第二章基因工程制藥新版7

第三節(jié)基因工程制藥生產(chǎn)的基本過程一、工具酶的分離純化二、載體的分離純化三、外源DNA和目的基因的分離和獲得四、外源DNA與載體DNA的切割與連接五、宿主細(xì)胞的選擇和基因?qū)氩僮髁⒒蚬こ叹姆€(wěn)定性及生長(zhǎng)代謝的特點(diǎn)七、基因工程菌中試八、基因工程菌的擴(kuò)增和發(fā)酵生產(chǎn)九、基因工程藥物的分離和純化技術(shù)十、變性蛋白的復(fù)性十一、基因工程藥物的質(zhì)量控制十二、基因工程藥物的制造實(shí)例第一頁，共七十五頁。十、變性蛋白的復(fù)性

一、包含體及包含體形成原因二、包含體的分離和溶解三、包含體蛋白復(fù)性方法第二頁，共七十五頁。

以大腸桿菌作為表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)基因工程藥物時(shí),藥物蛋白通常會(huì)形成無活性的蛋白聚體即包含體,它們的一級(jí)結(jié)構(gòu)即氨基酸序列是正確的,但空間結(jié)構(gòu)錯(cuò)誤,沒有生物學(xué)活性。需要一個(gè)復(fù)性過程才能得到生物活性蛋白。第三頁，共七十五頁。

包含體是無定形的蛋白質(zhì)的聚集,不被任何膜所包圍。細(xì)胞破碎后,包含體呈顆粒狀,致密,低速離心就可獲得。欲獲得天然活性態(tài)的目標(biāo)產(chǎn)物,必需分離包含體后,溶解包含體并使其中的目標(biāo)蛋白恢復(fù)應(yīng)有的天然活性。第四頁，共七十五頁。包含體的優(yōu)勢(shì)：1、富集目標(biāo)蛋白：包含體具有高密度，易于分離純化的優(yōu)勢(shì)；2、抗蛋白酶：重組蛋白以包含體的形式存在有效地抵御了大腸桿菌中的蛋白酶對(duì)目的蛋白的降解；3、對(duì)宿主毒性小：生產(chǎn)那些處于天然構(gòu)象對(duì)宿主細(xì)胞有毒害的蛋白有優(yōu)勢(shì)。第五頁，共七十五頁。一、包含體及包含體形成原因

包含體定義:

細(xì)胞內(nèi)不溶性表達(dá),即蛋白在不適宜于折疊的環(huán)境中表達(dá)后形成不溶性產(chǎn)物。

包含體形成原因：蛋白高水平表達(dá)時(shí)

新生肽鏈的聚集速率﹥蛋白正確折疊速率

包含體形成重組蛋白在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，缺少一些折疊所需的酶和輔助因子（折疊酶和分子伴侶）。第六頁，共七十五頁。包含體的組成與特性：

一般含有50%以上的重組蛋白，其余為核糖體元件、RNA聚合酶、外膜蛋白o(hù)mpC、ompF和ompA等，環(huán)狀或缺口的質(zhì)粒DNA，以及脂體、脂多糖等，大小為0.5-1um，無定形，難溶與水，只溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等。第七頁，共七十五頁。二、包含體的分離和溶解包含體難溶于水中，在變性劑溶液（如鹽酸胍、脲）中才能溶解，溶解的蛋白質(zhì)呈變性狀態(tài)，即所有的氫鍵、疏水鍵被破壞，疏水側(cè)鏈完全暴露，但一級(jí)結(jié)構(gòu)和共價(jià)鍵不被破壞。當(dāng)除去變性劑時(shí)，一部分蛋白質(zhì)可自動(dòng)折疊成具有活性的正確構(gòu)型，此折疊過程為蛋白質(zhì)的復(fù)性。第八頁，共七十五頁。1、包含體的分離收集重組菌，破碎細(xì)胞；離心除上清；使用變性劑洗滌沉淀。2、包含體的溶解打斷包含體蛋白分子內(nèi)和分子間的各種化學(xué)鍵，使多肽鏈伸展。第九頁，共七十五頁。

