利用酶動力學擬合在密閉條件下香菇呼吸速率方程及米氏方程

利用酶動力學擬合在密閉條件下香菇呼吸速率方程及米氏方程摘要：本研究對香菇在273K、283K和293K條件下密閉容器中的氧氣和二氧化碳隨時間濃度變化進行了測定，通過酶動力學原理和利用非線性估計法、多重回歸分析分別獲得氣體成分的變化率曲線和米式方程，從而獲得相應參數(shù)，求得反映呼吸狀態(tài)的呼吸熵動態(tài)變化規(guī)律以及溫度影響參數(shù)—活化能，這樣就可以求出在任意溫度、有氧呼吸氣體環(huán)境條件下果蔬的最大呼吸速率，為氣調包裝系統(tǒng)設計提供必要依據(jù)。關鍵字：酶動力學原理非線性估計法多重回歸法米氏方程呼吸熵活化能香菇Lentinasedodes(Berk)sing，又叫香菌、冬菇，屬白蘑（口蘑）科香菇屬，為食用菌類蔬菜，在蔬菜中屬于呼吸強度較大的一類品種。植物活體的呼吸總方程式為：植物體貯藏環(huán)境中氧氣以及二氧化碳含量直接影響到植物體的新陳代謝，呼吸速度越快消耗體內(nèi)的糖分等物質就越多,鮮度下降就越快。植物的有氧呼吸涵蓋了一系列的酶催化反應，其中包括葡萄糖酵解到丙酮然后通過三羧酸（TCA）循環(huán)獲得產(chǎn)物CO2[1]。因此，有效的氣調包裝能抑制香菇的呼吸速率及新陳代謝作用，延緩衰老達到保鮮的效果。呼吸強度是設計氣調包裝方案的重要指標參數(shù)，影響呼吸強度的因素有許多，如溫度、濕度、二氧化碳濃度、氧氣濃度和時間等。這些參數(shù)將為包裝膜透氣率的計算和選擇提供理論基礎。本研究延承了Leeetal.（1991）[2]的三維參數(shù)模型—時間（t）、氧氣濃度（O2%）和二氧化碳濃度（CO2%）濃度之間的相互關系，建立酶動力學方程即Michaelis-Menten方程，同時考慮三種參數(shù)影響，得到香菇呼吸模型，為氣調包裝參數(shù)的選擇提供理論基礎[3]。1材料與方法1.1材料香菇采購于上海楊浦區(qū)渭南路農(nóng)貿(mào)市場，選取菇型圓整、菇柄正中、不開傘，卷邊整齊，無病斑的香菇為實驗材料，并進行清洗、瀝干處理，實驗前將香菇在預設的三種溫度（293K、283K和273K）下貯藏5個小時直至達到實驗所需溫度。1.2儀器103層析儀[色譜柱為：Porapak-Q柱（60~80目）+13X（60~80目）：上海儀器廠1.3主要實驗方法1.3.1密閉實驗設置實驗通過初始條件即O2：21%；CO2：0.0%，將一定質量的香菇放于一定體積的玻璃容器中，瓶底裝入干燥劑（一定量的硅膠和CaCl2（s））以控制體系濕度，因為濕度會影響到貯藏樣品的水分活度，水分活度的大小直接影響到生物體代謝快慢，這就會對體系氧氣和二氧化碳的濃度變化有較大影響[4]。其次，將瓶口用橡皮塞和真空封泥密封后（橡皮塞上有一φ8mm的小孔，用φ15mm×5的硅膠墊密封），置于一定的水浴或冰浴中待溫度恒定，然后每隔0.5-1.0小時用注射器量取0.5mL氣體成分注入層析儀進行檢測,平行檢測兩次，同時記錄下O2、CO2對應檢測的峰高，計算出對應體系中的百分含量。層析儀中參數(shù)設置為載氣：99.995%N2；流速15mL/min；柱溫：40℃；檢測器：TCD，溫度：80℃；進樣溫度：40℃；定量方法：外標法。每組實驗的設置見表1：表1香菇呼吸密閉體系環(huán)境設置Table1Thedesignofclosedsystemmethodofthreedifferenttemperatures返溫度能（角K袋）迅273禽283牲293好香菇質量帳（悠g堂）碌180.吧9熄295植281.選6徹容器體積箏（輝L式）顛1述2濟2末空隙體朝（茫L廢）隱1.22尋0.89獵0.75鋒處理條件踢冰浴份恒溫水浴帖恒溫水浴1.3.2密閉容器中的呼吸速率方程的擬定由于各類蔬菜的品種和個體差異較大，呼吸環(huán)境中氧氣、二氧化碳濃度隨時間的變化也千差萬別，所以歷來文獻都沒有參照統(tǒng)一的方程來描述氣體濃度隨時間的變化。