免疫組化技術(shù)

病理檢驗技術(shù)

免疫組化技術(shù)免疫組織化學(xué)技術(shù)是在常規(guī)HE染色和組織化學(xué)染色的基礎(chǔ)上，根據(jù)抗原抗體反應(yīng)原理而發(fā)展起來的染色技術(shù)，廣泛應(yīng)用于病理學(xué)研究和臨床病理診斷，是臨床病理診斷中重要的輔助技術(shù)之一，對于判斷腫瘤的來源、分類、預(yù)后和鑒別診斷以及指導(dǎo)和評估臨床治療起著重要作用。免疫組織化學(xué)技術(shù)是利用免疫學(xué)抗原抗體反應(yīng)的原理,用標記的特異性抗體(或抗原)對組織細胞內(nèi)相應(yīng)的抗原(或抗體)進行檢測的一種技術(shù),借助光學(xué)顯微鏡(免疫酶組織化學(xué)技術(shù))、熒光顯微鏡(免疫熒光組織化學(xué)技術(shù))和電子顯微鏡(免疫電鏡技術(shù))可觀察組織細胞內(nèi)標記物顯示出的特異性的抗原-抗體結(jié)合物即陽性反應(yīng)。在臨床病理診斷中應(yīng)用的免疫組織化學(xué)技術(shù)主要是免疫酶組織化學(xué)技術(shù)和免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)。免疫酶組織化學(xué)技術(shù)

免疫酶組織化學(xué)技術(shù)

免疫酶組織化學(xué)技術(shù)---方法

（一）EnVision法1.特點EnVision法為采用聚合物技術(shù)的二步法,是非生物素檢測系統(tǒng),可避免內(nèi)源性生物素干擾,不需要進行封閉內(nèi)源性生物素操作,加一抗前也不需用正常血清封閉,具有敏感性高,操作簡便和非特異性染色少的優(yōu)點,已成為最常用的方法之一(圖49)。免疫酶組織化學(xué)技術(shù)---方法2.試劑盒只

有EnVision/HRP/抗鼠/抗兔二抗工作液。不同編號的試劑盒有所不同，有的還配有過氧化物酶阻斷劑和顯色劑。也可選擇EnVision/AP/抗鼠/抗兔二抗。3.染色步驟(1)石蠟切片脫蠟至水。冷凍切片和細胞涂片固定后蒸餾水洗。(2)必要時進行抗原修復(fù),修復(fù)后蒸餾水洗。(3)3%的H2O2水溶液處理10分鐘,蒸餾水洗,PBS洗5分鐘。(4)滴加一抗工作液,孵育30~60分鐘,37℃；或孵育過夜(約16小時),4℃。(5)PBS洗5分鐘,3次。(6)滴加EnVision/HRP/鼠/兔二抗,孵育10~30分鐘,37℃。(7)PBS洗5分鐘,3次。(8)DAB-H2O2顯色1~5分鐘,蒸餾水洗終止顯色。(9)Mayer蘇木精染色液復(fù)染細胞核3~5分钅鐘,蒸餾水洗5~10分鐘。(10)常規(guī)脫水透明,中性樹膠封片。4.結(jié)果

陽性結(jié)果呈深淺不一的棕色,細胞核呈藍色。免疫酶組織化學(xué)技術(shù)---方法LSAB(S-P)法1.特點LSAB法采用鏈菌抗生物素蛋白-生物素技術(shù),其中鏈菌抗生物素蛋白與生物素具有很強的親和力,三步法染色,加入的二抗和三抗可將抗原-抗體結(jié)合物不斷放大,敏感性較高。高純化的抗體技術(shù),使背景更加清晰。為含生物素檢測系統(tǒng),需注意封閉內(nèi)源性生物素。二抗含有抗鼠、抗兔和抗羊免疫球蛋白,適用于與鼠抗、兔抗和羊抗等一抗配套使用。價格較便宜(圖4-10)。免疫酶組織化學(xué)技術(shù)---方法2.試劑盒