溶解采用強(qiáng)的變性劑，如脲、鹽酸胍或硫氰酸鹽，SDS，各種溶解方法都各有利弊。含有半胱氨酸的蛋白質(zhì)，需要加入還原劑巰基乙醇、二硫蘇糖醇等。加入金屬螯合劑EDTA去除金屬離子。第十頁，共七十五頁。第十一頁，共七十五頁。三、包含體蛋白復(fù)性方法

幾個(gè)要求：活性蛋白的回收率高正確的復(fù)性的產(chǎn)物易于與錯(cuò)誤的折疊蛋白質(zhì)分離。折疊復(fù)性后應(yīng)得到濃度較高的蛋白質(zhì)產(chǎn)品復(fù)性過程耗時(shí)少第十二頁，共七十五頁。1稀釋、透析復(fù)性法2含二硫鍵的蛋白復(fù)性3封閉蛋白的疏水簇促進(jìn)復(fù)性4凝膠過濾層析復(fù)性5小分子添加劑促進(jìn)復(fù)性6分子伴侶或折疊酶促進(jìn)的復(fù)性7人工分子伴侶促進(jìn)的復(fù)性8減緩蛋白合成速率第十三頁，共七十五頁。1稀釋、透析復(fù)性法

高蛋白濃度將導(dǎo)致蛋白的聚集，復(fù)性時(shí)，變性蛋白經(jīng)一系列的折疊中間體，最終形成蛋白天然構(gòu)象。減少聚集最直接的方法就是降低蛋白濃度，當(dāng)?shù)鞍诐舛仍?0-50μg/ml時(shí)，可獲得較高復(fù)性率。復(fù)性前用稀釋、透析等方法去除變性劑和還原劑，促進(jìn)蛋白復(fù)性。第十四頁，共七十五頁。2含二硫鍵的蛋白復(fù)性

正確的二硫鍵重建方法：

空氣氧化法：利用空氣中的氧氣氧化折疊期間的巰基。

加入氧化-還原轉(zhuǎn)換試劑：如還原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽

加入氧化型谷胱甘肽：可使氧化型谷胱甘肽與還原的蛋白質(zhì)半胱氨酸之間形成二硫復(fù)合物，而后在復(fù)性過程中除去谷胱甘肽和變性劑，并加入低濃度的半胱氨酸取代蛋白質(zhì)-S-S-谷胱甘肽中的谷胱甘肽而使二硫鍵正確形成。

亞硫酸鈉/連四硫酸鈉:使變性蛋白質(zhì)磺化以保護(hù)巰基，復(fù)性時(shí)加入少量的還原試劑可移去保護(hù)基團(tuán)而使二硫鍵正確配對(duì)

加入DTT還原劑

第十五頁，共七十五頁。3封閉蛋白的疏水簇促進(jìn)復(fù)性

蛋白結(jié)構(gòu)和序列分析來確定蛋白分子中能引起分子間相互作用的疏水簇，可用特異性結(jié)合疏水族的單克隆抗體來封閉疏水簇，從而減少分子間結(jié)合引起的聚集。第十六頁，共七十五頁。4凝膠過濾層析復(fù)性

為減少高濃度下的聚集反應(yīng)，使用凝膠過濾層析介質(zhì)的隔離作用，降低蛋白之間的相互作用所產(chǎn)生的聚集，大大提高了復(fù)性率。第十七頁，共七十五頁。5小分子添加劑促進(jìn)復(fù)性

小分子添加劑可作為穩(wěn)定蛋白的活性狀態(tài)，降低非正確折疊分子的穩(wěn)定性，增加折疊中間體的穩(wěn)定性。添加劑并不加快折疊速率，只是抑制聚集發(fā)生。第十八頁，共七十五頁。6分子伴侶或折疊酶促進(jìn)的復(fù)性

分子伴侶和折疊酶在體外幫助蛋白復(fù)性從而提高復(fù)性率，但復(fù)性后的分離較繁，如分子伴侶或折疊酶不能重復(fù)利用，將增加成本。第十九頁，共七十五頁。7人工分子伴侶促進(jìn)的復(fù)性

