電生理研究方法

章心肌電生理學(xué)研究方法MethodologyofMyocardiumElectrophysiologicalResearch2021/10/101

電生理學(xué)技術(shù)的發(fā)展

1825年電流計發(fā)明與應(yīng)用1922年電子管放大器和陰極射線示波器問世20世紀(jì)40年代微電極技術(shù)產(chǎn)生動作電位的鈉學(xué)說20世紀(jì)50年代電壓鉗技術(shù)產(chǎn)生20世紀(jì)70年代膜片鉗技術(shù)2021/10/102

謝靈頓(Sherrington)

（1857-1952）英國神經(jīng)生物學(xué)家。發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)反射活動規(guī)律

艾德里安(Adrian)

（1889-1977）英國生理學(xué)家。闡明動作電位及其傳導(dǎo)規(guī)律1932年獲諾貝爾獎2021/10/103厄蘭格(Erlanger)（1874-1965）（美）兩人合作發(fā)明了陰極示波器，并研究了神經(jīng)纖維的功能加塞(Gasser)（1888-1963）（美）1944年獲諾貝爾獎2021/10/104Bernstein膜學(xué)說1902年，Bernstein提出生物電發(fā)生的膜學(xué)說：“神經(jīng)或肌肉的細(xì)胞膜只對鉀離子有特殊的通透性，而對較大的陽離子和陰離子則均無通透性，因此由于細(xì)胞內(nèi)外鉀離子分布不均勻，在膜兩側(cè)就形成一個電位差，此即靜息電位，神經(jīng)沖動到來時，膜變?yōu)闊o選擇通透的膜，靜息電位消失，動作電位因而產(chǎn)生?！?021/10/105

離子學(xué)說（動作電位的鈉學(xué)說）

1940年前后，由于Hodgkin和Huxley在槍烏賊巨軸突上發(fā)現(xiàn)動作電位大于靜息電位的事實，Bernstein膜學(xué)說受到了有力的打擊。以后的研究證實，Bernstein膜學(xué)說對于離子通透性的假設(shè)是不正確的。其被后來的離子學(xué)說（鈉學(xué)說）所代替。2021/10/106Eccles2021/10/1071976年德國馬普生物物理化學(xué)研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌細(xì)胞上用雙電極鉗制膜電位的同時，記錄到乙酰膽堿（Acetylcholine,ACh）激活的單通道離子電流，從而產(chǎn)生了膜片鉗技術(shù)（patchclamptechnique）；1980年Sigworth等獲得10-100GΩ的高阻封接（Gigaseal），1981年Hamill和Neher等對該技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，引進(jìn)了全細(xì)胞記錄技術(shù)，從而使該技術(shù)更趨完善；1983年10月，《Single-ChannelRecording》一書的問世，奠定了膜片鉗技術(shù)的里程碑。2021/10/108

Neher

Sakmann

（1944-）（1942-）（德國細(xì)胞生理學(xué)家）（德國細(xì)胞生理學(xué)家）

合作發(fā)明了膜片鉗技術(shù)，并應(yīng)用這一技術(shù)首次證實了細(xì)胞膜存在離子通道。這一成果對于研究細(xì)胞功能的調(diào)控至關(guān)重要，可揭示神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及糖尿病等多種疾病的發(fā)病機理，并提供治療的新途徑。二人共獲1991年諾貝爾獎。2021/10/109內(nèi)爾在實驗室進(jìn)行膜片箝研究工作2021/10/1010

1983年10月第一版

《Single-ChannelRecording》封面2021/10/1011電生理獲醫(yī)學(xué)諾貝爾獎名單（截止到2002年）2021/10/10122021/10/1013

第一節(jié)

常規(guī)心肌電生理研究技術(shù)

在常規(guī)心肌電生理研究中，主要是采用玻璃微電極插入在體或離體心肌細(xì)胞內(nèi)，記錄心肌細(xì)胞的跨膜電活動，并研究各種因素對其電活動的影響。2021/10/1014一、常用電生理儀器

刺激系統(tǒng)（刺激器等）檢測系統(tǒng)（電極、換能器）放大系統(tǒng)（前置、后置放大器）記錄顯示系統(tǒng)(示波器、記錄儀、計算機）2021/10/10151.電子刺激器（Electronicstimulator）

電刺激不易損傷組織，又能定量而準(zhǔn)確地重復(fù)使用。方波（矩形波，squarewave）的幅度、波寬和頻率都可分別進(jìn)行調(diào)節(jié)，所以矩形波電子刺激器可作為理想的刺激源。SEN-72032021/10/1016方波刺激脈沖的參數(shù)要求：（1）

