植物脫毒檢測(cè)方法

《薯類種子種苗生產(chǎn)技術(shù)》植物脫毒檢測(cè)方法目錄CONTENTS一二直觀檢測(cè)法指示植物檢測(cè)法三抗血清檢測(cè)法四電子顯微鏡檢查法五分子生物學(xué)鑒定法一、直觀檢測(cè)法直接觀察植株生長(zhǎng)狀態(tài)是否異常，莖葉上有無(wú)特定病毒可見癥狀，從而可判斷病毒是否存在。如矮縮病毒引起寄主植物葉片腿綠、壞死、扭曲、植株矮縮，花葉病毒引起寄主植物葉片脈間失綠等。簡(jiǎn)便、直觀、準(zhǔn)確。二、指示植物檢測(cè)法（一）概念1.指示植物對(duì)某種或某幾種病毒及類似病原物或株系具敏感反應(yīng)并表現(xiàn)明顯癥狀的植物稱為指示植物，又稱鑒別寄主。2.指示植物檢測(cè)法是利用病毒在植物體上產(chǎn)生的枯斑作為鑒別病毒種類的依據(jù)，也叫枯斑測(cè)定法。煙草千日紅二、指示植物檢測(cè)法（二）檢測(cè)方法1.汁液涂抹法待鑒試管苗取幼葉1~3g加水和磷酸緩沖液研磨紗布過(guò)濾指示植物上涂一薄層金剛砂手指蘸濾液摩擦5min后沖去葉面汁液和金剛砂至于溫室中2~6天觀察沒(méi)有出現(xiàn)不含病毒出現(xiàn)枯斑有病毒二、指示植物檢測(cè)法（二）檢測(cè)方法1.汁液涂抹法二、指示植物檢測(cè)法（二）檢測(cè)方法2.嫁接法適用于木本多年生果樹和草莓、甘薯等無(wú)性繁殖的草本植物，采用汁液接種法比較困難，通常采用嫁接接種的方法，以指示植物作砧木，被檢測(cè)植物作接穗，可采用劈接、靠接、芽接等方法嫁接。二、指示植物檢測(cè)法（三）對(duì)指示植物的要求1.應(yīng)根據(jù)不同的病毒選擇適合的指示植物。2.所選指示植物一年四季都容易栽培。3.能夠在較長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)保持對(duì)病毒的敏感性。4.容易接種。5.較廣的范圍內(nèi)具有同樣的反映。二、指示植物檢測(cè)法（四）指示植物檢測(cè)法的優(yōu)缺點(diǎn)1.優(yōu)點(diǎn)：條件簡(jiǎn)單，操作方便，是一種經(jīng)濟(jì)有效的檢測(cè)方法，所以大多數(shù)植物檢測(cè)用指示植物檢測(cè)法。2.缺點(diǎn)：不能測(cè)出病毒總的核蛋白濃度，而只能測(cè)出病毒的相對(duì)感染力。三、抗血清檢測(cè)法（一）概念抗體是動(dòng)物在外來(lái)抗原的刺激下產(chǎn)生的一種免疫球蛋白，抗體主要存在于血清中，含有抗體的血清即稱為抗血清。不同病毒產(chǎn)生的抗血清都有各自的特異性，因此抗血清在病毒的檢測(cè)中成為一種高度?；缘脑噭?，其特異性高，檢測(cè)速度快，一般幾小時(shí)甚至幾分鐘可以完成。三、抗血清檢測(cè)法（二）檢測(cè)方法1.抗原的制備：病毒的接種繁殖→病葉的研磨→病毒的提純。2.抗血清的制備：動(dòng)物的選擇和飼養(yǎng)→抗原的注射→抗血清的采集（采血）→抗血清的分離→抗血清的保藏。3.抗血清檢測(cè)（免疫反應(yīng)）：（1）葉綠體凝聚法

采用待檢植物葉片提取液與專一抗血清發(fā)生凝結(jié)反應(yīng)檢測(cè)植物病毒，如煙草花葉病毒，馬鈴薯Y病毒等長(zhǎng)形病毒。三、抗血清檢測(cè)法（二）檢測(cè)方法3.抗血清檢測(cè)（免疫反應(yīng)）：（2）試管沉淀法即各種稀釋的抗血清與病毒抗原在小試管中混合反應(yīng)而產(chǎn)生沉淀，是常用的病毒檢測(cè)方法之一。長(zhǎng)形病毒形成絮狀沉淀，球形病毒形成濃密粒狀沉淀。（3）環(huán)形接口法在毛細(xì)管或細(xì)長(zhǎng)玻管中，抗原抗體通過(guò)擴(kuò)散結(jié)合。病毒抗原位于上部呈層狀，少量抗血清向毛細(xì)管滲入，至達(dá)到足夠的抗原/抗體比率時(shí)，在該區(qū)域產(chǎn)生可見沉淀物。此法簡(jiǎn)單快速。三、抗血清檢測(cè)法（二）檢測(cè)方法3.抗血清檢測(cè)（免疫反應(yīng)）：（4）酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）基本原理是用化學(xué)處理方法將酶與抗體（或抗原）結(jié)合，制成酶標(biāo)抗體（原），這些酶標(biāo)記物仍保持其免疫活性，能與相應(yīng)抗體或抗原特異結(jié)合形成酶標(biāo)記免疫復(fù)合物，遇相應(yīng)底物時(shí)，免疫復(fù)合物上的酶催化無(wú)色的底物，降解生成有色產(chǎn)物或沉淀物，前者可用比色法定量測(cè)定，后者可肉眼觀察或通過(guò)光學(xué)顯微鏡識(shí)別。三、抗血清檢測(cè)法（三）抗血清檢測(cè)法的優(yōu)缺點(diǎn)1.優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)，靈敏度高；操作簡(jiǎn)便、安全、快速；無(wú)需特殊儀器設(shè)備，結(jié)果容易判斷；可同時(shí)檢測(cè)大量的樣品。2.缺點(diǎn)：抗血清來(lái)源困難，成本高，常規(guī)檢測(cè)應(yīng)用較少。四、電子顯微鏡檢查法采用電子顯微鏡法鑒定病毒，直接觀察有無(wú)病毒顆粒存在，并觀察有關(guān)病毒顆粒大小、形狀和結(jié)構(gòu)，由于這些特征穩(wěn)定，對(duì)病毒鑒定有很大的作用。這種檢測(cè)方法，需要一定的設(shè)備，常規(guī)檢測(cè)應(yīng)用較少。

ISEM：把電鏡檢測(cè)與血清學(xué)方法結(jié)合建立了免疫吸附電鏡檢測(cè)法（ISEM）。ISEM具有更高靈敏度并能測(cè)定植物粗提取液中的病毒。五、分子生物學(xué)鑒定法1.雙鏈RNA法在受RNA病毒侵染的植物體內(nèi)，有相應(yīng)復(fù)制形式的雙鏈RNA（dsRNA）存在，而在健康植株中未發(fā)現(xiàn)病毒的dsRNA。通過(guò)提取純化待測(cè)植物RNA，并對(duì)其進(jìn)行電泳分析，可確定有無(wú)dsRNA存在，從而判斷待檢植物是否帶病毒。五、分子生物學(xué)鑒定法2.互補(bǔ)DNA（cDNA）檢測(cè)法用互補(bǔ)DNA（cDNA）檢測(cè)病毒的方法又稱DNA分子雜交法。根據(jù)堿基互補(bǔ)原理，人工合成能與病毒堿基互補(bǔ)的DNA（cDNA）即cDNA探針，用cDNA探針與從待檢植物中提取的RNA進(jìn)行DNA－