變性蛋白被復(fù)性液中的去垢劑所捕獲，形成蛋白-去垢劑復(fù)合物，該復(fù)合物可抑制蛋白的聚集，之后，加入環(huán)糊精從復(fù)合體中去除去垢劑，促使蛋白的重折疊。第二十頁，共七十五頁。8減緩蛋白合成速率

降低發(fā)酵溫度、使用弱啟動(dòng)子、降低基因劑量等可避免或減少包含體形成第二十一頁，共七十五頁。十一、基因工程藥物的質(zhì)量控制（一）原材料的質(zhì)量控制（二）培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)（三）純化過程中的質(zhì)量控制（四）目的產(chǎn)品的質(zhì)量控制（五）產(chǎn)品的保存要求第二十二頁，共七十五頁。（一）原材料的質(zhì)量控制1、重組DNA序列的正確性。2、進(jìn)行重組的基因工程菌必須來自單一克隆株。3、所使用的載體、質(zhì)粒必須純正、而且穩(wěn)定。4、應(yīng)明確以下各事項(xiàng)：

（1）目的基因的來源

（2）限制性內(nèi)切酶的種類

（3）載體的名稱和遺傳特性

（4）基因重組的位點(diǎn)圖譜

（5）抗生素標(biāo)記物

（6）宿主細(xì)胞的名稱和來源、傳代歷史

（7）重組染色體的生物特性、拷貝數(shù)、遺傳性

（8）基因表達(dá)所導(dǎo)讀的核苷酸序列

（9）啟動(dòng)克隆基因在工程細(xì)菌中的表達(dá)水平第二十三頁，共七十五頁。（二）培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)1、工程菌菌種純正、穩(wěn)定。2、每一批次的菌種不含致癌基因，無雜菌、病毒、真菌和支原體的污染。3、發(fā)酵生產(chǎn)過程中，工程菌表達(dá)穩(wěn)定。4、生產(chǎn)過程控制微生物污染。5、生產(chǎn)過程保證產(chǎn)量恒定。保證工程菌的穩(wěn)定性，確定細(xì)胞的最高傳種代數(shù)。6、定期檢測(cè)工程菌的載體系統(tǒng)、質(zhì)?？截悢?shù)、載體在工程細(xì)胞內(nèi)是否丟失。第二十四頁，共七十五頁。（三）純化過程中的質(zhì)量控制1、每一批次生產(chǎn)產(chǎn)物的一致性檢驗(yàn)。2、外源蛋白質(zhì)含量限度檢驗(yàn)3、DNA限度檢驗(yàn)4、熱原限度檢驗(yàn)：（1）血清學(xué)檢驗(yàn)（2）鱟試劑（3）兔子熱敏試驗(yàn)第二十五頁，共七十五頁。（四）目的產(chǎn)品的質(zhì)量控制基因工程產(chǎn)品的質(zhì)量控制包括7項(xiàng)指標(biāo)。1、產(chǎn)品鑒別的定性分析2、純度分析3、雜質(zhì)檢測(cè)4、生物活性測(cè)定5、穩(wěn)定性考察6、產(chǎn)品一致性保證7、產(chǎn)品的安全性第二十六頁，共七十五頁。1、產(chǎn)品鑒別的定性分析

重組蛋白質(zhì)藥物常用的鑒定方法:

（1）重組蛋白濃度和相對(duì)分子量的檢測(cè)

（2）特異性檢測(cè)

（3）氨基酸組成（4）高效液相分析法（HPLC）（5）肽圖分析法（6）部分氨基酸序列分析（7）蛋白質(zhì)二硫鍵分析（8）核磁共振（NMR）

第二十七頁，共七十五頁。（1）肽圖分析

通過酶解法、或化學(xué)降解法，對(duì)目的蛋白質(zhì)的每一段肽鏈進(jìn)行結(jié)構(gòu)和成份分析的方法。肽圖分析法是檢測(cè)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)中細(xì)微變化最有效的方法?？勺鳛榛蚬こ坍a(chǎn)品與天然產(chǎn)品之間進(jìn)行精密比較的鑒別手段。方法可采用：