幅度（強度，amplitude）矩形脈沖電壓的最大瞬時值

（2）

波寬（刺激持續(xù)時間time）（3）頻率（frequency）

一個脈沖循環(huán)所需的時間為周期，周期的倒數(shù)（即1S內(nèi)所含的周期數(shù)目）稱為頻率2021/10/1017（4）延遲（Delay）從觸發(fā)脈沖到刺激方波的出現(xiàn)，這一段時間稱為延遲。（5）刺激方式（Patternofstimulation）單刺激、連續(xù)刺激、雙脈沖刺激（6）同步輸出（Synchronizedoutput）同步脈沖表示一次刺激的時間起點2021/10/1018（7）刺激隔離器（Isolator）

當(dāng)對實驗動物同時進(jìn)行刺激和記錄生物電時，刺激器輸出和放大器輸入具有公共接地線，使得一部分刺激電流流入放大器的輸入端，使記錄器記錄到一個刺激電流產(chǎn)生的波形，即刺激偽跡。隔離器切斷了刺激電流從公共地線返回的可能，減小偽跡并與電位分開。同時，消除50周交流電感應(yīng)造成的干擾。2021/10/10192.微電極放大器（microelectrodeamplifier）

組成：精密穩(wěn)壓電源、高輸入阻抗探頭、主放大器、電容補償電路、校正電路、低通濾波電路等2021/10/1020Axopatch200B（AXON，USA）

2021/10/1021要求：（1）足夠高的放大能力（2）頻率響應(yīng)范圍大0—100Hz（3）低噪聲>50uV（4）高的辨差比（共模抑制比）1000:1（5）高輸入阻抗1000MΩ（6）低頻與高頻濾波低頻濾波----用于變化速度快的生物電變化高頻濾波----用于減少噪聲，提高信噪比2021/10/10223示波器（oscillograph）要求：高靈敏度掃描速度快頻率高類型：雙線示波器多線示波器長余輝慢掃描示波器記憶示波器VC-112021/10/10234貯存和分析電生理實驗結(jié)果的儀器（1）示波照相機（2）磁帶記錄儀（3）電子計算機A/D轉(zhuǎn)換--把生物電（模擬）信號轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號D/A轉(zhuǎn)換--把數(shù)字信號轉(zhuǎn)換成模擬信號2021/10/1024二細(xì)胞外記錄（Extracellularrecording）細(xì)胞外記錄是把電極安放在心肌表面或附近引導(dǎo)心肌組織或細(xì)胞的電活動。適應(yīng)范圍：（1）長時間的實驗；（2）對清醒的、能自由活動的動物研究；（3）從不同組織部位作同時的多導(dǎo)記錄；（4）研究非常小的細(xì)胞，數(shù)量多而難于孤立起來，接觸和穿刺都易于損傷等；（5）研究器官的總的活動。2021/10/1025電極：（1）玻璃微電極（2）金屬電極（3）離子選擇性電極（4）單極電極（5）多管電極2021/10/1026三在體心臟電活動的細(xì)胞內(nèi)記錄（intracellularrecordinginsitu）實驗裝置包括浮置式玻璃微電極、微電極推進(jìn)器、微電極放大器、示波器、照相裝置、記錄儀、計算機等2021/10/1027推進(jìn)器微放器示波器監(jiān)聽器照相機記錄儀計算機打印機微電極心臟2021/10/1028

動物手術(shù)電極制作要求插入應(yīng)用范圍生理、藥理、心肌缺血等

優(yōu)點：在近于生理狀態(tài)下實驗，可觀察整體因素對心肌電活動的影響，可研究藥物及其代謝產(chǎn)物的作用過程，更有利于闡明各種調(diào)節(jié)因素、致病因素或藥物對心肌電生理特性的影響機制缺點：記錄不持久，影響因素多2021/10/1029四離體心肌電活動的細(xì)胞內(nèi)記錄（intracellularrecordinginvitro）1實驗裝置2微電極、標(biāo)準(zhǔn)微電極、微推進(jìn)器3浴槽與灌流裝置生理鹽溶液、混合氣體、攝氏30—37度4刺激器5應(yīng)用范圍優(yōu)點穩(wěn)定、長時間記錄，可任意改變?nèi)芤撼煞?觀察指標(biāo)RP,APA,APD10,APD50,APD90,Vmax2021/10/1030第二節(jié)：電壓鉗制技術(shù)(Voltageclamptechnique)

利用微電極技術(shù)，雖然記錄到細(xì)胞內(nèi)的電變化過程，但不能闡明這種變化的原因。要闡明跨膜電變化機制，必需應(yīng)用電壓鉗制技術(shù)。這一技術(shù)首先是由Cole及其同事設(shè)計，在經(jīng)Hodgkin等人加以改進(jìn)，用于神經(jīng)電生理研究，弄清了神經(jīng)纖維在興奮時離子流的情況。

2021/10/1031一、細(xì)胞膜的生物物理特性(Biophysicalpropertiesofcellmembrane)