依據(jù)米氏方程的Lineveaver-burk曲線圖可知呼吸化學方程在初始階段反應速度維持恒定即呈線性，但隨著時間的增長，曲線的斜率變化速度減少，反應速度趨向一恒定值，因此，簡單的直線方程并不能真正地表達濃度與時間的關系，氣體濃度隨時間變化的曲線呈弧線形，并無限趨近一定值，將所有的參變量（rO2，rCO2）和應變量（[O2]，[CO2]）同時表示成時間（t）的函數(shù)，通過上述推論以及結合STATISTICS軟件中的非線形估計法[5]（NonlinearEstimation），選取損失函數(shù)（L）值最小（損失函數(shù)（L）=（觀察值（OBS）-預測值（PRED））2），復相關系數(shù)(MultipleR)接近于1的公式作為反映不同溫度下香菇在密閉容器中氣體濃度與時間的關系式：[1][2]其中，氧氣和二氧化碳的濃度（[O2]，[CO2]）以百分數(shù)%表示，時間t以小時（hr）計算。因此，根據(jù)式[1]、[2]可以得出d[O2]/dt以及d[CO2]/dt：[3][4]椒則呼吸速涉率為：[5][6]曉式中煙，剪r指—預呼吸速率飄（氧氣的鏡消耗率或暫二氧化碳榨的產(chǎn)生率?。┥眩ㄒ耺g/k廊g咐﹒盯h拘r絡）；邁M涼O2/C愛O2參—夠氧氣或二互氧化碳的盯摩爾質量采（菠g/mo允l種）；隱V?！障扼w積焦，桐L偽；唐W罵—桑密閉體系碼中香菇的隱重量估，蟲g淋；班P必—裹體系壓強農(nóng)（陰P告a嘆）；恰R寫—鮮理想氣體怨常數(shù)宏（拐8.31閘4J/m墨o厲l訊﹒盜K灘）；紐T臭—顛開氏溫度茄（似K棒）。摘1.3.么3Mi粉chae剪lis-床Ment結e留n臥方程的確位立貼謹依據(jù)酶動麥力學呼吸上模型泳[4]萍要求體系懶保持有氧急呼吸狀態(tài)后即涌[O婆2著]>1.囑5韻%狡或額[CO河2門]<20置%挽才是有效棄的宿[6]映，氧氣過襲低或二氧夾化碳過高麗將導致香闊菇無氧呼漁吸，則不鼓符合米氏居規(guī)律。在昂本次實驗捧中同時測棄定了單位累時間內(nèi)底隙物（氧氣伯）的消耗損量以及產(chǎn)洞物（二氧梳化碳）的醫(yī)生成量。爛其中二氧葛化碳又是舌化學反應清的非競爭壞性抑制劑受，因此，歲依據(jù)米氏竄方程的非忽競爭性作斃用的速度輛方程為如歌下公式：[7][8]懼式中飄，惜V唉m耳、掉K易m震和段K鄭i坐—獄調整因子曠；蒼V朽mi榮—噸最大反應豆速率（氧刃氣消耗的希最大速率載或二氧化適碳產(chǎn)生的厭最大速率饞）奪（維mg/k臥g私﹒盛h膏r原）；女K斑mi魚—束表觀米氏拾常數(shù)從（鍵%酬）；洗K喬i恩—罪抑制系數(shù)臉（枝%友）。帥通過實驗煉所測結果墾利寸用曉STAT銳ISTI砍C免A花軟件進行鑼多重線性促回歸分析扭求得其值紙。舉而臟r萄CO2/貢r蘋O2囑的值就是小呼吸熵糕（裝R寫Q轎）祖[7]鋼，它是表敘現(xiàn)氧氣與癢二氧化碳憐共同作用微下香菇呼崗吸狀態(tài)的冬動態(tài)因子蜓，也是定麻性代謝途抵徑以及表秒征脫羧酶駁或氧合酶桶系統(tǒng)的一因個有效參瞇數(shù)。本次古實驗中要辭求體系維依持在有氧籍呼吸狀態(tài)嚴，所以通出過計算做，貴R而Q副應該小于叉或接近奴于嘆1跪，辭即鄭r井CO2墓≤盛r滲O2怨。協(xié)1.3.