（1）各種高效液相分析法（HPLC）

（2）毛細(xì)管電泳（CE）第二十八頁，共七十五頁。（2）氨基酸成份分析對(duì)構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸單體進(jìn)行測(cè)定的方法。缺點(diǎn)和局限性：

（1）不超過50個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，測(cè)定精度較好。

（2）當(dāng)氨基酸數(shù)量超過100個(gè)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)較大偏差。

（3）相對(duì)分子量越大，其偏差就越嚴(yán)重。

第二十九頁，共七十五頁。（3）部份氨基酸序列分析

氨基酸EdmanN末端序列分析法，可作為蛋白質(zhì)和肽鏈的重要測(cè)定指標(biāo)。第三十頁，共七十五頁。3.2氨基酸組成及順序分析氨基酸組成水解蛋白質(zhì)為氨基酸全自動(dòng)氨基酸分析儀或高效液相色譜進(jìn)行測(cè)定順序分析質(zhì)譜法推定法：從已知基因序列推斷蛋白質(zhì)氨基酸序列化學(xué)法（手工、自動(dòng)）水解法Sanger法、Edman降解法、氨肽酶法肼解法、羧肽酶法第三十一頁，共七十五頁。各類氨基酸自動(dòng)測(cè)序儀第三十二頁，共七十五頁。（4）重組蛋白質(zhì)濃度、相對(duì)分子量測(cè)定

重組蛋白質(zhì)的濃度測(cè)定方法：

（1）凱氏定氮法（蛋白質(zhì)平均含氮量為16﹪，首先測(cè)定氮的含量，進(jìn)而估算蛋白質(zhì)的含量）

（2）雙縮脲法

（3）Bradford法

（4）福林-酚法

（5）紫外分光光度法（芳香族氨基酸在280nm附近有最大光吸收，核酸在260nm附近有最大光吸收）

重組蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量測(cè)定方法：

（1）凝膠過濾法（2）聚丙烯酰胺聚膠電泳法第三十三頁，共七十五頁。電泳法測(cè)定未知蛋白的分子量第三十四頁，共七十五頁。（5）蛋白質(zhì)二硫鍵分析

二硫鍵的巰基與蛋白質(zhì)的生物活性有著密切關(guān)系?；蚬こ坍a(chǎn)物中-S-S-鍵是否正確配對(duì)為一個(gè)重要的問題。測(cè)定方法：

（1）對(duì)氯汞苯甲酸法（PCMB）

（2）5、5-二巰基-雙-2-硝基苯甲酸法（DTNB）第三十五頁，共七十五頁。2、純度分析

目的蛋白質(zhì)含量測(cè)定通常根據(jù)目的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、生物學(xué)特性來進(jìn)行測(cè)定。采用的方法有4項(xiàng)：

（1）聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAEG）

（2）等電點(diǎn)電泳

（3）各種高效液相分析法（HPLC）

（4）毛細(xì)管電泳（CE）第三十六頁，共七十五頁。Isoelectricfocusing第三十七頁，共七十五頁。3、雜質(zhì)檢測(cè)

雜質(zhì)分為2種類型：蛋白質(zhì)雜質(zhì)、非蛋白質(zhì)雜質(zhì)。（1）蛋白質(zhì)雜質(zhì)的主要來源（2）非蛋白質(zhì)雜質(zhì)主要類別（3）常見的雜質(zhì)和污染物、以及檢測(cè)方法第三十八頁，共七十五頁。（1）蛋白質(zhì)雜質(zhì)的主要來源（A）殘余的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)，（B）目的蛋白質(zhì)自身變性、由于蛋白酶引起的降解、由于冷凍脫鹽導(dǎo)致的沉淀、由于凍干引起的聚合。第三十九頁，共七十五頁。（2）非蛋白質(zhì)雜質(zhì)主要類別（A）雜菌污染，通過微生物學(xué)方法來測(cè)定。（B）熱原質(zhì)和內(nèi)毒素，檢測(cè)可用鱟試劑。（C）宿主細(xì)胞所殘余的DNA，一般認(rèn)為DNA殘余含量小于100pg/劑量，是安全的。第四十頁，共七十五頁。（3）常見的雜質(zhì)和污染物、以及檢測(cè)方法