細(xì)胞膜主要由脂質(zhì)和蛋白質(zhì)構(gòu)成。以脂質(zhì)雙分子層為支架，鑲嵌著不同特性的蛋白質(zhì)顆粒。細(xì)胞膜的電緊張及其擴(kuò)布規(guī)律，膜的極化狀態(tài)及其形成過程中等都是細(xì)胞膜電纜性質(zhì)(cableproperties)的反映。(軸漿電阻與膜電阻、膜電容的組合，使電流對膜電位的影響起著依距離而衰減以及在時間上的延緩作用――神經(jīng)的“電纜”性質(zhì))。細(xì)胞膜的電纜特性從定的等效電路及其時間常數(shù)和空間常數(shù)及例證實。

2021/10/1032(一)細(xì)胞膜的等效電路

從電學(xué)特點上分析，細(xì)胞膜可等效地模擬為電阻－電容器。它具備細(xì)胞漿電阻（縱向電阻，ri），膜電阻（橫向電阻，rm），膜電容（Cm）和膜電位（Em）四方面的電學(xué)特性，根據(jù)這四方面特性即可構(gòu)成其等效電路（EquivalentCircuit）。2021/10/1033outsideinside膜電位等效電路的簡化圖Cm膜電容Rm膜電阻Em離子平衡電位Ro細(xì)胞外液的縱向電阻（Ω/cm）Ri軸漿的縱向電阻（Ω/cm）RoCmRmEm+-2021/10/1034

細(xì)胞膜的等效電路是一個并聯(lián)的阻容路，膜活動時既有電壓的改變，同時又有電流的改變。電位的改變可引起電容器的充、放電，也可用于電阻器上的電流流動。通過電容器的電流為Ic，通過電阻的電流為Ir。2021/10/10351縱向電阻（Ro、Ri）

由胞漿的性質(zhì)所決定，具有較高的電阻率，它與直徑是反比關(guān)系（直徑大、電阻小，直徑小，電阻大）。由于它的存在，使生物電的傳導(dǎo)主要沿細(xì)胞膜所包圍的容積導(dǎo)體進(jìn)行。它是單位長度的電阻，單位是Ω/cm，細(xì)胞外間質(zhì)的容積很大，其單位長度電阻（Ro）較Ri小。2021/10/10362.橫向電阻（redialresistance）

即細(xì)胞膜本身具有的膜電阻。細(xì)胞膜由雙層鹼脂構(gòu)成，厚度很薄，但具有很高的電阻，即絕緣性。膜電阻表示離子通過膜的有限能力。膜電阻反映了離子是否容易通透膜的情況。膜電阻（Rm）的大小反映了膜結(jié)構(gòu)電學(xué)方面的差異。2021/10/10373.膜電容（capacity）

表示膜的絕緣及儲存電荷的性質(zhì)。任何一種裝置使兩個導(dǎo)體中間插入一個絕緣體并安排在一起，稱為電容器。細(xì)胞外液及細(xì)胞內(nèi)液均為含電解質(zhì)的溶液，可看作為兩個導(dǎo)體；細(xì)胞膜是含脂質(zhì)的膜，可視作為絕緣體。細(xì)胞外液-細(xì)胞膜-細(xì)胞內(nèi)液三者組成了電容。2021/10/10384膜電位（membranepotential）

當(dāng)膜上離子通道開放而引起帶電離子跨膜流動時，就相當(dāng)于在電容器上充電或放電而產(chǎn)生電位差，即跨膜電位。膜電位的高低決定于跨膜電化學(xué)梯度；膜電位的高低與膜兩側(cè)的電荷成正比。2021/10/10395膜電流（membranecurrent）

任何電流都是電容電流（Ic）和電阻電流（Ii）兩種形式通過細(xì)胞膜，前者導(dǎo)致膜電荷的改變，后者實際上是由離子攜帶流經(jīng)細(xì)胞膜的。

Im=Ic+Ii2021/10/1040(二)細(xì)胞膜的時間常數(shù)（timeconstant）

時間常數(shù)是指膜電壓隨時間而改變的過程，用一常數(shù)表示之。它反映膜電位在細(xì)胞膜上隨時間而改變的（緩慢）程度。也就是膜電位通過膜電阻和膜電容充電到63%或放電到37%所需的時間。

τ=Rm×Cmτ=膜的時間常數(shù)(ms）;Rm=膜電阻（kΩ）

Cm=膜電容（μF）2021/10/1041

(三)細(xì)胞膜的空間常數(shù)（spaceconstant）

所謂空間常數(shù)，是度量電壓的空間衰減，即標(biāo)志電壓依距離而衰減的程度的一個常數(shù)。2021/10/1042第二節(jié)電壓鉗制技術(shù)Voltageclamptechnique2021/10/1043

利用微電極技術(shù)，雖然記錄到細(xì)胞內(nèi)的電變化過程，但不能闡明這種變化的原因。要闡明跨膜電變化機制，必須應(yīng)用電壓鉗制技術(shù)。這一技術(shù)首先是由Cole及其同事設(shè)計，在經(jīng)Hodgkin等人加以改進(jìn)，用于神經(jīng)電生理研究，弄清了神經(jīng)纖維在興奮時離子流的情況。

