模塊三中藥化學(xué)成分的色譜分離技術(shù)

模塊三中藥化學(xué)成分的色譜分離技術(shù)

1906年，俄國植物學(xué)家Tswett

目的：分離植物色素

過程：將植物綠葉的石油醚提取液倒入玻璃管中，并用石油醚不斷淋洗，逐漸形成色帶，各色素成分被分離

命名：分離方法為“色譜法”

稱：玻璃管“色譜柱”

稱：碳酸鈣“固定相”

稱：石油醚“流動(dòng)相”

石油醚植物色素分離圖示

色譜分離法又稱層析分離法：即是利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)（分子的形狀和大小，分子的極性，吸附力，分子的親和力，分子的分配系數(shù)等）的不同，使各組分以不同程度分布在兩相中，其中一相是固定的，稱固定相；另一相是流動(dòng)的，稱流動(dòng)相。當(dāng)流動(dòng)相流過固定相時(shí)，各組分以不同的速度移動(dòng)，而達(dá)到分離。分類按流動(dòng)相分氣相色譜液相色譜超臨界流體色譜按機(jī)理分吸附色譜分配色譜離子交換色譜凝膠色譜

分類吸附色譜——利用固定相中吸附劑表面對(duì)各組分不同的物理吸附能力(氣—固色譜）分配色譜——不同組分在兩相中有不同的分配系數(shù)(氣—液色譜)離子交換色譜——利用離子交換原理(離子色譜)凝膠色譜——利用多孔性物質(zhì)對(duì)不同大小分子的排阻作用(液相色譜)一、吸附色譜法當(dāng)溶液中某組分的分子在運(yùn)動(dòng)中碰到一個(gè)固體表面時(shí)，分子會(huì)貼在固定表面上，這就發(fā)生了吸附作用。1.分離原理各組分與流動(dòng)相分子爭奪吸附劑表面活性中心,利用吸附劑對(duì)不同組分的吸附能力差異而實(shí)現(xiàn)分離.經(jīng)過吸附、解吸、再吸附、再解吸……最后混合物得到分離.

2.固定相及其選擇

固定相是表面具有許多吸附中心的吸附劑，常用吸附劑硅膠表面的硅醇基為吸附中心。經(jīng)典液相柱色譜和薄層色譜使用一般硅膠。（1）對(duì)吸附劑的要求

①有大的表面積和足夠的吸附能力；②對(duì)不同的化學(xué)成分有不同的吸附力，能較好地把混合物分開；③與流動(dòng)相、溶劑及樣品中各成分不起化學(xué)反應(yīng)；④在所用的溶劑及流動(dòng)相中不溶解；⑤顆粒均勻，操作過程中不會(huì)碎裂。（2）吸附劑的類別①有機(jī)類淀粉、葡萄糖、聚酰胺、纖維素等②無機(jī)類氧化鋁、硅膠、活性炭、碳酸鈣、硅藻土等（3）吸附劑的活度因含水使吸附劑活度，含水量，活性(活度)級(jí)別，活性（4）吸附劑的選擇a硅膠：為首選吸附劑。本身具微酸性，適用于分離酸性及中性物質(zhì)，如有機(jī)酸、氨基酸、甾體等。b氧化鋁：氧化鋁具有分離能力強(qiáng)、活性可以控制等優(yōu)點(diǎn)。

堿性氧化鋁

pH9～10適于分析堿性、中性物質(zhì)中性氧化鋁

pH7.5適于分析酸性堿性和中性物質(zhì)酸性氧化鋁

pH4～5適于分析酸性、中性物質(zhì)C聚酰胺:氫鍵作用,氫鍵能力↑強(qiáng)，組分越后出柱（p34）

分離極性小的物質(zhì)，一般選用活性大些的吸附劑；反之，分離極性大的物質(zhì)，選用活性小的吸附劑。3.流動(dòng)相及其選擇（1）要求

①應(yīng)使用較純?cè)噭?，含雜質(zhì)會(huì)影響洗脫能力②與樣品或吸附劑不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)③能溶解樣品中各成分，且各被分離組分有不同的K值④粘度小，易流動(dòng)（2）流動(dòng)相流動(dòng)相的洗脫能力主要由其極性決定，極性強(qiáng)的流動(dòng)相分子占據(jù)極性中心的能力強(qiáng)，洗脫能力就強(qiáng)。流動(dòng)相的選擇要依據(jù)樣品的極性、吸附劑的活性而定。（3）常用溶劑的極性

