核酸提取常見試劑的作用原理復習課程

核酸提取常見試劑的作用原理精品資料異硫氰酸胍強用力的蛋白質變性劑，能迅速溶解蛋白質，導致細胞結構破碎，核蛋白由于其二級結構的破壞消失而迅速與核酸分離。胍鹽是破壞蛋白質三維結構的離液劑，在通常使用的蛋白質變性劑中作用最強的是異硫氰酸胍，它們可以使多數(shù)蛋白質轉換成一隨機的卷曲狀態(tài)。含有強力的陰離子和陽離子基團，它們可以形成較強的氫鍵。在還原劑存在的情況下，異硫氰酸胍可以斷裂氫鍵，而去垢劑，如SDS存在的情況下，可以破壞疏水作用。鹽酸胍、尿素鹽酸胍是一個核酸酶的強抑制劑，它并不是一種足夠強的變性劑，可以允許完整的RNA從富含RNase的組織中提取出來。4-8M可斷裂氫鍵，有兩種可能機制： 1變性蛋白和鹽酸胍、尿素優(yōu)先結合，形成變性蛋白-變性劑復合物，當復合物被除去，從而引起N-D反應平衡向右移動，隨著變性劑濃度增加，天然狀態(tài)的蛋白不斷轉變?yōu)閺秃衔铮罱K導致蛋白質完全變性；2鹽酸胍、尿素對氨基酸的增溶作用，能形成氫鍵，當濃度高時，能破壞水的氫鍵結構，結果鹽酸胍、尿素就稱為非極性殘基的較好溶劑，使蛋白質內部的疏水殘基伸展和溶解性加強，鹽酸胍、尿素引起的變性往往是不可逆的。高濃度尿素使蛋白質變性并抑制 Rnase活性十二烷基肌氨酸鈉使蛋白質解體 變性巰基試劑1防止蛋白質或酶等（如輔酶A）分子中SH基團氧化成二硫鍵，2在某些酶反應過程中維持體系的還原環(huán)境。DTT，DDTE、巰基乙醇應用最廣，谷胱甘肽也常應用，由于他是生物體內的還原劑，同時氧化后能被谷胱甘肽還原酶原位釋放。 DNA提取中，常使用巰基乙醇，維持緩沖液的還原環(huán)境，防止多酚類氧化，由于具有一定的毒性，濃度不應高于 2%。巰基乙醇-巰基乙醇的主要作用是破壞RNase蛋白質中的二硫鍵（肽和蛋白質分子中的半胱氨酸殘基中的鍵）。僅供學習與交流，如有侵權請聯(lián)系網站刪除 謝謝2精品資料1還原蛋白質二硫鍵，使 Rna酶變性抑制酚類氧化，若氧化，核酸會變成灰黑色，苯酚的氧化產物苯醌等氧化物引起磷酸二酯鍵的斷裂及導致 RNA和DNA的交聯(lián)3保護蛋白質的巰基 蛋白質提取中需要巰基乙醇還原二硫鍵，使 RNA酶失活化學變性劑SDS、尿素、鹽酸胍能破壞疏水鍵、鹽鍵、氫鍵、范德華力使蛋白質變性但不影響肽鍵和二硫鍵，不能使蛋白質徹底變性加上還原劑巰基乙醇或 DTT，能還原二硫鍵，使 RNA徹底變性DTT二硫蘇糖醇刺激性氣味要小很多，毒性也比巰基乙醇低很多。而且 DTT比巰基乙醇的濃度低7倍時，兩者效果相近，但 DTT價格略高一些。由于容易被空氣氧化，因此DTT的穩(wěn)定性較差；但冷凍保存或在惰性氣體中處理能夠延長它的使用壽命。由于質子化的硫的親核性較低，隨著 pH值的降低，DTT的有效還原性也隨之降低；DTT或含有DTT的溶液不能進行高壓處理。抑制Rnase活性TCEP三(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽半胱氨酸Trizol苯酚、異硫氰酸胍、8－羥基喹啉、β-巰基乙醇等。TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解細胞，使細胞中的蛋白，核酸物質解聚得到釋放。苯酚雖可有效地變性蛋白質，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中還加入了8－羥基喹啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇等來抑制內源和外源RNase（RNA酶）。0.1%的8－羥基喹啉可以抑制 RNase，與氯仿聯(lián)合使用可增強抑制作用。僅供學習與交流，如有侵權請聯(lián)系網站刪除 謝謝3精品資料異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強力的蛋白質變性劑，可溶解蛋白質并使蛋白質二級結構消失，導致細胞結構降解，核蛋白迅速與核酸分離。β-巰基乙醇的主要作用是破壞RNase蛋白質中的二硫鍵。