包含生物素標記的抗鼠/抗兔/抗羊免疫球蛋白(biotin-mouse/rabbit/goatlgG)工作液,標記HRP的鏈菌抗生物素蛋白(streptavidin/HRP)工作液。不同編號的試劑盒有所不同,有的還配有過氧化物酶阻斷劑和顯色劑。也可選擇標記AP的鏈菌抗生物素蛋白(streptavidin/AP)。3.染色步驟(1)石蠟切片脫蠟至水。冷凍切片和細胞涂片固定后蒸餾水洗。(2)必要時進行抗原修復(fù),修復(fù)后蒸餾水洗。(3)3%的H2O2水溶液處理10分鐘,蒸餾水洗,PBS洗5分鐘。(4)正常血清封閉后直接滴加一抗工作液,孵育30~60分鐘:或孵育過夜(約16小時)。(5)PBS洗5分鐘,3次。(6)滴加鼠/兔/羊二抗,孵育20~30分鐘,37℃。(7)PBS洗5分鐘,3次。(8)滴加鏈菌抗生物素蛋白/HRP(三抗),孵育20~30分鐘,37℃。(9)PBS洗5分鐘,3次。(10)DAB-H2O2顯色1~5分鐘,蒸餾水洗終止顯色。(11)Mayer蘇木精染色液復(fù)染細胞核3~5分鐘,蒸餾水洗5~10分鐘。(12)常規(guī)脫水透明,中性樹膠封片。4.結(jié)果

陽性結(jié)果呈深淺不一的棕色,細胞核呈藍色。免疫酶組織化學(xué)技術(shù)---方法(三)EPOs法1.特點EPOS法采用聚合物技術(shù)的一步法,敏感性高。一抗不含生物素,可避免內(nèi)源性生物素干擾,不需要進行封閉內(nèi)源性生物素操作,加一抗前也不需用正常血清封閉。最大的優(yōu)點是操作步驟少,染色快速,幾乎沒有非特異性背景染色。缺點是抗體種類不多,一抗只有標記HRP(圖4-11)。免疫酶組織化學(xué)技術(shù)---方法2.試劑盒

不用檢測試劑盒,只需要選用EPOS一抗即可。3.染色步驟(1)石蠟切片脫蠟至水。冷凍切片和細胞涂片固定后蒸餾水洗。(2)必要時進行抗原修復(fù),修復(fù)后蒸餾水洗。(3)3%的H2O2水溶液處理10分鐘,蒸餾水洗,PBS洗5分鐘。(4)滴加一抗工作液,孵育45分鐘,37℃。(5)PBS洗5分鐘,3次。(6)DAB-H2O2顯色1~5分鐘,蒸餾水洗終止顯色。(7)Mayer蘇木精染色液復(fù)染細胞核3~5分鐘,蒸餾水洗5~10分鐘。(8)常規(guī)脫水透明,中性樹膠封片。4.結(jié)果