石油醚<環(huán)己烷<二硫化碳<四氯化碳<三氯乙烷<苯<甲苯<二氯甲烷<乙醚<氯仿<乙酸乙酯<正丁醇<丙酮<乙醇<甲醇<吡啶<酸<水（4）流動(dòng)相的選擇用硅膠或氧化鋁作色譜分離時(shí)，如被測(cè)成分極性較大，用活性較低的吸附劑，極性較大的沖洗劑；被測(cè)成分極性較小，選用活性較強(qiáng)的吸附劑，極性較小的沖洗劑4.洗脫順序

吸附弱的組分先被洗脫，吸附強(qiáng)的組分后被洗脫。吸附的強(qiáng)弱與組分的性質(zhì)(極性、取代基的類型和數(shù)目、構(gòu)型）有關(guān)。一般規(guī)律是：①非極性化合物，吸附弱。②基本母核相同，分子中取代基的極性越強(qiáng)，或極性基團(tuán)越多，分子極性越強(qiáng)(但要考慮其他因素的影響)，吸附能力越強(qiáng)。③分子中雙鍵數(shù)越多，則吸附力越強(qiáng)。④能形成分子內(nèi)氫鍵的化合物，其吸附能力降低。

常見化合物的吸附能力的順序如下：

烷烴(-CH3、-CH2-)<烯烴(-CH=CH-)<醚類(-OCH3)<硝基化合物(-NO2)<二甲胺(-N(CH3)2)<酯類(-COOR)<酮類(>C=O)<醛類(-CHO)<硫醇(-SH)<胺類(-NH2)<酰胺(-NHCOCH3)<醇類(-OH)<酚類(Ar-OH)<羧酸類(-COOH)薄層色譜法

薄層色譜是在平面上進(jìn)行分離的一種方法，又叫平面色譜法。通常將固定相(吸附劑)均勻地涂鋪在表面潔凈的玻璃、塑料或金屬板形成薄層，制成薄板，進(jìn)行樣品分離。(一)吸附色譜分離原理利用吸附劑對(duì)不同成分吸附力的大小及展開劑解吸附作用的差異進(jìn)行分離。吸附牢的組分隨展開劑移動(dòng)慢，吸附弱的組分隨展開劑移動(dòng)快，一段時(shí)后，組分被分離。固定相:固體吸附劑流動(dòng)相:液體展開劑一、基本原理溶劑

前沿起始線ABabc（1）比移值Rf：Rf是薄層色譜法基本定性參數(shù)，一定條件時(shí)Rf為定值，在0～1之間，可用范圍Rf值在0.2～0.8之間。組分極性越大，Rf越小,反之越大。（二）比移值與相對(duì)比移值硅膠、氧化鋁薄層：被分離物質(zhì)極性越大，越易被吸附。一般規(guī)律：（1）官能團(tuán)極性越大，整個(gè)分子極性越大，越易被吸附；（2）形成分子內(nèi)H鍵時(shí)，被吸附力減弱；（3）同系物中，分子量越大，極性越小，被吸附力越弱。被分離物質(zhì)極性與吸附能力的關(guān)系硅膠薄層色譜規(guī)律總結(jié)被分離組分展開劑Rf被分離物洗脫順序極性大極性大小后洗脫極性小極性小大先洗脫（1）軟板的制備軟板：直接將吸附劑鋪在玻璃板上制成，不加粘合劑要求：厚度→隨分離要求而定，一般0.25～0.5mm