2021/10/1044一、細(xì)胞膜的生物物理特性(Biophysicalpropertiesofcellmembrane)

細(xì)胞膜上以脂質(zhì)雙分子層為支架，鑲嵌著不同特性的蛋白質(zhì)顆粒。細(xì)胞膜的電緊張及其擴(kuò)布規(guī)律，膜的極化狀態(tài)及其形成過程中等都是細(xì)胞膜電纜性質(zhì)(cableproperties)的反映。(軸漿電阻與膜電阻、膜電容的組合，使電流對膜電位的影響起著依距離而衰減以及在時間上的延緩作用――神經(jīng)的“電纜”性質(zhì))。細(xì)胞膜的電纜特性從定的等效電路及其時間常數(shù)和空間常數(shù)及例證實。2021/10/10452021/10/1046(一)細(xì)胞膜的等效電路

從電學(xué)特點上分析，細(xì)胞膜可等效地模擬為電阻－電容器。它具備細(xì)胞漿電阻（縱向電阻，ri），膜電阻（橫向電阻，rm），膜電容（Cm）和膜電位（Em）四方面的電學(xué)特性，根據(jù)這四方面特性即可構(gòu)成其等效電路（EquivalentCircuit）。2021/10/1047outsideinside膜電位等效電路的簡化圖Cm膜電容Rm膜電阻Em離子平衡電位Ro細(xì)胞外液的縱向電阻（Ω/cm）Ri軸漿的縱向電阻（Ω/cm）RoCmRmEm+-2021/10/1048離子通道等效于電導(dǎo)2021/10/1049

細(xì)胞膜的等效電路是一個并聯(lián)的阻容路，膜活動時既有電壓的改變，同時又有電流的改變。電位的改變可引起電容器的充、放電，也可用于電阻器上的電流流動。通過電容器的電流為Ic，通過電阻的電流為Ir。2021/10/10501縱向電阻（Ro、Ri）

由胞漿的性質(zhì)所決定，具有較高的電阻率，它與直徑是反比關(guān)系（直徑大、電阻小，直徑小，電阻大）。由于它的存在，使生物電的傳導(dǎo)主要沿細(xì)胞膜所包圍的容積導(dǎo)體進(jìn)行。它是單位長度的電阻，單位是Ω/cm，細(xì)胞外間質(zhì)的容積很大，其單位長度電阻（Ro）較Ri小。2021/10/10512.橫向電阻（redialresistance）

即細(xì)胞膜本身具有的膜電阻。細(xì)胞膜由雙層鹼脂構(gòu)成，厚度很薄，但具有很高的電阻，即絕緣性。膜電阻表示離子通過膜的有限能力。膜電阻反映了離子是否容易通透膜的情況。膜電阻（Rm）的大小反映了膜結(jié)構(gòu)電學(xué)方面的差異。2021/10/10523.膜電容（capacity）

表示膜的絕緣及儲存電荷的性質(zhì)。任何一種裝置使兩個導(dǎo)體中間插入一個絕緣體并安排在一起，稱為電容器。細(xì)胞外液及細(xì)胞內(nèi)液均為含電解質(zhì)的溶液，可看作為兩個導(dǎo)體；細(xì)胞膜是含脂質(zhì)的膜，可視作為絕緣體。細(xì)胞外液-細(xì)胞膜-細(xì)胞內(nèi)液三者組成了電容。2021/10/10534膜電位（membranepotential）

當(dāng)膜上離子通道開放而引起帶電離子跨膜流動時，就相當(dāng)于在電容器上充電或放電而產(chǎn)生電位差，即跨膜電位。膜電位的高低決定于跨膜電化學(xué)梯度；膜電位的高低與膜兩側(cè)的電荷成正比。2021/10/10545膜電流（membranecurrent）

任何電流都是電容電流（Ic）和電阻電流（Ii）兩種形式通過細(xì)胞膜，前者導(dǎo)致膜電荷的改變，后者實際上是由離子攜帶流經(jīng)細(xì)胞膜的。

Im=Ic+Ii2021/10/1055(二)細(xì)胞膜的時間常數(shù)（timeconstant）

時間常數(shù)是指膜電壓隨時間而改變的過程，用一常數(shù)表示之。它反映膜電位在細(xì)胞膜上隨時間而改變的（緩慢）程度。也就是膜電位通過膜電阻和膜電容充電到63%或放電到37%所需的時間。

τ=Rm×Cmτ=膜的時間常數(shù)(ms）;Rm=膜電阻（kΩ）

Cm=膜電容（μF）2021/10/1056(三)細(xì)胞膜的空間常數(shù)（spaceconstant）

所謂空間常數(shù)，是度量電壓的空間衰減，即標(biāo)志電壓依距離而衰減的程度的一個常數(shù)。2021/10/1057

(一)、定義

利用負(fù)反饋原理將膜電位在空間和時間上固定于某一恒定的測定值，以研究動作電位產(chǎn)生過程中的離子通透性與膜電位之間的依從關(guān)系的技術(shù)。