液氮組織破碎，裂解細胞SDS十二烷基硫酸鈉陰離子去垢劑，高溫（55-65℃）裂解細胞，使染色體離析，蛋白變性，形成SDS/蛋白質/多糖復合物，釋放核酸，提高鹽（ KAc或NaAc）濃度并降低溫度（冰浴），使SDS/蛋白質/復合物轉變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}酸形式，使蛋白質及多糖雜質沉淀更加完全、離心后除去沉淀，上清液中的 DNA用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀水相中的 DNA操作簡單，溫和，可提取到高分子量的 DNA，但產物多糖類雜質較多陽離子強表面活性劑，通常與蛋白酶 K和抗氧化劑、螯合劑一起使用可破壞細胞膜、核膜，并使組織蛋白與 DNA分離溶解膜類蛋白SDS能裂解細胞。使細胞中的蛋白質和核酸之間常借著靜電引力或配位鍵結合，陰離子去污劑能夠破壞這種價鍵，使 染色體離析，蛋白變性，釋放核酸。1）SDS是一種陰離子表面活性劑，能使蛋白質的氫鍵和疏水鍵打開，并結合到蛋白質的疏水部位;2）SDS可引起蛋白質構象改變3）SDS是一種良好的解離劑，可使蛋白質溶解，變性4）形成SDS-蛋白質復合物，并使復合物帶負電僅供學習與交流，如有侵權請聯(lián)系網站刪除 謝謝4精品資料質粒方面：在1％的SDS溶液中慢慢加入 5N的NaCl，你會發(fā)現(xiàn)SDS在高鹽濃度下是會產生沉淀的。因此高濃度的鹽導致了 SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你會發(fā)現(xiàn)沉淀的量要多的多。這其實是十二烷基硫酸鈉（sodiumdodecylsulfate）遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀 （potassiumdodecylsulfate,PDS），而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。如此看來，溶液加入后的沉淀實際上是鉀離子置換了SDS中的納離子形成了不溶性的PDS，而高濃度的鹽，使得沉淀更完全。大家知道SDS專門喜歡和蛋白質結合，平均兩個氨基酸上結合一個SDS分子，鉀鈉離子置換所產生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質沉淀了，讓人高興的是大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了?；蚪MDNA一旦發(fā)生斷裂，只要是50－100kb大小的片斷，就沒有辦法再被PDS共沉淀了CTABCTAB：十六烷基三甲基溴乙胺，低溫時易沉淀陽離子去污劑一種在高鹽下能和核酸結合形成可溶、穩(wěn)定的復合物，低鹽濃度下可沉淀的表面活性劑是一種陽離子去污劑,低離子強度（0.1-0.5MNaCl），沉淀核酸與酸性多聚糖，而蛋白質和中性多聚糖仍留在溶液中。在高離子強度的溶液中 (>0.7mol/LNaCl)，CTAB與蛋白質和多聚糖形成復合物，只是不能沉淀核酸。通過有機溶劑抽提，去除蛋白，多糖，酚類等雜質后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。僅供學習與交流，如有侵權請聯(lián)系網站刪除 謝謝5精品資料CTAB

可從大量產生黏多糖的植物及某些革蘭氏陰性菌制備純化的

DNA，這種去污劑加入調節(jié)至高離子強度的細菌和細胞裂解液中（＞

