡)0.75nil10%SDS60til10%AP60plTEMED6Lil151電泳液(1000ml)甘氨酸18.8gIns3.04gSDS1g屈純水1000mJ攪片溶解后備用，應(yīng)在二天內(nèi)使用。16)轉(zhuǎn)移液(1000ml)甘氨酸14.4gTris3.04gSDS0.75g超純水800ml攪拌溶解后,加 甲酹200ml混勻，靜置20mm后，轉(zhuǎn)移至硬質(zhì)玻璃瓶中，蓋