陽性結(jié)果呈深淺不一的棕色,細胞核呈藍色。免疫酶組織化學(xué)技術(shù)---質(zhì)量控制1.組織離體后應(yīng)及時固定,最理想的固定液為10%的中性緩沖甲醛液(pH7.2~7.4)固定時間為4~6小時,不超過24小時。固定不足或過度固定都不利于免疫組化染色。2.石蠟切片脫蠟要徹底,脫蠟不干凈會造成局灶性陽性等染色不均勻的現(xiàn)象,甚至染色失敗。3.是否進行抗原修復(fù),可參考一抗說明書或?qū)嶒炇翌A(yù)實驗結(jié)果來定。許多抗原檢測進行抗原修復(fù)時,可以用熱處理方法替代蛋白酶消化方法。不當(dāng)?shù)目乖迯?fù)會導(dǎo)致抗原定位發(fā)生改變,即應(yīng)該細胞質(zhì)陽性的則出現(xiàn)細胞核陽性等；也會引起假陽性或假陰性的結(jié)果。4.使用的二抗為HRP/鼠/兔,不需要考慮所用的一抗是鼠抗還是兔抗。5.在臨床病理學(xué)診斷時,是否需要行免疫組化染色作為輔助診斷,如需要,選用多少種抗體,用哪一種抗體和哪一種克隆的抗體由診斷醫(yī)師來決定。但技術(shù)員應(yīng)了解和記錄同種抗體中染色效果最好的廠牌和批號,每次使用新批次的抗體,都應(yīng)該先做預(yù)實驗來檢測抗體的效價。如果更換不同類型的檢測試劑盒,因敏感性不同,一抗的稀釋度或一抗的孵育時間有可能不同,即使是即用型一抗都有可能需要稀釋。一抗稀釋度越大,背景染色越少,所以應(yīng)選用較敏感的檢測試劑盒,以提高一抗的稀釋度。6.不同試劑盒標記的酶可能不同,應(yīng)合理選用，與一抗和顯色劑的配套使用。在HRP系統(tǒng),可用AEC代替DAB顯色,陽性結(jié)果呈深淺不一的紅色。在AP系統(tǒng)可選用固藍或固紅顯色劑,陽性結(jié)果呈深淺不一的藍色或紅色。除DAB顯色外,用其他顯色劑顯色后,都不能用乙醇脫水,二甲苯透明和中性樹膠封片,只能用水溶性膠封片,而且不能長時間保存切片。除非行雙重染色,一般應(yīng)首選DAB為顯色劑(表4-3)。免疫酶組織化學(xué)技術(shù)---質(zhì)量控制免疫酶組織化學(xué)技術(shù)---質(zhì)量控制7.手工染色時,抗體孵育切片應(yīng)在37℃進行,使每次染色抗體孵育都能在恒定的溫度下進行,不受室溫的影響。在低溫如4℃進行第一抗體孵育切片,時間可以延長至16~24小時,通常是過夜,更有利于與抗原抗體充分結(jié)合。8.滴加抗體要完全覆蓋組織。在加抗體前用含0.05%吐溫的PBS浸洗切片,可有效避免由于抗體表面張力的作用,在組織表面隆起而引起組織邊緣出現(xiàn)假陽性的現(xiàn)象。9.加抗體前后均應(yīng)用PBS充分浸洗切片,不必擔(dān)心過多浸洗使抗原-抗體結(jié)合物解離。一般用3缸PBS,并保證第3缸PBS是新的,有利于減少非特異性染色。10.加抗體前要盡可能甩干切片上的PBS,殘留的PBS對加入的抗體稀釋度是很高的,會直接影響染色結(jié)果。11.在整個染色操作過程中,應(yīng)避免切片完全干燥,否則會增加背景色和導(dǎo)致染色失敗。12.染色過程中設(shè)立陽性和陰性對照非常重要,以驗證抗體和檢測試劑系統(tǒng)效價是否穩(wěn)定,實驗操作是否正確,從而確保染色結(jié)果的可靠性。用于陽性對照的組織蠟塊和組織切片要注意經(jīng)常更新,組織蠟塊和組織切片保存一段時間后,有可能會出現(xiàn)組織抗原的丟現(xiàn)象。免疫酶組織化學(xué)技術(shù)---質(zhì)量控制13.Mayer蘇木精染色液僅著染細胞核,所以不用酸分化。如果陽性定位在細胞核,復(fù)染要稍淺。如果用甲基綠復(fù)染,細胞核呈綠色。滴加甲基綠前要將切片上的水分甩干,有利于細胞著染。14.組織切片背景深與下列因素有關(guān),應(yīng)注意避免。(1)第一抗體濃度太高。(2)抗體孵育時間過長。(3)抗體孵育溫度過高。(4)DAB顯色劑中DAB濃度過高或H2O2太多。(5)正常血清封閉之后、滴加第一抗體之前用了PBS洗切片。(6)抗體純度不高。(7)抗體孵育切片后洗不干凈。(8)內(nèi)源性過氧化物酶的干擾。(9)內(nèi)源性生物素的干擾。(10)在染色過程中發(fā)生干片現(xiàn)象。15.使用自動免疫組化染色機,可使染色操作自動化和標準化。但要注意對機器的維