雜質(zhì)和污染物 常用檢測(cè)方法

1：內(nèi)毒素

鱟試劑、家兔熱原法

2：宿主細(xì)胞蛋白質(zhì) 免疫分析、SDS、CE

3：其它蛋白質(zhì)雜質(zhì)（如培養(yǎng)基）免疫分析、SDS、HPLC、CE

4：殘余DNA NA雜交、紫外光譜、蛋白結(jié)合

5：蛋白變異 肽譜、等電點(diǎn)聚焦（IEF）、HPLC、CE

6：甲?；琢虬彼? 肽譜、IEF、HPLC、CE

7：甲硫氨酸氧化 肽譜、氨基酸分析、質(zhì)譜、Edman分析

8：產(chǎn)物變性、聚合、脫氨基 凝膠分子篩、SDS、HPLC、CE

9：?jiǎn)慰寺】贵w親和配基脫落 免疫分析、SDS

10：氨基酸取代 肽譜、氨基酸分析、質(zhì)譜、Edman分析

11：微生物污染物 微生物學(xué)檢查

12：支原體污染物 微生物學(xué)檢查

13：病毒污染物 微生物學(xué)檢查第四十一頁，共七十五頁。4、生物活性測(cè)定（1）免疫測(cè)定法：重組蛋白質(zhì)是一種抗原，均有相應(yīng)的抗體、或單克隆抗體，可用放射免疫分析法、酶標(biāo)免疫法測(cè)定其免疫學(xué)活性。（2）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)法：根據(jù)目的蛋白質(zhì)的生物學(xué)、藥理學(xué)特性，建立動(dòng)物模型，進(jìn)行各種指標(biāo)的測(cè)定。（3）細(xì)胞培養(yǎng)體外效價(jià)評(píng)定法：（A）細(xì)胞培養(yǎng)計(jì)數(shù)法（B）3H-TαR摻入法（C）酶法細(xì)胞計(jì)數(shù)。第四十二頁，共七十五頁。5、穩(wěn)定性考察

這是評(píng)價(jià)藥物有效性、安全性的重要手段。也是藥品貯存條件、使用期限的主要依據(jù)。由于基因工程所生產(chǎn)出一蛋白質(zhì)都是生物活性物質(zhì)，它們對(duì)于溫度、氧化、光照、離子濃度、機(jī)械剪切等環(huán)境因素均十分敏感。常常會(huì)在貯存過程中發(fā)生脫氨、氧化、磺?；⒕酆?、降解等反應(yīng)。穩(wěn)定性試驗(yàn)必須與一致性試驗(yàn)、純度測(cè)定、生物學(xué)效價(jià)試驗(yàn)等結(jié)合起來，進(jìn)行多方面的綜合評(píng)判。才能保證結(jié)果的客觀性。第四十三頁，共七十五頁。6、產(chǎn)品一致性保證

是用來保證每一批生產(chǎn)出的最終產(chǎn)品在安全性、有效、含量、雜質(zhì)限度、穩(wěn)定性等方面都是一致的。只有從原料開始、到生產(chǎn)、到產(chǎn)品形成的每一步驟進(jìn)行嚴(yán)格的工藝要求、并結(jié)合嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)手段，才能保證產(chǎn)品的一致性恒定。第四十四頁，共七十五頁。7、產(chǎn)品的安全性