畢4鴉拜溫度對香朋菇呼吸作侮用的影猜響補被氧氣和二疑氧化碳的施變化率除椅了受濃度書、酶等因鬧素的影響乖，最關鍵桑的是受到糠溫度的影概響，在求悟得了不同叮溫度下氧栽氣和二氧勞化碳的最泡大變化率另（省V燕m鮮）后，通糞過情Arrh壺eniu今s突[8]催關系救將岔1/尖T容與委LnV鴨m熱進行線性肅回歸，其森斜率值禁為倚Ea/咽R牌，淘E玉a灘（既kJ/m腹o戀l珠）就是活克化能，由薪此可推算閘其他溫度間下香菇呼臣吸作用的蓄最大呼吸穗速率，其卡預測方程豈為：[9]所式中盜，釀V或m0址—狼已知的氧遠氣最大消店耗率或二歐氧化碳的斯最大產(chǎn)出有率厲（蜓mg/k玩g速﹒無h雨r島）；撇T孕0鄉(xiāng)—漢已知的溫漿度雷（握K鞠）；泛V谷m社—跳T難溫度下的系氧氣最大漿消耗率或率二氧化碳證的最大產(chǎn)冬出率妥（傾mg/k糕g檔﹒組h主r榮）。假2亞結果與分玻析釣2.1響訊不同溫度澇下香菇在荷密閉體系脅中氣體濃甲度函數(shù)的中確定許各個溫度輛下的氧氣薯和二氧化轟碳隨時間炒的變化的?；貧w方程才見勵表疲2住。例由跳表飼2解可以看出祥由實驗數(shù)頃據(jù)擬合出晃的曲線有虹較好的吻議合性，從睜而得出各欄個溫度下悶以時間為晌自變量，愿氧氣與二測氧化碳濃寨度為應變散量的方程敗式。牢表窄2傻侄氧氣、二沫氧化碳濃論度隨時間訴變化的非硬線性回歸任方皇程棒Tabl肯e2左Nonl印inea素res抱tima炸tion刪reg賭ress狼ion皇ofO浮2游,CO濱2奪chan睛gew裹ith緣time崇己溫央度解K洲非線性回灑歸估計方至程黎損失函數(shù)步（覆Los葵s購）咸復相關系秋數(shù)只（菠Mult棚iple邀躍R坊）傭293婦9.77商0.99彼3況3.56怪0.98策8隆283毫9.60辮0.98胞7指6.37付0.99里3須273淚10.8爪9衡0.98越7伶5.21濫0.96庫3香2.2伸Mich瑞aeli但s-Me蹄nte迷n旦方程及各永參數(shù)的確趕立晴在求得了嘴各個溫度濟下氧氣和羞二氧化碳職濃度與時意間的擬合賠方程后，淋就可以根患據(jù)公恭式渡[5]~笨[8擊]姨，求得氧淡氣的呼吸斜消耗速帝率疑r羅O2各和二氧化義碳的呼吸維生成速輕率著r姥CO2蜘，擬合曲壞線見憑圖秤1憲；根據(jù)公較式吼[7日]朱、蓮[8練]浸通過多重澇線性回歸務分析，獲徹得桶表手3唐結果：鐮表序3偶曾香菇娃在青273視K猜、紫283較K私和霉293瞎K擁下根據(jù)多祝重回歸求療得米氏方遵程各參數(shù)秒值紅Tabl靜e3E束stim規(guī)ated鹽val零ues焰for已Mich宗eali擔s-Me禾nten藝mod掀elo豪fsh權iita企kei粱n27聞3K,2云83K蛾and五293K疤det訴ermi柜nedb維ymu則ltip輕lel匪inea贈rre仁gres愛sion康補溫壟度許K左K桿m玻%O2竿V環(huán)max拳mg/k信g醒?四hr怨K仰i滔%CO2商R轟2才標準誤差猶（留Std.董Erro矛r坡）量293第0.27厭981觀1.33欣0.98遮5它0.00算59村0.23妄828呢1.58瓦0.98川5窩0.00赴0034框283雨0.4展743婚2.86賣0.98千9滲0.06協(xié)0宇0.14賣314洪8.20友0.98辦9早0.00濤0038俘273希0.05釀117礦8.11偷0.97俗3處0.22先0.01雹7較57.4恨23.5都8奉0.97叮3丟0.00惱015通注爭：批2蓮、鏡4漸、璃6洞行數(shù)據(jù)由規(guī)公朋式饑[7掙]獲求得緊，盜3墨、徐5純、粉7堤行由公憂式喚[8彎]瘡求得。壤表票3勵中，每組皺方程各項奸的標準回觀歸化系數(shù)曉（飼BET笛A勢）在軟件憂中顯示高帆亮度（于即磚P-le饑vel<濫0.0忠5杏）說明線付性顯著。映在袋293啄K碧條件下，款香菇的由公始至終呼擇吸熵介在寨0.86嘴~1.0撫2妖之間變化條，其中，浸當氧氣濃憶度錄在惱1.0賀%燭和二氧化耳碳濃度嘉在爸13.4失%洪條件下呼素吸熵約槐為撫1黃；棄在午283呆K聲條件下，船香菇的呼違吸熵響在侮0.4~名1.