0.7MNaCl），經過連續(xù)的酚/氯仿抽提，去除CTAB/黏多糖/蛋白質復合體，異丙醇/無水乙醇沉淀上清即可將DNA分離出來CTAB還有提高DNA互補鏈復性速率及穩(wěn)定已形成的 DNA雙螺旋的作用CTAB法的主要特點是用用較廣CTAB溶液在低于15度會形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的植物材料時，必須預熱，且離心溫度不低于 15度EDTA酶抑制劑，螯合二價金屬，抑制金屬依賴性的酶螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制細胞中 DNase的活性，該酶可降解 DNAEDTA是去垢劑，結合離子用，而它結合的部分離子是能夠誘發(fā)或者促進 RNA酶活性的，比如 Ca2+。EDTA是一種二價離子熬合劑,能熬合Mg2+和Ca2+等二價陽離子,而多種RNA酶的活性是需要依賴二價陽離子的 ,所以EDTA能通過熬合二價陽離子來抑制 RNA酶的活性堿性條件下才能夠溶解，要和 NaOH粉末混合后，再加水，然后用 NaOH水溶液調節(jié)pH。0.01M，DNase酶基本失活。BSA酶抑制劑，使一些降解酶的活性的表面變性精胺或其他多胺酶抑制劑，降低核酸酶的影響僅供學習與交流，如有侵權請聯(lián)系網站刪除 謝謝6精品資料氰化物酶抑制劑，降低重金屬氧化酶的影響PVP減少酚類、醌類、單寧類物質的影響，抗氧化作用，絡合多酚和萜類物質，防止多酚類褐變而氧化，去除多糖和色素，色素是PCR強抑制劑，必須去除樣品液氮研磨及提取緩沖液中加入PVP或PVPP等能絡合多酚和萜類物質，離心或氯仿抽提出去，有效防止多酚氧化成醌類，避免溶液變褐色而具有抗氧化能力提取液中加入適量的PVP或PVPP能提高DNA的純度，用量根據雜質而定（1-6%），PVP同時能去除多糖，因此將PVP和巰基乙醇配合使用并調整用量，能有效防止多酚污染PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的絡合物，能與多酚形成一種不溶的絡合物質，有效去除多酚，減少 DNA中酚的污染；同時它也能和多糖結合，有效去除多糖。Triton-x100TritonX100之類的去垢劑有苯環(huán)結構，所以在 280nm有很強的吸收。蛋白酶K蛋白酶K：切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶，切割脂族和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵，將蛋白質降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分離出來。蛋白酶K在較廣的pH范圍內均有活性（pH4-12.5）溫度范圍37-60度鹽濃度3MGuHCl或4M尿素中均有活性在一些去污劑：Tween20(5%)、TritonX-100(1%)和SDS(1%)條件下也有活性。蛋白酶K消化裂解法適用于所有標本的消化處理，尤以DNA樣品為佳.如組織細胞(包括石蠟包埋組織)絨毛、毛發(fā)、精斑、血液(血清、血漿、全血)局部分泌物、尿，糞便等.蛋白酶K的一般工作濃度是50—100μg/ml蛋白酶(蛋白酶K或鏈酶蛋白酶)可以降解蛋白質,滅活核酸酶(DNase和RNase),DNase和RNase也用于去除不需要的核酸 ，有人使用蛋白酶替代 DEPC處理水的，但有些人說效果不好 。蛋白酶K，威力巨大的廣譜蛋白酶，95C加熱10分鐘，則完全失活。數(shù)年前首次使用它替代DEPC處理RNA抽提用的離心管和槍頭，效果不錯；后來又用于處理RNase-Free的水，效果也是一級棒。從此就再也不用 DEPC了。配制RNA裂解試劑時，直接用滅菌的雙蒸水配制，最后，加入蛋白酶 K至終濃度1ug/ml。輕輕混勻，室溫放置 15 分鐘后即可。僅供學習與交流，如有侵權請聯(lián)系網站刪除 謝謝7精品資料槍頭及離心管去除RNase：先將槍頭及離心管清洗干凈后，移入預先混好的含1ug/ml蛋白酶K的雙蒸水，徹底浸入。室溫放置30分鐘后，連水一起高壓滅菌。棄水后，烘干即可。RNase-Free水的獲得：直接在滅菌的雙蒸餾水中加入蛋白酶K至終濃度1ug/ml。輕輕混勻，室溫放置15分鐘后，滅菌處理即可。該蛋白質的殘留對后續(xù)實驗沒有可見的影響。無蛋白質殘留的RNase-Free水的獲得：這比較麻煩。直接在滅菌的雙蒸餾水中加入蛋白酶K至終濃度1ug/ml。輕輕混勻后，倒入專用的蒸餾器中。放置15分鐘后，加熱蒸餾，流出的就是無蛋白質殘留的RNase-Free水。