三致試驗(yàn)：（1）致畸（2）致敏（3）致癌

第四十五頁，共七十五頁。（五）：產(chǎn)品的保存要求1、液態(tài)保存2、固態(tài)保存第四十六頁，共七十五頁。1、液態(tài)保存（1）低溫保存在-10℃到-20℃以下的低溫環(huán)境，可保存蛋白質(zhì)制劑。（2）在穩(wěn)定的pH條件下保存蛋白質(zhì)只有在很窄的pH范圍內(nèi)才能維持穩(wěn)定，即當(dāng)pH=pI（等電點(diǎn)）時(shí)，因此應(yīng)該小心調(diào)整保存蛋白質(zhì)的pH范圍。（3）高濃度保存蛋白質(zhì)在高濃度溶液中比較穩(wěn)定，而在低濃度溶液內(nèi)，常常發(fā)生亞基解離、表面變性。第四十七頁，共七十五頁。（4）真空保存蛋白質(zhì)在真空狀態(tài)、或者在惰性氣體中密閉保存，能抵抗氧化作用。（5）保護(hù)劑保存：（A）某些蛋白質(zhì)在疏水環(huán)境中能夠長(zhǎng)期保存，這類穩(wěn)定劑有糖類、脂肪、蛋白質(zhì)類、多元醇、有機(jī)溶劑。（B）某些蛋白質(zhì)在高離子強(qiáng)度的極性環(huán)境中能長(zhǎng)期保存，這類穩(wěn)定劑有中性鹽類。（C）某些蛋白質(zhì)由于含有半胱氨酸的巰基，容易被氧化，形成次磺酸、和二硫化物，這類穩(wěn)定劑有2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇。第四十八頁，共七十五頁。2、固態(tài)保存--凍干粉保存、結(jié)晶保存

蛋白質(zhì)含水超過10%時(shí)就容易失去活性。含水量下降到5%時(shí)，在室溫、或者冰箱中保存較為穩(wěn)定。但是在37℃時(shí)，活性顯著下降。

固態(tài)蛋白質(zhì)則較穩(wěn)定。最好的方法是將蛋白質(zhì)制成凍干粉、或者結(jié)晶。它們具有很強(qiáng)的抗熱性和穩(wěn)定性，干燥器中在4℃以下，蛋白質(zhì)可保存相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間。第四十九頁，共七十五頁。十二、基因工程藥物的制造實(shí)例

（一）干擾素α-2b（二）基因工程生產(chǎn)人胰島素第五十頁，共七十五頁。（一）干擾素α-2b

根據(jù)分子結(jié)構(gòu)和抗原性差異，干擾素（INF）分為α、β、γ、ω四種類型。又根據(jù)氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)不同將干擾素分為α-1b、α-2a、α-2b等亞型。

1、基因工程菌的組建2、基因工程菌的發(fā)酵生產(chǎn)3、干擾素的制備4、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和具體要求第五十一頁，共七十五頁。1、基因工程菌的組建

人染色體上的干擾素基因只有1.5%，拷貝量極少，所以不能直接從人體的染色體上分離干擾素基因。（1）步驟（2）流程圖

第五十二頁，共七十五頁。(1)步驟

分離人白細(xì)胞干擾素mRNA

↓

將mRNA注射到蟾蜍的卵母細(xì)胞之中

↓

測(cè)定雜合干擾素的活性基因，發(fā)現(xiàn)12S-mRNA的活性最高

↓反轉(zhuǎn)錄酶

以12S-mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成cDNA

↓

將cDNA克隆到含四環(huán)素+氨芐抗性基因的pBR322質(zhì)粒之中

↓

將載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌K-12之中

↓

（1）將每個(gè)克隆用粗得的干擾素mRNA進(jìn)行雜交，

（2）將雜交所得陽性克隆的DNA進(jìn)行再一次重組，

（3）重組的DNA-質(zhì)粒放到無細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)中進(jìn)行試驗(yàn)性翻譯

（4）進(jìn)行多輪篩選最終得到能夠產(chǎn)生干擾素的cDNA。

↓

將cDNA克隆到基因工程菌大腸桿菌之中。

↓

進(jìn)行高效表達(dá)提取分離純化成品第五十三頁，共七十五頁。（2）流程圖[A]、上游工藝流程[B]、下游工藝流程

第五十四頁，共七十五頁。[A]上游工藝流程誘生的白細(xì)胞或者成纖維細(xì)胞提取核酸↓通過寡dT-纖維素柱提取mRNApBR322質(zhì)?！?%-23%蔗糖密度梯度離心提取12S-mRNA