善6歐之間變化宰，當氧氣士濃度劇為方5.2泳%嘉和二氧化鞠碳濃度多為且7.2赴%閃，霧R貓Q舅約平為衛(wèi)1蹤；抓273鑼K望條件出下崖R苦Q符區(qū)間攀為念0.4~考1.0完3某，當氧氣庸?jié)舛葌z為差0.7沿%沃和二氧化洋碳濃度她為魄8.4或%妖，怖R阻Q蹄約裳為豐1魔。由此表牙明本實驗脆是在有氧壟呼吸的條之件下進行悄的，計算扮有效。港2.3貼窄溫度對香齒菇呼吸作鍋用的影響績?nèi)齻€溫度懇下拆LnV彼m話的值統(tǒng)計紋見碌表慣4懲：啄表節(jié)4蹈斯不頭同疊1/和T腔下浸，犯LnV仿m呢麗的句值肝Tabl門e4誠The精valu饞eso拾fLn寄Vmi憂ndi裂ffer門ent照1/T讓1握/混溫度數(shù)（群K雖）佛1/27愚3朗1/28家3凳1/29潛3卷LnV蓬m1揀4.76塑6.61藥6.89域LnV失m2叢4.05仗5.75勒6.72剛不框同偶1/支T饑下浸，綿LnV飄m嬌線性回歸維預測值與扯觀察值關眼系中氧氣魚斜桐率鹿=-0.貢9烘3瘦，復相關鑒系烘數(shù)卵=0.9瞞2倡7贈；二氧化日碳斜蕩率灶=0.9岔9酒，復相關道系舅數(shù)箱=0.9確9際0暈。禿通過計算鄙求得的在型氧氣最大枝消耗率活煩化能僵為撲7.73露kJ/m礙o吉l怒；二氧化拘碳最大產(chǎn)拐生率的活釀化能障為河8.23卻kJ/m題o芳l有。根據(jù)公乘式感[9據(jù)]但，在已知刷一定溫度盾下氧氣的搞最大消耗掏速率或二欲氧化碳的白最大產(chǎn)出挽率，就可咱以求得其腦他溫度條纏件下的最監(jiān)大變化率牽。例如：炊在有氧呼慈吸條件下犧，已知香在菇帽在午273禿K千下氧氣的虜最大消耗翁率逃為聾117m飲g/k擴g滲?由h誓r飛，根據(jù)公薯式塌[9述]竄代入相關村參數(shù)值可但求得印在輸288見K托下氧氣最樸大消耗率縫為飄139.蠻7mg傾/k問g潔?餐h手r此。線3腫結果與討幻論雞本次實驗速利用米氏繼方程機理綁，選取了躁具有一定劇特征的函浪數(shù)形式，譽擬合了一談定溫度下陜氧氣、二兔氧化碳濃抽度隨時間瓜變化的方級程，并且才復相關系褲數(shù)都達到唇了凈0.9浸5食以上。磚米氏方程刑的各個參攏數(shù)值為進東一步氣調表包裝的參千數(shù)設定提捕供理論依揮據(jù)，并且景方程原始淡模型仍為誦時間的函缺數(shù)，大大答簡化了由舒于呼吸作禾用而導致擺體系的復醬雜性。實倒驗中同時彩也獲得了報對呼吸熵藥的動態(tài)變算化。進溫度因子它對香菇呼蠟吸作用的跟影響則通葵過須Arrh免eniu臺s吸關系求蕉得薄E弱a練，同時求烏得在有氧律條件下不且同溫度下冒的氧氣的恐最大消耗玩率或二氧撓化碳的最案大產(chǎn)出率鐮，為以后孔在不同溫底度下進行損氣調包裝昨提供數(shù)值蜓參考。參考文獻底[1]良課羅紀盛、龍張麗萍、互楊建雄皇等舍.孟生物化學禁簡明教溫程坊[M]肉.悼北京：高浴等教育出砌版社宇，腸200恩0吳：贏159~蘭176占[2]D罩.S.L梁ee,P標.C.H憶agge固r,J.角Lee,汗and立K.L胃.Yam滿.Mod涂elf德orF程resh稅Pro亂cuce帽Res情pira大tion腰inM蘿odif汽ied對Atmo懼sphe疤res域Base底don片Prin遙cipl紅eso嘴fEn術zyme茶Kin驕etic棉s[J]震.J.顯Food梯Sci夢.199初1軍，土56(6兆)耳：奔1580枝~158夾5稼[3]裝違劉穎，李束云飛，王土如竹，田未平海，楊航宏牛順趨.睜基立于貸Mich危aeli景s-Me致nte醒n此型呼吸速搶率的實驗醬研撒究宏.尾上海交通紙大學學報錦，久200殊4答，棟3三8帳（葬7督）丑：艱1170膜~117概3龍[4]爐Yoon偽seok過Song規(guī),Don尊gSu柔nLe它ean段dKi哄tl.Y侵am.P哀redi慰ctin量gre糞lati錦veh車umid碗ity墨inm丘odif份i