玻璃棒推動(dòng)速度不宜過快、也不應(yīng)停頓→影響厚度均一性操作步驟2、點(diǎn)樣（1）樣品溶液的制備：

2、點(diǎn)樣（2）點(diǎn)樣量：

與薄層板的關(guān)系太多太少的影響點(diǎn)樣基線：距底邊2.0cm樣點(diǎn)直徑：2-4mm點(diǎn)間距離：1.5-2.0cm2、點(diǎn)樣（3）點(diǎn)樣方法：

劃線、樣品記號(hào)點(diǎn)、點(diǎn)樣

注：動(dòng)作要輕，毛細(xì)管或點(diǎn)樣器不能混用，斑點(diǎn)大小適當(dāng)，可多次點(diǎn)樣。平頭50ul微量點(diǎn)樣器全自動(dòng)點(diǎn)樣儀3、展開展開缸（色譜缸）3、展開（1）展開方式：a、近水平展開特點(diǎn)：速度快、適用于軟板的展開。3、展開（1）展開方式：b、上行展開

過程：預(yù)飽和、展開、標(biāo)記溶劑前沿4、顯色和定位一般規(guī)律：日光下觀察、紫外燈下觀察、加顯色劑加顯色劑：多噴霧，軟板使用浸漬顯色法紫外燈觀察噴顯色劑觀察判斷依據(jù)：Rf值四、結(jié)果計(jì)算和判斷二、分配色譜法1.分離原理：將液體均勻地涂漬在惰性物質(zhì)(載體)表面上作為固定相，利用被分離組分在固定相與流動(dòng)相中的溶解度差別所造成的分配系數(shù)差別而被分離。2.固定相和流動(dòng)相要求：固定相→機(jī)械吸附在惰性載體上的液體,常用的固定液有水、稀硫酸、甲醇、甲酰胺等強(qiáng)極性溶劑

載體→惰性物質(zhì)，無吸附性性質(zhì)穩(wěn)定，不與固定相和流動(dòng)相發(fā)生化學(xué)反應(yīng)常用的有吸水硅膠、纖維素、多孔硅藻土等。流動(dòng)相→必須與固定相不為互溶石油醚、醇類、酮類、酯類、鹵代烷及苯等。3.洗脫順序

正相色譜

固定相極性大于流動(dòng)相極性,主要分離極性樣品.極性弱的組分先被洗脫，極性強(qiáng)的組分后被洗脫。

反相色譜

固定相極性小于流動(dòng)相極性,主要分離非極性樣品和中等極性樣品.極性強(qiáng)的組分先出柱，極性弱的組分后出柱。紙色譜法

定義：

紙色譜分離法又稱紙層析法，是根據(jù)不同物質(zhì)在兩相中的分配比不同而進(jìn)行分離的一種微量分離方法。載體——層析紙（濾紙）；固定相——濾紙上的吸濕水分；流動(dòng)相——有機(jī)溶劑（展開劑）。實(shí)驗(yàn)步驟點(diǎn)樣展開分離顯色計(jì)算比移值實(shí)驗(yàn)原理分離示意圖AB上行法實(shí)驗(yàn)原理原點(diǎn)展開后斑點(diǎn)溶劑前沿a1a2bAB實(shí)驗(yàn)原理RF:

通常用比移值RF衡量各組分的分離程度：RF:0～1。

RF值相差越大，分離效果越好。實(shí)驗(yàn)原理RF：物質(zhì)定性分析的依據(jù)。在進(jìn)行分析工作時(shí)，可使用各組分相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)樣品同時(shí)作對(duì)照實(shí)驗(yàn)。影響因素：主要是展開劑、濾紙質(zhì)量、溫度等實(shí)驗(yàn)條件。本實(shí)驗(yàn)分離和鑒定的氨基酸混合液：異亮氨酸、賴氨酸和谷氨酸。氨基酸是無色的，在層析后需在紙上噴灑顯色劑茚三酮，斑點(diǎn)呈現(xiàn)藍(lán)紫色。儀器試劑