二、電壓鉗制技術(shù)的方法原理2021/10/1058

電壓鉗制術(shù)是利用負(fù)反饋電路，在一定時間內(nèi)將跨膜電位（TransmembranePotential，Vm），保持在某個選定的電位水平，此電位稱為保持電位（Holdingpotential，Vh），或者使保持電位突然變到某個特定的幅值的方波電位，稱為鉗制電位（Clampingpotential）或指令電位（Commandpotential，Vc）。2021/10/1059

(二)電壓鉗方法

電容器電流

Ic=d（CmV）/dt電阻器上電流

IR流過膜的電流總量Idv/dt=0

所有的電流將都是流過膜電阻的，這種電流將能反映離子的流動。2021/10/1060

電壓鉗技術(shù)的基本原理

電壓源（SG）使膜電位固定在特定的水平，并以放大器（AV）記錄，該放大器與一個反饋放大器（AFB）連接，這一反饋電流通過膜，正好抵消因加電壓而引起的離子電流，通過電流監(jiān)視器測量電流。2021/10/1061（三）電壓鉗技術(shù)的優(yōu)缺點：

很容易將膜電容電流與離子電流分開；可將膜電流分成不同的成分一INa、IK、Ica等（在灌流液中加入或去除某種離子）能精確反映由離子通道的開放和關(guān)閉，引起的膜電導(dǎo)的改變，能把離子通透性變化的時間關(guān)系加以描述。能分析離子通透性變化與膜電位的關(guān)系，在研究電壓調(diào)節(jié)通道的行為方面有很大價值。

1．

優(yōu)點2021/10/1062

必須在細(xì)胞內(nèi)插入兩個電極，對細(xì)胞損傷很大；對體積小的細(xì)胞，實驗難以實現(xiàn)；對形態(tài)復(fù)雜的細(xì)胞，很維保持細(xì)胞膜各處電位一致；只研究一個細(xì)胞上眾多通道的綜合活動規(guī)律，無法反映單個通道活動的特點。

2缺點:2021/10/1063蛙坐骨神經(jīng)元單個Ranvier結(jié)的電壓鉗記錄2021/10/1064（四）幾種電壓鉗方法

雙微電極法單蔗糖間隙（SingeSucroseGap）法雙蔗糖間隙（DoubleSucroseGap）法2021/10/1065電極接觸細(xì)胞負(fù)壓吸引形成Ω形膜囊泡提起電極，囊泡與細(xì)胞脫離ABCD第三節(jié)膜片鉗制技術(shù)2021/10/1066

膜片鉗制技術(shù)（patchclamptechnique)是對一塊單獨的細(xì)胞膜片（或整個細(xì)胞）的電位進(jìn)行鉗制的一項電生理技術(shù)。通過對膜電位的鉗制可以觀察通過離子通道的電流，膜片鉗放大器正是通過維持電壓的恒定而測出這種電流。運用膜片鉗技術(shù)記到的最小電流可達(dá)到pA級(10-12A)。2021/10/1067一基本原理

膜片鉗的本質(zhì)屬于電壓鉗范疇，其基本工作原理是：采用經(jīng)典的負(fù)反饋放大技術(shù)作電壓固定，但改用細(xì)胞外微吸管作電極，將微電極管尖端與細(xì)胞膜表面接觸，經(jīng)負(fù)壓抽吸，形成具極高阻抗的緊密封接，其電阻值高達(dá)10-100千歐（即GΩ=109Ω）。只有在這種封接存在時，通過膜電極引導(dǎo)記錄的電流才是通過該膜的離子通道電流。2021/10/1068

膜片鉗技術(shù)原理示意圖

Rs是膜片阻抗相串聯(lián)的局部串聯(lián)電阻（輸入阻抗），Rseal是封接阻抗。Rs通常為1～5MΩ，如果Rseal高達(dá)10GΩ（1010Ω）以上時，IP/I=Rseal/(Rs+Rseal)-1。此Ip可為在I－V轉(zhuǎn)換器（點線）內(nèi)的高阻抗負(fù)反饋電阻(Rf)的電壓降而被檢測出。2021/10/1069

膜片鉗與電壓鉗的區(qū)別

膜電位鉗制的方法不同；電位固定的細(xì)胞面積不同；研究的離子通道數(shù)目不同；

2021/10/1070(1)測量部分：

(2)串聯(lián)電阻補償部分：

(3)電容補償部分：

(4)指令信號控制部分：

(5)電源部分：膜片鉗放大器主要組成:電極電流監(jiān)視器、靈敏度開關(guān)、濾波器開關(guān)、方式選擇開關(guān)。用于校正全細(xì)胞記錄時，由于電極和細(xì)胞內(nèi)之間的通路電阻所造成的膜電位誤差。用來補償電壓突然改變時引起的電容電流。將一定的電壓加入到刺激信號中，形成一指令信號的保持電壓。進(jìn)行電壓鉗制時，它決定膜電位值，作電流鉗制時，則決定電流值。提供放大器各部分的電源。2021/10/1071貼附式全細(xì)胞記錄模式負(fù)壓吸內(nèi)面向外式外面向外式拉細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞拉并暴露于空氣中四種經(jīng)典記錄模式(Cell-attachedorOncellmode)2021/10/1072

