免疫熒光染色間接法

免疫熒光染色間接法單位：滄州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校講師：李紅巖免疫熒光染色間接法原理13542第一抗體與組織抗原結(jié)合第二抗體與第一抗體結(jié)合激發(fā)光(紫外光)照射熒光素發(fā)出可見熒光加入熒光素標(biāo)記的第二抗體形成有熒光素的抗原-抗體結(jié)合物熒光顯微鏡觀察6良性病變的細(xì)胞學(xué)形態(tài)檢測試劑盒沒有專門做免疫熒光染色的檢測試劑盒,通常是根據(jù)所用的一抗選擇單一的熒光素標(biāo)記二抗。目前可供選擇的主要有標(biāo)記FITC的羊抗兔、兔抗羊和兔抗鼠二抗以及TRITC標(biāo)記的抗兔和抗鼠二抗,必要時還可以選擇非免疫正常血清,可供選擇的封閉用正常血清有羊、兔和馬血清。免疫熒光染色直接法染色步驟石蠟切片脫蠟至水,冷凍切片和細(xì)胞涂片固定后蒸餾水洗。必要時進(jìn)行正常血清封閉10分鐘,甩去血清,不洗。滴加一抗工作液孵育30~60分鐘,37℃；或孵育過夜(約16小時),4℃。必要時石蠟切片進(jìn)行抗原修復(fù),修復(fù)后蒸餾水洗。免疫熒光染色直接法方法評價PBS洗5分鐘,3次。PBS洗5分鐘,3次。晾干或甩去PBS用緩沖甘油封片。滴加熒光素標(biāo)記二抗孵育30分鐘,37℃。免疫熒光染色直接法結(jié)果陽性結(jié)果熒光呈明暗不一的亮黃綠色(FITC標(biāo)記二抗)或橙紅色(TRITC標(biāo)記二抗)。免疫熒光染色直接法結(jié)果在染色中加入熒光素標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合,使抗原一抗體結(jié)合物不斷放大，敏感性較高。一抗不需標(biāo)記熒光素,和免疫組化染色一樣可選擇的一抗種類多,用一個檢測試劑盒就可以分別檢測各種抗原。間接法除了用冷凍切片外,還可以用石蠟切片。免疫熒光染色間接法熒光顯微鏡的使用1.要提前打開熒光顯微鏡電源,超壓汞燈開啟15分鐘后光源穩(wěn)定,適合觀察。開啟光源后每次使用不超過2小時,超過2小時光亮強(qiáng)度逐漸下降,觀察到的熒光也會變?nèi)酢ｊP(guān)閉光源后需要等燈泡冷卻后才能再次開啟,否則影響燈泡壽命。

2.熒光顯微鏡應(yīng)安裝紫外光擋板或在觀察時戴上防護(hù)眼鏡,防止紫外光損害眼睛。3.用高倍油鏡觀察時,應(yīng)選用無熒光鏡油,避免非特異性熒光干擾。

4.拍攝熒光圖像時,應(yīng)選用較高的ISO感光度模式。

免疫熒光染色間接法免疫熒光染色質(zhì)量控制免疫熒光染色質(zhì)量控制與免疫組織化學(xué)染色質(zhì)量控制基本相同。

此外,

免疫熒光染色后,染色片放置時間長熒光會慢慢衰減,因此,應(yīng)及時觀察,否則熒光衰減會導(dǎo)致陽性強(qiáng)度的錯誤判斷或出現(xiàn)假陰性。

觀察時,

光源長時間照射標(biāo)本,

會加快熒光淬滅,

應(yīng)避免長時間觀察同一標(biāo)本。

如果用石蠟切片行免疫熒光染色,

則必須徹底脫蠟,

否則石蠟會有青色熒光發(fā)出,影響觀