微生物檢驗(yàn) 9中和試驗(yàn)

中和試驗(yàn)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹空莆罩泻驮囼?yàn)的基本原理及意義；熟悉中和試驗(yàn)的具體操作方法、結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)及計(jì)算方法；了解中和試驗(yàn)的注意事項(xiàng)?！緦?shí)驗(yàn)原理】中和試驗(yàn)有兩種方法：1.用已知的抗體檢測(cè)未知病毒及其滴度：固定抗血清-稀釋病毒法。在體外適當(dāng)條件下孵育病毒與特異性抗體的混合物，使病毒與抗體相互反應(yīng)，再將混合物接種到敏感的宿主體內(nèi)，然后測(cè)定殘存的病毒感染力。2.已知病毒檢測(cè)血清中未知抗體及其滴度：固定病毒-稀釋抗血清法。中和抗體與病毒結(jié)合后，能夠使病毒失去吸附、傳入宿主細(xì)胞的能力，從而阻止了病毒的增殖，使其失去致細(xì)胞病變效應(yīng)，因此在進(jìn)行病毒中和試驗(yàn)時(shí)，首先將病毒與免疫血清在適當(dāng)條件下混合、孵育，然后將其接種到敏感宿主細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，從而可根據(jù)對(duì)細(xì)胞、動(dòng)物等的保護(hù)效果來判斷病毒是否已被中和，并計(jì)算出中和抗體的效價(jià)。【實(shí)驗(yàn)器材】37℃孵箱、倒置顯微鏡、CO2培養(yǎng)箱、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、微量加樣器及無菌吸頭、無菌刻度吸管、無菌中試管、無菌平皿、無菌1.5mlEP管。待檢血清（0.5ml）、陽(yáng)性血清、陰性血清。BHK21細(xì)胞、新城疫雞瘟病毒懸液、細(xì)胞維持液、Hank`s液?！緦?shí)驗(yàn)方法】固定病毒-稀釋抗血清法。待檢血清的稀釋：取12個(gè)無菌EP管，做好標(biāo)記，無菌條件下每管加入0.5ml維持液，向第1管中加入0.5ml待檢血清（稀釋度23），混勻后，換一個(gè)新槍頭，從第1管中取出0.5ml加入第2管中，混勻后，換一個(gè)新槍頭，再?gòu)牡?管中取0.5ml加入第3管中，依次類推。倍比稀釋，共做12個(gè)稀釋度。管號(hào)123456789101112稀釋度22223242526272829210211212維持液（ml）0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5待檢血清（ml）0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.52.陽(yáng)性對(duì)照的稀釋：取12個(gè)無菌EP管，做好標(biāo)記，無菌條件下每管加入0.3ml維持液，向第1管中加入0.3ml陽(yáng)性血清，混勻后，從第1管中取出0.3ml加入第2管中，混勻后，再?gòu)牡?管中取0.3ml加入第3管中，依次類推。倍比稀釋，共做12個(gè)稀釋度（16，32，64，128，256，512。。。。。），同上表。3.陰性對(duì)照的稀釋：用陰性血清，稀釋同陽(yáng)性血清。4.病毒的稀釋及與抗體的混合：按病毒的CCID50/0.1ml進(jìn)行稀釋，使每0.1ml含100CCID50/0.1ml病毒量。后續(xù)實(shí)驗(yàn)大約需要100CCID50/0.1ml病毒懸液15ml。將滴度為100CCID50/0.1ml病毒懸液加入上述稀釋好的待檢血清、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照的每個(gè)稀釋的試管中：待檢血清：每管加0.5ml陽(yáng)性對(duì)照：每管加0.3ml（2人共用）陰性對(duì)照：每管加0.3ml（2人共用）混勻后置37℃孵箱中作用1h。5.病毒對(duì)照的配制：0.5ml維持液+0.5ml100CCID50/0.1ml?；靹蚝笾?7℃孵箱中作用1h。6.細(xì)胞對(duì)照：1ml維持液。置37℃取出事先準(zhǔn)備好的長(zhǎng)有單層BHK21細(xì)胞的96孔板，吸取其中的培養(yǎng)液，用Hanks液（預(yù)先調(diào)好pH值，加1%雙抗）洗一遍。將上述各稀釋度的待檢血清-病毒混合液（每個(gè)稀釋度加4孔----ABCD）、陽(yáng)性血清-病毒混合液（每個(gè)稀釋度加1孔----E）、陰性血清-病毒混合液（每個(gè)稀釋度加1孔----F）、病毒對(duì)照（加G1～G4）、細(xì)胞對(duì)照（加H1～H4）用微量加樣器分別加入到細(xì)胞培養(yǎng)板各孔內(nèi)，每孔0.2ml。Ab稀釋度116(10-1.2)232(10-1.5)364(10-1.8)4128(10-2.1)5256(10-2.4)6512(10-2.7)71024(10-3.0)820489409610819211163841232768待檢血清ABCD陽(yáng)