2021/10/1073

細(xì)胞貼附式膜片（cell-attachedpatch）

優(yōu)點：不破壞細(xì)胞的完整性，不需要胞內(nèi)灌流，不影響細(xì)胞質(zhì)且調(diào)制系統(tǒng)完整?？裳芯客ㄟ^細(xì)胞對單通道的調(diào)制，也可在正常離子環(huán)境中研究遞質(zhì)和電壓激活的單通道活動。

缺點：不能改變細(xì)胞內(nèi)成分，也不能精確測定膜電位。同時由于許多細(xì)胞膜上存在有牽張激活的離子通道，細(xì)胞膜與電極間輕微的張力變化往往會增加記錄的背景噪聲。

由于細(xì)胞牢固貼附于微管電極的尖端而得名。它可用于記錄各種細(xì)胞的單通道電流，而且是在細(xì)胞完整無損的狀態(tài)下研究通道的活動。

2021/10/1074貼附式記錄（Cell-attachedrecording）細(xì)胞電極細(xì)胞膜胞外液胞內(nèi)液2021/10/1075內(nèi)面向外式膜片(inside-outpatch)

細(xì)胞貼附式膜片形后，提起電極時，與電極尖端相接的細(xì)胞膜被撕脫下來開成小泡，將電極尖端在空氣中暴露幾秒鐘后小泡很快破裂，形成胞漿側(cè)向外的內(nèi)面向外式膜片。

特點：較易改變細(xì)胞內(nèi)的離子或物質(zhì)濃度，也能把酶等直接加入膜的內(nèi)側(cè)面，適宜研究胞內(nèi)物質(zhì)對通道活動的影響。但實驗中改變膜外側(cè)物質(zhì)困難，且需侵入低鈣液中，以免小泡形成。應(yīng)用：可研究胞內(nèi)信使物質(zhì)cAMP、cGMP、Ca2+，三磷酸肌醇（IP3）等對受體型通道的調(diào)節(jié)，以及胞內(nèi)激素對通道的調(diào)節(jié)。這種方式可使通道與細(xì)胞的調(diào)節(jié)機制脫耦聯(lián)，使第二信使直接作用于膜內(nèi)，引起通道開閉。

2021/10/1076內(nèi)面向外記錄（Inside-outrecording）電極脂質(zhì)雙分子層的內(nèi)面面向浴液2021/10/1077

外面向外式膜片(outsideoutpatch)

細(xì)胞貼附式膜片形成后，向微管電極內(nèi)給予較強的負(fù)壓將膜片吸破，再將電極從細(xì)胞膜上拔起，但不暴露于空氣中，被撕脫下來的膜便形成外面向外式膜片。優(yōu)點：

缺點：

應(yīng)用：

可以任意改變胞外物質(zhì)的濃度，有利于研究遞質(zhì)對膜離子通道外側(cè)面的作用。

實驗中難以改變胞內(nèi)成分，電極管必須充以低鈣溶液以防小泡形成。

可研究腺苷酸環(huán)化酶、蛋白激酶C等活性變化，以及細(xì)胞膜上信使物質(zhì)二酰甘油、花生四稀酸、GABA、Ach等對受體型的離子通道研究。

2021/10/1078外面向外記錄（Outside-outrecording）Patch-pipette脂質(zhì)雙分子層的外面面向浴液2021/10/1079全細(xì)胞記錄構(gòu)型(wholecellrecording)

記錄的電流屬于宏觀電（macroscopicalcurrent），是整個細(xì)胞離子通道活動形成的總和電流。若采用膜片鉗放大器內(nèi)的電流鉗模式，還可以記錄細(xì)胞的靜息電位和動作電位。特點：①電極管內(nèi)與細(xì)胞之間彌散交換與平衡快，因而容易控制細(xì)胞內(nèi)液的成分；②記錄的是許多通道的綜合電流，需改變內(nèi)部介質(zhì)以分離電流；③適合于對小細(xì)胞的電壓鉗位，對直徑大于30μm的細(xì)胞很難實現(xiàn)鉗制；④該方法使電生理研究的重點從無脊椎動物大細(xì)胞中解脫出來，而向人類和哺乳類細(xì)胞發(fā)展。2021/10/1080全細(xì)胞記錄（Whole-cellrecording）細(xì)胞電極細(xì)胞膜2021/10/1081