內(nèi)切酶切割↓↓由mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA切割段位于β內(nèi)酰胺基酶基因內(nèi)↓結(jié)果導(dǎo)致內(nèi)酰胺基酶失活，不抗青霉素雙鏈cDNA用末端Pst-I酶切割↓ 再用DNA轉(zhuǎn)移酶接上dT或者dG

在pBR322質(zhì)粒DNA的切割段加上dA或者dC++++++++++++++++

退火獲得雜交質(zhì)粒

↓

轉(zhuǎn)化大腸桿菌K-12

↓篩選能抗四環(huán)素、但對(duì)氨芐青霉素敏感的細(xì)菌克隆株↓

采用雜交翻譯法挑選含有干擾素cDNA的克隆

↓

將干擾素cDNA克隆進(jìn)表達(dá)載體

↓

在大腸桿菌中進(jìn)行高效表達(dá)（進(jìn)入下游工藝）

第五十五頁，共七十五頁。[B]下游工藝流程啟開種子

↓

制備種子液

↓

發(fā)酵培養(yǎng)

↓

粗提

↓

精提

↓

半成品制備

↓

半成品鑒定

↓

分裝

↓

凍干

↓

成品鑒定

↓

成品包裝第五十六頁，共七十五頁。

人干擾素α-2b的基因工程菌為SW-IFNα-2b/E.coli—DH5α。

↓

基因工程菌接種到4個(gè)1000ml三角燒瓶中，每個(gè)燒瓶?jī)?nèi)裝有250ml種子培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)10小時(shí)，作為發(fā)酵罐的種子。

↓

用15L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，裝發(fā)酵培養(yǎng)基10L

↓

攪拌轉(zhuǎn)速500r/min、通氣量為1：1v/v*min、溶氧量為50%

30℃發(fā)酵8小時(shí)（細(xì)菌增殖階段）

42℃誘導(dǎo)2-3小時(shí)（產(chǎn)物生產(chǎn)階段）

↓

[監(jiān)控手段：每隔不同時(shí)間，取2毫升發(fā)酵液，10000r/min離心除去上清液，稱量菌體濕重。]2、基因工程菌的發(fā)酵生產(chǎn)第五十七頁，共七十五頁。3、干擾素的制備

