細(xì)胞遷移侵襲實(shí)驗(yàn)操作步驟(Transwell)

遷實(shí)（cellassay）實(shí)介細(xì)胞遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)將Transwell小放入培養(yǎng)板，小室內(nèi)稱上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱下室，上下層培養(yǎng)液聚碳酸酯膜相隔將研究的細(xì)胞種在上室內(nèi)于聚碳酸酯膜有通透性下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞用不同孔徑和經(jīng)過不同處理的聚碳酸酯膜可以進(jìn)行共培養(yǎng)、細(xì)胞趨化、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲等多種方面的研究。實(shí)步：1材準(zhǔn)備可拍照顯微鏡，Transwell小，孔徑8，沒包被膠(Coster和公司的也較常用，Transwell遷實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞培養(yǎng)板24孔。細(xì)胞培養(yǎng)板應(yīng)當(dāng)與購買的小室相配套公的Matrigel血清DMEM胎牛血清DMEM和1640養(yǎng)基完全培養(yǎng)基1640完培基（也可加到20%血清菌，棉簽，胰酶多甲醛固定液或者甲醇，結(jié)晶紫染液0.1%g/ml）PBS結(jié)紫）2步和流2.1基膠板用BD公的Matrigel1：8（根據(jù)細(xì)胞產(chǎn)生mmp量來決定）稀釋，包被Transwell小底部膜的上室面，置3730min使聚成凝膠。使用前進(jìn)行基底膜水化。2.2制細(xì)懸①制備細(xì)胞懸液前可先讓細(xì)胞撤血清饑餓1224h一步去除血清的影響這一步并不是必須的。②消化細(xì)胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液PBS1－2遍含BSA的血培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至。2.3接細(xì)①取細(xì)胞懸液100μl加小。②24孔下一般加入600μl含20%FBS的養(yǎng)基，特別注意的是層培養(yǎng)液和小室間常會有氣泡產(chǎn)生一旦產(chǎn)生氣泡層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了種板的時候要特別留心，一旦出現(xiàn)氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進(jìn)培養(yǎng)板。③培養(yǎng)細(xì)胞：常規(guī)培養(yǎng)1248h（主要依癌細(xì)胞侵襲能力而定較見，時間點(diǎn)的選擇除了要考慮到細(xì)胞細(xì)胞侵襲力外，處理因素對細(xì)胞數(shù)目的影響也不可忽視。2.4結(jié)統(tǒng)直接計數(shù)法，貼壁細(xì)胞計數(shù)，這里所謂的“壁”是細(xì)胞穿過膜后，可以附著在膜的下室側(cè)而不會掉到下室里面去，通過給細(xì)胞染色，可在鏡下計數(shù)細(xì)胞。取出Transwell小室，棄去孔中養(yǎng)液，用無鈣PBS洗2遍，甲醇固定30分，將小室適當(dāng)風(fēng)干。0.1%晶紫染色20min，用棉簽輕輕擦掉上層未移細(xì)胞，用PBS洗3遍。400倍微鏡下隨即五個視野觀察細(xì)胞，記。實(shí)驗(yàn)材

（1）Transwellchamber:24-well,8.0-μmporemembranes(Corning)（2）細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑：無血清培養(yǎng)基，10血清培養(yǎng)基，PBS，0.02％EDTA（3）固定液：甲醇（4）染色液：Giemsa染液（5）封片劑：中性樹膠（6）其他：小鑷子，棉棒，載玻片，蓋玻片操作步（1）所有細(xì)胞培養(yǎng)試劑和Transwellchamber放在37℃溫育；（2）待測細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，消化細(xì)胞，用和無血清培養(yǎng)基先后洗滌一次，用無血清培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，計數(shù)，調(diào)整濃度為2×10

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/ml；（3）在下室（即板底部）加入600－800μl含％血清的培養(yǎng)基，上室加入100－150l細(xì)胞懸液，繼續(xù)在孵箱培養(yǎng)24小時；（4）用鑷子小心取出，吸干上室液體，移到預(yù)先加入800μl甲醇的孔中，室溫固定分鐘；（5）取出chamber，吸干上室固定液，移到預(yù)先加入約800lGiemsa染液的孔中，室溫染色－30分鐘；（6）輕輕用清水沖洗浸泡數(shù)次，取出chamber，吸去上室液體，用濕棉棒小心擦去上室底部膜表面上的細(xì)胞；（7）用小鑷子小心揭下膜，底面朝上晾干，移至載玻片上用中性樹膠封片；（8）顯微鏡下取9個隨機(jī)視野計數(shù)，統(tǒng)計結(jié)果。注意事（1）根據(jù)待測細(xì)胞體積大小選擇合適孔徑的chamber。常用的為8.0-μm孔徑（如AGS細(xì)胞如果細(xì)胞體積較大可以考慮用μm孔徑；2）根據(jù)待測細(xì)胞的遷移能力強(qiáng)弱調(diào)整細(xì)胞數(shù)和遷移時間。常規(guī)24-wellchamber接種細(xì)胞數(shù)約為2≈5×10

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/well，遷移時間12≈36小時；（3）由于Corning公司的24-Transwell內(nèi)含個獨(dú)立的chamber，為了避免操作污染，每次實(shí)驗(yàn)可預(yù)先另準(zhǔn)備一塊孔普通培養(yǎng)板（Corning（4如果細(xì)胞遷移能力較弱下室液體可用細(xì)胞無血清培養(yǎng)24時獲得的上清加50μg/mlFN（Fibronectin體可查閱相關(guān)文獻(xiàn)；（5）細(xì)胞懸液加入膜中央，盡量保證液面水平；（6）固定染色擦洗時動作小心，避免擦去膜底面的細(xì)胞。但一定要充分擦凈膜表面上未遷移的細(xì)胞，以免影響讀數(shù)。尤其是膜周邊上可用細(xì)牙簽或小鑷子纏上濕棉花擦洗，但要小心避免將膜戳破；

（7）Chamber和膜上都無法標(biāo)記，操作時應(yīng)小心避免混淆實(shí)驗(yàn)組和對照組；（8）充分晾干，避免殘留水分導(dǎo)致鏡下聚焦不一致。細(xì)侵實(shí)）實(shí)驗(yàn)材（1）Matrigel(BD5mg/ml)，-20℃保存（2）其余材料同遷移實(shí)驗(yàn)操作步（1）Matrigel在4℃過夜融化；（2）用4℃預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel終濃度1mg/ml，冰上操作；（3在chamber上室底部中央垂直加入100l稀釋后的Matrigel37℃溫育4－5小時使其干成膠狀；（4）后續(xù)步驟同遷移實(shí)驗(yàn)（1-8注意事（1）Matrigel在過高或過的溫度均易凝固，因此操作所需槍頭和離心管應(yīng)提前在4℃預(yù)冷；（2）鋪膠時保證液面水平，膠的厚度均勻一致，切勿產(chǎn)生氣泡；（3）其他注意事項(xiàng)同遷移試驗(yàn)。其做腫瘤侵實(shí)的體驟－80度的BD4度（（2加60ul（或入上室各（3個入育4-5h（>5h現(xiàn)”時，說明已經(jīng)變15加37中（3）3（4）1入（5）入含有20％FBS（6）37（7）用25%戊二醛，4℃；（8（0.1%或（溫0.5hPBS洗2遍遷實(shí)驗(yàn)

在孔泡1次計配成細(xì)；37℃用遍，戊二4；2（0.1%0.5h2（或混勻操好在1