膜片鉗制技術(shù)記錄方式

2021/10/1082穿孔膜片記錄技術(shù)（perforatedpatchrecordingtechnique）

Hom和Marty于1988年首次建立了一種對傳統(tǒng)全細(xì)胞記錄法改進(jìn)的方法，該方法是基于某些抗生素如制霉菌素（Nystatin），兩性霉素B（AmphotericinB）等具有在生物膜上形成通透性孔道的特性，將這類抗生素充灌在電極液中，在形成高阻封接后，可使電極液與細(xì)胞內(nèi)液在電學(xué)上相通，因而稱作穿孔膜片記錄技術(shù)。

2021/10/1083穿孔膜片及穿孔囊泡記錄模式（Perforatedpatchandperforatedvesiclemode）制霉菌素形成的孔道電極受體離子通道提起電極胞漿穿孔囊泡(外面向外式)

穿孔膜片(緩慢全細(xì)胞式)2021/10/1084技術(shù)的優(yōu)缺點

優(yōu)點：與全細(xì)胞記錄相比，該技術(shù)相比有如下優(yōu)點

①由抗生素形成的孔道對于等于或大于葡萄糖的分子均不能通過。因此，在全細(xì)胞記錄時可避免對胞內(nèi)重要物質(zhì)的滲析影響，通道電流衰減現(xiàn)象顯著減慢，那些對細(xì)胞內(nèi)通訊及通道調(diào)控具有重要作用的第二信使物質(zhì)仍可正常運行。

②因抗生素形成的孔道對多價離子不通透，故胞內(nèi)的這些離子的濃度就不受電極液的影響。因此可在全細(xì)胞電流記錄的同時用Ca2+染料測定胞內(nèi)游離的Ca2+水平

③對細(xì)胞的損傷作用明顯小于微電極細(xì)胞內(nèi)記錄及膜片鉗全細(xì)胞記錄，記錄時間可持續(xù)3小時。④高阻封接不易被破壞，而全細(xì)胞記錄的負(fù)壓脈動式抽吸和電壓脈沖易致高阻封接破壞。⑤電極串聯(lián)電阻較低，膜電容更易補償。2021/10/1085缺點：

①無法使電極液中的大分子與胞內(nèi)物質(zhì)交換。因此研究大分子物質(zhì)對胞內(nèi)機制的作用就不能進(jìn)行。②由于電極液與胞內(nèi)液之間存在Donnan平衡，因此電極液內(nèi)必須有與細(xì)胞內(nèi)相同濃度的不通透陰離子和Cl-，否則將導(dǎo)致Cl-流出或流入細(xì)胞，使陰離子和水重新平衡，最終導(dǎo)致細(xì)胞體液變化。③穿孔所需時間較全細(xì)胞法長。

2021/10/1086濃度鉗（concentrationclamp）

用改變灌流液的方法來改變細(xì)胞內(nèi)液或外液中某種化學(xué)成分和濃度。人工地控制膜內(nèi)或膜外的溶液成分，并在瞬間階梯式地改變某種化學(xué)物質(zhì)的濃度，這種技術(shù)就是濃度鉗，也稱為化學(xué)鉗（chemicalclamip）,或稱濃度跳變(concentrationjump)。2021/10/1087人工脂膜的膜電流記錄

把構(gòu)成細(xì)胞膜的脂質(zhì)分子散布于水表面時，很容易形成親水端向下脂質(zhì)單分子層，將單分子層背靠背地折疊起來，就形成類似細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的人工脂質(zhì)雙層。純的脂質(zhì)雙層幾乎是絕緣的，但是將含有通道蛋白的脂質(zhì)小泡融入人工脂膜或?qū)⑺苄酝ǖ赖鞍字苯硬迦肴斯ぶ|(zhì)雙層，便可利用膜片鉗技術(shù)記錄到單通道電流。

2021/10/1088三膜片鉗記錄的基本步驟

（一）、液體配制主要根據(jù)研究通道的不同，所用細(xì)胞的不同，配制相應(yīng)的液體，基本原則是保持2個平衡，滲透壓平衡和酸堿平衡。另外，所有液體在使用前必須過濾，以保持液體潔凈。

2021/10/1089（二）、標(biāo)本制備

膜片鉗實驗一般是在單個細(xì)胞上進(jìn)行。實驗用單細(xì)胞主要來自培養(yǎng)細(xì)胞或急性酶分離的細(xì)胞，也可來自腦片細(xì)胞中的原位細(xì)胞。常用的酶是膠原酶和蛋白酶，單獨或聯(lián)合使用，有些組織還要加用其它酶，如彈性纖維酶等。

