氨基酸總量的測定3

《生物產(chǎn)品的分析與檢驗(yàn)技術(shù)》項(xiàng)目六氨基酸的分析與檢驗(yàn)任務(wù)一氨基酸總量的測定氨基酸是是一切生命活動(dòng)不可缺少的有機(jī)物質(zhì)。在自然界中，組成蛋白質(zhì)的氨基酸共有20種，除甘氨酸外，所有組成蛋白質(zhì)的天然氨基酸都是L-α-氨基酸，其中8種為必需氨基酸。氨基酸對生物化學(xué)和整個(gè)生命科學(xué)研究以及產(chǎn)品開發(fā)、質(zhì)量控制和生產(chǎn)管理等具有重要意義。本項(xiàng)目主要學(xué)習(xí)氨基酸總量、谷氨酸和賴氨酸的測定方法。1.原理氨基酸在一定pH范圍內(nèi)，能與茚三酮生成藍(lán)紫色化合物，可以通過比色法定量測定氨基酸總量。

三、茚三酮比色法任務(wù)一氨基酸總量的測定2.試劑與儀器■

磷酸鹽緩沖液（pH8.04）:稱取磷酸二氫鉀（KH2PO4）4.5350g,定容；稱取磷酸二氫鈉(NaH2PO4﹒12H2O)11.9380g溶解定容500mL;稱取磷酸二氫鉀（KH2PO4）10mL與磷酸二氫鈉(NaH2PO4)190mL混合即為pH8.04的緩沖液。

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20g/L茚三酮溶液：稱取茚三酮1g，溶于35mL熱水后，加入40mg氯化亞錫（SnCl﹒H2O）攪拌過濾（防腐劑），濾液放置于冷暗處過夜，定容500mL?！霭被針?biāo)準(zhǔn)溶液：稱取干燥氨基酸0.2000g,溶解定容至100mL，搖勻，吸10mL于另外100mL容量瓶定容，配制成200mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液?！龇止夤舛扔?jì)3.操作步驟（1）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

取7個(gè)25mL容量瓶，準(zhǔn)確吸取200mg/mL氨基酸標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL分別放入25mL容量瓶中，各加水補(bǔ)充至體積為4.0mL，然后加茚三酮和磷酸鹽緩沖液各lmL，充分混勻。然后水浴加熱15min，速冷卻至室溫后定容至25mL，靜置15min。在570nm波長下，以試劑空白為參比液測定其余各溶液的吸光度A。以氨基酸的含量為橫坐標(biāo)，以吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。三、茚三酮比色法3.操作步驟（2）樣品的測定

稱取樣品5.00～10.00g(液體樣5～10mL)放入燒杯，后加入50mL水和約5g的活性炭，加熱煮沸過濾。用30～40mL熱水洗滌活性炭，吸澄清樣液1～4mL，加入茚三酮和磷酸鹽緩沖液各1mL，水浴加熱15min，冷卻定容，靜置15min。在570nm下測定吸光度A值，用測得的A值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查得對應(yīng)的氨基酸含量。三、茚三酮比色法4.結(jié)果計(jì)算按下式計(jì)算氨基酸含量：其中w——氨基酸含量，mg／100gm1——從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得氨基酸的量，μgm——測定得樣品溶液相當(dāng)于樣品的量，g100——將mg／g換算為mg／100g的系數(shù)10-3——將μg換算為mg的系數(shù)三、茚三酮比色法標(biāo)液體積（

/mL

）溶液中氨基酸含量（

μg/mL

）吸光度A00.51.01.52.02.53.0三、茚三酮比色法

5.結(jié)果記錄(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制測定內(nèi)容數(shù)據(jù)記錄吸光度A從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得氨基酸的量/

μg樣品的量/

g樣品氨基酸含量/

mg/(100g)三、茚三酮比色法

5.結(jié)果記錄(2)氨基酸總量的測定6.注意事項(xiàng)

◆茚三酮受陽光、溫度、濕度、空氣等影響而容易被氧化呈淡紅色或深紅色，使用前需要進(jìn)行純化，方法如下：取10g茚三酮溶于40mL熱水中，再加入lg活性炭，搖勻靜置30min后過濾。將濾液放人冰箱中過夜，即出現(xiàn)藍(lán)色結(jié)晶，過濾，用2mL