護和保養(yǎng),使機器保持在正常的狀態(tài)下工作。免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)

一、免疫熒光染色方法(一)直接法用熒光素標記的一抗直接與組織細胞特異性結(jié)合，即可在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，直接法中只有抗原抗體特異性結(jié)合，沒有連接其他抗體，所以特異性極高，非特異性染色少。但由于沒有將抗原一抗體結(jié)合物放大，所以敏感性不及間接法。

免疫熒光染色方法及操作(一)直接法將抗體標記上熒光素→熒光抗體與組織細胞抗原結(jié)合→形成有熒光素的抗原-抗體結(jié)合物→激發(fā)光(紫外光)照射,熒光素發(fā)出可見熒光→熒光顯微鏡觀察。1.特點

最大的優(yōu)點是操作步驟少,染色快速,幾乎沒有非特異性背景染色;缺點是抗體種類不多。目前熒光一抗主要用于腎穿刺和皮膚的病理診斷,多數(shù)是兔源抗體,標記FITC。2.檢測試劑盒

不需檢測試劑盒,只需要選擇目的熒光標記的一抗。免疫熒光染色方法及操作3.染色步驟(1)冷凍切片和細胞涂片固定后蒸餾水洗,PBS洗。(2)滴加熒光標記一抗工作液孵育45分鐘,37℃。(3)PBS洗5分鐘,3次。(4)晾干或甩去PBS用緩沖甘油封片。4.結(jié)果

陽性結(jié)果熒光呈明暗不一的亮黃綠色(FITC標記抗體)或橙紅色(TRITC標記抗體)。免疫熒光染色方法及操作(二)間接法先用目的一抗與抗原特異性結(jié)合,再加入熒光素標記的二抗與一抗連接,然后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。間接法中加入二抗,將抗原-抗體結(jié)合物進一步放大,所以敏感性較高。將第二抗體標記上熒光素→第一抗體與組織抗原結(jié)合→第二抗體與第一抗體結(jié)合→形成有熒光素的抗原-抗體結(jié)合物→激發(fā)光(紫外光)照射熒光素發(fā)出可見熒光→熒光顯微鏡觀察。免疫熒光染色方法及操作1.特點在染色中加入熒光素標記的二抗與一抗結(jié)合,使抗原一抗體結(jié)合物不斷放大，敏感性較高。一抗不需標記熒光素,和兔疫組化染色一樣可選擇的一抗種類多,用一個檢測試劑盒就可以分別檢測各種抗原。間接法除了用冷凍切片外,還可以用石蠟切片。2.測試劑盒沒有專門做免疫熒光染色的檢測試劑盒,通常是根據(jù)所用的一抗選擇單一的熒光素標記二抗。目前可供選擇的主要有標記FITC的羊抗兔、兔抗羊和兔抗鼠二抗以及TRITO標記的抗兔和抗鼠二抗,必要時還可以選擇非免疫正常血清,可供選擇的封閉用正常血清有羊、兔和馬血清。免疫熒光染色方法及操作3.染色步驟(1)石蠟切片脫蠟至水,冷凍切片和細胞涂片固定后蒸餾水洗。(2)必要時石蠟切片進行抗原修復(fù),修復(fù)后蒸餾水洗。(3)必要時進行正常血清封閉10分鐘,甩去血清,不洗。(4)滴加一抗工作液孵育30~60分鐘,37℃；或孵育過夜(約16小時),4℃。(5)PBS洗5分鐘,3次。(6)滴加熒光素標記二抗孵育30分鐘,37℃。(7)PBS洗5分鐘,3次。(8)晾干或