豚鼠心室肌細(xì)胞急性酶分離方法

腸系膜動脈平滑肌細(xì)胞分離

2021/10/1090（三）、微管電極的制備

一般采用常規(guī)二步法完成，電極尖端直徑在1~2m之間，拋光與涂布液體硅酮樹酯后，充灌電極液。1、微管電極拉制

2、電極熱拋光

3、緣樹脂涂抹

4、電極液充灌

2021/10/1091（四）、高阻抗封接形成

1．在恒溫條件下，將細(xì)胞貼壁良好的載玻片移入有浴液的浴槽中。浴槽不能太深，以盡量減少電極進(jìn)入浴液的深度，從而減少浮游電容；2．倒置相差顯微鏡下選擇立體感強、活性好的細(xì)胞進(jìn)行實驗；3．使用新拉制的微管電極，用細(xì)塑料管以反充灌方式灌電極液入電極尖端，若含有氣泡，可手持微電極使其尖端朝下，用手指敲彈幾下管壁即可排除，然后再將微電極安裝在探頭上。2021/10/10924．當(dāng)微管電極在微推進(jìn)器幫助下進(jìn)入浴液時，用注射器向電極施加一正壓（1~2cm—H2O），以防液氣表面顆粒堵塞微管電極尖端；調(diào)節(jié)放大器上pipetteoffset旋鈕，將電極電壓補償?shù)搅?。同時由膜片鉗放大器向微管電極發(fā)放—電壓為5mV、波寬40ms的方波脈沖信號，用于觀察封接過程；2021/10/10935．微推進(jìn)器將微管電極送入到即將接觸細(xì)胞時，撤去正壓，并繼續(xù)向選定的細(xì)胞表面推進(jìn)，當(dāng)電極尖端輕觸到細(xì)胞表面時其應(yīng)答電流變小，這時只要給微管電極尖端管腔內(nèi)施加一負(fù)壓（10~20cmH2O），若在計算機屏幕上看到應(yīng)變電流突然下降至零，電流噪聲隨之減少，則提示微管電極尖端與細(xì)胞形成近似電絕緣，其阻抗約10~100GΩ，說明高阻抗封接（gigaseal）形成，這時的膜片為細(xì)胞貼附式膜片。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)不同的實驗要求，再制成不同類型的膜片構(gòu)型。2021/10/1094保證高阻封接要點：電極電阻適當(dāng)；電極尖端清潔；負(fù)壓抽吸系統(tǒng)密閉；電極與細(xì)胞相貼適度；細(xì)胞膜清潔，活性好。

2021/10/1095膜片鉗記錄系統(tǒng)示意圖灌流槽2021/10/1096InbathPushedagainstcellMorepressureagainstcellSealGowholecell2021/10/1097（五）、數(shù)據(jù)采集與分析

實驗中通道電流信號經(jīng)膜片鉗放大器放大后再經(jīng)12位A/D、D/A轉(zhuǎn)換器輸入計算機用于電流信號采集，系統(tǒng)連接如下圖所示：

2021/10/1098分析的內(nèi)容有：

1、宏觀電流的分析

宏觀電流（macroscopicalcurrent）是指膜上許多通道同時開放形成的離子電流，是由許多單通道電流總和形成的。應(yīng)用電壓鉗技術(shù)在單細(xì)胞或多細(xì)胞標(biāo)本上記錄的電流和膜片鉗全細(xì)胞模式記錄的電流都屬宏觀電流。2021/10/1099（1）、通道的藥理學(xué)特性

通道的藥理學(xué)特性是通道分類的重要依據(jù)，許多通道具有特異性阻滯劑和激動劑（或開放劑）。TTX——鈉通道特異性阻滯劑，TEA——鉀通道特異性阻滯劑，Cromakailm——ATP敏感鉀通道特異性開放劑利用它們可以區(qū)分膜電流的成分，有助于確認(rèn)通道的種類。

2021/10/10100（2）、通道的門控特性

通道的門控性主要是指電壓門控通道的激活與失活對電壓和時間的依賴性。典型的電壓門控通道的活動包括激活過程和失活過程。鈉通道門控的H-H模型

2021/10/10101（3）、通道的電流—電壓關(guān)系

利用通道的電流—電壓關(guān)系（current-voltagerelationship,簡稱I-V曲線）可分析通道的整流特性和離子選擇性。2021/10/10102①、通道整流特性的分析

通道I-V關(guān)系曲線與橫坐標(biāo)的交點是該通道電流的反轉(zhuǎn)電位Vrev或稱零電流電位。通道的整流特性則是指通道電流對膜電位的依賴性，通?？捎肐-V關(guān)系予以判斷。通道的電流電壓關(guān)系曲線

2021/10/10103

整流（Rectification）電流和電壓的關(guān)系不滿足歐姆定律的直線關(guān)系。原因是離子通道的開放導(dǎo)致膜電阻發(fā)生了變化。有整流無整流V=IRcV=IRv離子通道不開放時膜的被動反應(yīng)離子通道開放時膜的主動反應(yīng)2021/10/10104

外向整流隨膜電位的去極化，I-V曲線明顯向Y軸（電流軸）靠近。如IK電流。內(nèi)向整流隨膜電位的去極化，I-V曲線明顯向X軸（電壓軸）靠近。如煙堿電流。IK電流的外向整