要提醒的是，該專用蒸餾器頭幾次流出來的水，只能當普通蒸餾水用，因為通道中難確保RNase-Free的環(huán)境；另外，一定要主要密閉性，否則，流出的水又被污染了。DNA裂解液的作用是破壞細胞膜、核膜，并使組織蛋白與DNA分離，抑制細胞中Dnase的活性，而蛋白酶k的作用是將蛋白質降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分離出來！溶菌酶溶壁酶DnaseRnase多糖水解酶：水解多糖飽和酚酚是一種有機溶劑,預先要用STE緩沖液飽和,因未飽和的酚會吸收水相而帶走一部分核酸。酚也易氧化發(fā)黃,而氧化的酚可引起核酸鏈中磷酸二酯鍵斷裂或使核酸鏈交聯(lián)：故在制備酚飽和液時要加入82羥基喹嚀,以防止酚氧化。苯酚非極性分子 水為極性分子使蛋白質變性，同時抑制了 DNase的降解作用。用苯酚處理勻漿液時，由于蛋白與DNA聯(lián)結鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而 DNA溶于水相。使用酚的優(yōu)點：1.有效變性蛋白質；2.抑制了DNase的降解作用。能有效使蛋白質變性而出去，酚形成的有機相破壞蛋白質的膠體穩(wěn)定性，從而蛋白質不會分布在水相中，避免核酸污染僅供學習與交流，如有侵權請聯(lián)系網站刪除 謝謝8精品資料缺點：1.能溶解10-15%的水，從而溶解一部分 poly（A）RNA。2.不能完全抑制RNase的活性。酚變性大，但與水相有一定程度的互溶，大約 10-15%的水溶在酚相中，使核酸損失酚（Phenol）對蛋白質的變性作用遠大于氯仿，按道理應該用酚來最大程度將蛋白質抽提掉，但是水飽和酚的比重略比水重，碰到高濃度的鹽溶液（比如4M的異硫氰酸胍），離心后酚相會跑到上層，不利于含質粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收；還有一點，酚與水有很大的互溶性，如果單獨用酚抽提后會有大量的酚溶解到水相中，而酚會抑制很多酶反應（比如限制性酶切反應），應此如果單獨用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次將水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液進行抽提，跑到水相中的酚則少得多，微量的酚在乙醇沉淀時就會被除干凈而不必擔心酶切等反應不能正常進行。至于異戊醇的添加，其作用主要是為了讓離心后上下層的界面更加清晰，也方便了水相的回收。氯仿非極性分子 水為極性分子去除脂肪,使更多蛋白質變性,從而提高提取效率克服酚的缺點；加速有機相與液相分層。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的跡量酚。（酚易溶于氯仿中）氯仿變性不如酚好，但與水不混溶，不會帶走 DNA因此混合使用最佳，經酚第一次抽提的水相有殘留的酚，由于酚和氯仿互溶，可用氯仿第二次帶走酚，也可在第二次抽提中混合使用，比例為 1：1苯酚/氯仿苯酚、氯仿抽提去除蛋白質非極性分子水為極性分子，當?shù)鞍姿芤号c他們混合時，蛋白質分子見的水分子被擠去，使蛋白失去水合狀態(tài)而變性，經離心，變性蛋白密度比對大，而與水相分離，苯酚/氯仿比重大，保留在最下層苯酚氯仿使蛋白質變性 量要足夠，因為苯酚去除蛋白是有一定的飽和度的，超過飽和度，裂解體系中蛋白質不能被一次性去除，必須多次抽提。離心后分三層，下層有機層中有一些脂溶性的雜質，中間層白色絮狀沉淀是蛋白，僅供學習與交流，如有侵權請聯(lián)系網站刪除 謝謝9精品資料上清液中即含有核酸；變性后的蛋白質從水相中析出，位于苯酚中或苯酚與水相之間。異戊醇抽提DNA，為混合均勻，容易產生氣泡，氣泡會阻止相互間的充分作用，加入異戊醇降低分子表面張力，一般采用氯仿：異戊醇 =24：1或酚：氯仿：異戊醇=25：24：1（不必先配置，臨用前加入即可）減少操作過程中產生的氣泡。減少蛋白質變性操作過程中產生的氣泡。