主要儀器：（1）玻璃層析筒150mm×300mm(φ×h)。（2）層析紙條100mm×240mm。（3）毛細(xì)管直徑1mm左右。（4）噴霧器儀器試劑主要試劑：（1）展開劑正丁醇:甲酸:水＝60:12:8。（2）氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液2g·L-1水溶液。（3）茚三酮1g·L-1乙醇溶液。（4）氨基酸混合試液將（2）配制的三種氨基酸等量混合。實(shí)驗(yàn)步驟點(diǎn)樣展開分離顯色計(jì)算比移值實(shí)驗(yàn)步驟

——點(diǎn)樣2.0cm2.0cm1234異亮氨酸賴氨酸谷氨酸混合液各點(diǎn)φ≈2mm實(shí)驗(yàn)步驟

——展開分離展開劑濾紙下端浸入展開劑約0.5cm，計(jì)時(shí)。一段時(shí)間后，前沿上升15cm左右記下展開停止時(shí)間和位置實(shí)驗(yàn)步驟

——展開分離取出層析紙，畫出溶劑前沿晾干或烘干展開劑實(shí)驗(yàn)步驟

——顯色在層析紙上均勻噴灑顯色劑l00℃烘箱中，烘3～5min實(shí)驗(yàn)步驟

——計(jì)算RF用鉛筆描出各斑點(diǎn)的輪廓ba1a2a3數(shù)據(jù)處理

（1）計(jì)算RF。（2）定性分析。三、聚酰胺吸附色譜法聚酰胺：固定相流動(dòng)相（3）吸附規(guī)律：

[1]形成氫鍵基團(tuán)數(shù)目越多，則吸附能力越強(qiáng)

[2]形成氫鍵基團(tuán)位置不同，被吸附的強(qiáng)度也不同

[3]分子芳香核、共軛雙鍵越多，吸附越牢

[4]化合物形成分子內(nèi)氫鍵，則被吸附的強(qiáng)度減小

[5]與溶劑介質(zhì)有關(guān).形成氫鍵能力:

水中最強(qiáng),堿中最弱四、離子交換色譜法要求：固定相→離子交換樹脂流動(dòng)相→水為溶劑的緩沖溶液被分離組分→離子型的有機(jī)物或無機(jī)物1.分離原理陽離子交換樹脂

RSO3-H++X+→RSO3-X++H+

固定離子可交換離子待測(cè)離子依據(jù)被測(cè)組分與離子交換劑交換能力（親和力）不同而實(shí)現(xiàn)分離離子交換的基本過程：2.固定相和流動(dòng)相

固定相是離子交換劑

——常見的是離子交換樹脂，是具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)高分子的聚合物。如，苯乙烯和二乙烯苯聚合，其中二乙烯苯是交聯(lián)劑。流動(dòng)相——水、緩沖溶液、或加入少量的乙醇、四氫呋喃、乙腈等有機(jī)溶劑，提高選擇性五、凝膠色譜法凝膠色譜是基于分子大小不同而進(jìn)行分離的一種分離技術(shù)（分子篩）。它具有一系列優(yōu)點(diǎn)：操作方便、不會(huì)使物質(zhì)變性、適用于不穩(wěn)定的化合物、凝膠不用再生、可反復(fù)使用。缺點(diǎn)：分離速度較慢。凝膠過濾層析過程示意圖小分子大分子凝膠基質(zhì)凝膠珠六、其他色譜法（一）大孔樹脂色譜法吸附原理——范德華引力＋分子篩大孔樹脂具有吸附性及分子篩的雙重作用，可分離天然藥物中相對(duì)分子量大小及吸附力強(qiáng)弱不同的化學(xué)成分分離。

（二）氣相色譜法

用氣體作為移動(dòng)相的色譜法。根據(jù)所用固定相的不同可分為兩類：固定相是固體的，稱為氣固色譜法；固定相是液體的則稱為氣液色譜法。高效液相色譜法(highpressureLiquidchroma