發(fā)酵物4000r/min離心30min，得濕菌，懸浮于20mmol/L磷酸緩沖液（pH7.0）500ml中，冰浴條件下超聲破碎。

↓

4000r/min離心30min，除去上清液。沉淀部分用100ml抽提液室溫條件下，攪拌抽提2小時(shí)，離心30min，取上清液↓

加入0.1mmol/L二巰基蘇糖醇，4℃攪拌15小時(shí)。15000r/min離心30min，除去不溶物。上清液超濾器濃縮

↓

濃縮液用SephadexG50層析柱分離

↓

收集人干擾素α-2b部分，用SDS檢查。再經(jīng)DE-52柱進(jìn)行純化

↓

收集含有收集人干擾素a-2b部分。分裝→凍干→成品鑒定→成品包裝。

第五十八頁，共七十五頁。4、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和具體要求（1）半成品檢定（2）成品檢定第五十九頁，共七十五頁。（1）半成品檢定--13項(xiàng)指標(biāo)1、干擾素效價(jià)測(cè)定:用細(xì)胞病變抑制法，用Wish細(xì)胞、VSV病毒作為基本檢測(cè)系統(tǒng)。2、蛋白質(zhì)含量測(cè)定:用福林-酚法，以中國藥品生物制品檢定所提供的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)作為對(duì)照3、比活性測(cè)定:干擾素效價(jià)國際單位÷蛋白質(zhì)含量的毫克數(shù)4、純度測(cè)定（1）銀染顯色法測(cè)定應(yīng)為單一顯色區(qū)帶，（2）掃描儀測(cè)定純度應(yīng)在95%以上，（3）SDS電泳測(cè)定允許少量聚合體存在，但不超過10%，（4）高效液相色譜測(cè)定應(yīng)呈一個(gè)吸收峰，主峰應(yīng)占峰總面積的95%，（5）GPC柱純度測(cè)定也應(yīng)呈一個(gè)吸收峰狀態(tài)，主峰應(yīng)占峰總面積的95%。第六十頁，共七十五頁。5、相對(duì)分子量測(cè)定:用還原型SDS法，加樣不低于5g，用已知分子量蛋白質(zhì)作對(duì)照，遷移率為橫坐標(biāo)、相對(duì)分子量的對(duì)數(shù)作縱坐標(biāo)，計(jì)算相對(duì)分子量，其誤差不得高于10%。6、殘余外源性DNA含量測(cè)定:用放射性核素或生物素探針法測(cè)定，每劑量中的殘余外源性DNA應(yīng)低于100pg。7、殘余血清IgG含量測(cè)定:用酶標(biāo)免疫測(cè)定法，每劑量（20μg）的鼠IgG含量應(yīng)在100ng以下。8、殘余抗生素活性測(cè)定:凡是菌種傳代中使用過抗生素產(chǎn)物，必須進(jìn)行殘余抗生素活性測(cè)定，半成品中不得檢出殘余抗生素活性。9、紫外光譜掃描:用全自動(dòng)掃描紫外分光光度計(jì)測(cè)定光譜圖，其最大吸收值應(yīng)為280nm±2nm。10、肽圖測(cè)定:用CNBr裂解法測(cè)定，每一批次間應(yīng)保持一致。11、等電點(diǎn)測(cè)定:等電點(diǎn)聚焦電泳法，每一批次間應(yīng)完全一致。12、無菌試驗(yàn):微生物學(xué)檢測(cè)法。13、熱原試驗(yàn):鱟試劑法。第六十一頁，共七十五頁。（2）成品檢定--7項(xiàng)指標(biāo)1、物理性狀:外觀為微黃色疏松體，加注射用蒸餾水后，不得含有肉眼可見的不溶物。2、鑒別試驗(yàn):（1）ELISA試驗(yàn)、（2）中和試驗(yàn)3、水分測(cè)定:用卡氏水分測(cè)定儀，水分含量應(yīng)低于3%。4、無菌試驗(yàn):微生物學(xué)檢測(cè)法。5、熱原質(zhì)試驗(yàn):鱟試劑法。6、干擾素效價(jià)測(cè)定:采用細(xì)胞病變抑制法，用Wish細(xì)胞、VSV病毒為基本檢測(cè)系統(tǒng)。7、安全試驗(yàn):實(shí)驗(yàn)動(dòng)物測(cè)定法：

（1）取體重350-400g豚鼠3只，每只腹側(cè)皮下注射人體臨床允許最大量的3倍劑量，飼養(yǎng)7天，如果豚鼠局部無紅腫、壞死，豚鼠總體重不下降，說明成品合格。

（2）取體重18-20g小鼠5只，每只尾靜脈注射人體臨床允許最大量的3倍劑量，飼養(yǎng)7天，如果小鼠全部存活，說明成品合格。第六十二頁，共七十五頁。（二）基因工程生產(chǎn)人胰島素1982年，美國ElyLiLi公司首先使用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素，成為世界上第一個(gè)上市的基因工程藥物。1987年，Novo公司又推出了利用重組酵母菌生產(chǎn)人胰島素的新工藝。第六十三頁，共七十五頁。SHSHSHSHCCCCCOO_SHSHNCCS.S.Pre-pro-insulinSSSSCCCCCOO_SSCCS-SPro-insulinNSSSSCCCCCOO_CCSSS-SinsulinN第六十四頁，共七十五頁?；蚬こ倘艘葝u素生產(chǎn)工藝（1）A鏈、B鏈分別表達(dá)法（2）人胰島素原表達(dá)法（3）分泌型人胰島素原表達(dá)法第六十五頁，共七十五頁?；蚬こ叹臉?gòu)建戰(zhàn)略：化學(xué)合成A鏈和B鏈的編碼序列表達(dá)重組人胰島素的大腸桿菌工程菌的構(gòu)建A鏈和B鏈分別表達(dá)法1synthesis第六十六頁，共七十五頁。

表達(dá)產(chǎn)物后的處理路線：第六十七頁，共七十五頁。由于A鏈和