異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡產生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含 DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機溶劑相維持穩(wěn)定。NaCl提供一個高鹽環(huán)境，使 DNA充分溶解于液相沉淀DNA時總會加入高濃度的鹽,加鹽的目的是破壞能使蛋白質保持穩(wěn)定的兩個因素,使蛋白和DNA分離并沉淀下來.而此時鹽的陽離子會與 DNA結合形成DNA-陽離子鹽溶于溶液中,再用無水乙醇可以將 DNA-陽離子鹽沉淀下來提取DNA時先加0.14mol/L氯化鈉，因為在這種濃度的氯化鈉溶液中， DNA的溶解度最低，而蛋白質的溶解度增加，這樣通過過濾能將 DNA分離開，以除去蛋白質。再加入 95%的酒精能使DNA沉淀，因為在這個濃度下 DNA溶解度最低。如果直接加酒精不先加氯化鈉， DNA和蛋白質都能被酒精所沉淀，就無法將DNA和蛋白質分離開。所以必須先加氯化鈉后加酒精，順序不能顛倒。DNA

溶液是

DNA

以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當加入乙醇時，乙醇會奪去

DNA周圍的水分子，使 DNA失水而易于聚合。這樣可以是 DNA沉淀出來在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負電荷的，加一定濃度的 NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的負電荷，減少 DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成 DNA鈉鹽沉淀，當加入的鹽溶液濃度太低時，只有部分 DNA僅供學習與交流，如有侵權請聯(lián)系網站刪除 謝謝10精品資料形成DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成 DNA沉淀不完全，當加入的鹽溶液濃度太高時，其效果也不好。在沉淀的 DNA中，由于過多的鹽雜質存在，影響 DNA的酶切等反應，必須要進行洗滌或重沉淀。檸檬酸鈉它可以控制反應體系的離子強度，同時還有一定的緩沖作用，保證體系 PH的相對穩(wěn)定狀態(tài)，總之檸檬酸鈉在這里的作用類似于食物中的防腐劑。DEPC焦碳酸二乙酯，它通過和 RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)結合使蛋白質變性，從而抑制酶的活性。與肝素何用效果增強。在 Tris中不穩(wěn)定，很快會分解為二氧化碳和乙醇。強烈但不徹底的 RNA酶抑制劑 0.1%濃度Tris-HCl緩沖體系，使pH變化不會太大異丙醇加入異丙醇之后立即出現(xiàn)絮狀沉淀，我一直以為這是正確的，看了帖子才知道是蛋白質污染，異丙醇的沉淀效果要比無水乙醇的沉淀效果要好，但是異丙醇沉淀有一個弊端就是會沉淀下來好多的鹽和蛋白質這樣會影響下一步的操作，一般我加異丙醇是等體積的效果還可以。70%乙醇僅供學習與交流，如有侵權請聯(lián)系網站刪除 謝謝11精品資料70%乙醇洗滌DNA沉淀(因為在70%乙醇里DNA是不溶的,而鹽離子卻可溶),用無水乙醇則達不到這個目的 !乙醇對于蛋白質、核酸的沉淀效應隨分子量加大而增大，小分子的核酸和蛋白質碎片是可以溶于 75%乙醇的。漂洗DNA，是為了去除殘余的鹽類，去除過量 SDS和酚等雜物，因為 SDS在70%的乙醇中保持溶解狀態(tài)，不與DNA共沉淀，從而通過棄上清液去除這種去污劑,避免對以后PCR反應的影響。DEPC（焦碳酸二乙酯）:常用RNA酶抑制劑，與RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)結合使蛋白質變性,強烈但不徹底的 RNA酶抑制劑甲酰胺用高濃度甲酰胺替代苯酚從細胞裂解物的蛋白酶 K消化物中分離抽提 DNA，甲酰胺是一種離子化溶劑，能分離蛋白質 -DNA復合物