白細(xì)胞抗原系統(tǒng)檢測技術(shù)

臨床輸血檢驗(yàn)技術(shù)白細(xì)胞抗原系統(tǒng)檢測技術(shù)學(xué)習(xí)目標(biāo)1.什么是HLA？HLA等位基因的命名應(yīng)遵循哪些原則？HLA-Ⅰ類、Ⅱ類及Ⅲ類基因的結(jié)構(gòu)怎樣？2.掌握PCR-SSP檢測方法的基本原理、特點(diǎn)及其適應(yīng)范圍；掌握HLA分型在移植醫(yī)學(xué)、輸血醫(yī)這和法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用3.

熟悉HLA血清學(xué)分型試驗(yàn)及淋細(xì)胞毒交叉配合試驗(yàn)的原理及質(zhì)量控制HLA復(fù)合體HLA復(fù)合體的遺傳特點(diǎn)單體型遺傳

多態(tài)性遺傳共顯性遺傳復(fù)等位基因連鎖不平衡（linkagedisequilibrium）基因頻率連鎖不平衡現(xiàn)象的可能原因HLA復(fù)合體HLA-I類基因位于6號(hào)染色頂端經(jīng)典HLA-I類基因：包括A、B、C三個(gè)基因座位，編碼三組高免疫性、高度多態(tài)性的HLA-A、HLA-B、HLA-C糖蛋白分子。非經(jīng)典HLA-I類基因：免疫功能關(guān)基因，包括E、F、G、H、J基因座位，編碼免疫性和多態(tài)性均較低的分子HLA復(fù)合體HLA-II類基因位于6號(hào)染色著絲點(diǎn)經(jīng)典HLA-II類基因（DP、DQ、DR）編碼HLA-II類分子；非經(jīng)典的HLA-II類基因（LMP、TAP、DM）為與抗原加工和遞呈有關(guān)的基因。HLA復(fù)合體HLA-III類基因位于II類和I類基因中段經(jīng)典HLA-III類基因編碼產(chǎn)生C4、C2、B因子等HLA復(fù)合體HLA等位基因命名HLA-A*02：101：01：02N連字符基因座位分隔符基因組字段分隔符特異性HLA蛋白編碼區(qū)DNA同義突變非編碼區(qū)DNA差異指示表達(dá)發(fā)生變化HLA復(fù)合體按基因位點(diǎn)的產(chǎn)物分別命名抗原特異性用基因位點(diǎn)后的數(shù)字表示由細(xì)胞學(xué)技術(shù)及淋巴細(xì)胞試驗(yàn)確定的特異性的表示HLA抗原裂解后寬特異性的表示抗原特異性及基因位點(diǎn)之間的表示HLA分子組織分布HLA分子HLA分子分布HLA-Ⅰ類分子廣泛分布在所有有核細(xì)胞表面HLA-Ⅱ類分子主要表達(dá)在如樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等細(xì)胞表面HLA分子也分布在血、尿、唾液及精液中檢出HLA分子淋細(xì)胞毒交叉配合試驗(yàn)HLA血清學(xué)分型試驗(yàn)+補(bǔ)體臺(tái)盼藍(lán)染液抗原與抗體結(jié)合當(dāng)特異性抗體與待檢淋巴細(xì)胞表面HLA分子結(jié)合后，激活補(bǔ)體，使細(xì)胞膜通透性增加或細(xì)胞死亡，加入染料后在顯微鏡下可見結(jié)合補(bǔ)體的細(xì)胞被活性染料著色。分離淋巴細(xì)胞HLA血清學(xué)分型試驗(yàn)待檢淋巴細(xì)胞懸液靜置30-40分鐘兔補(bǔ)體靜置60-70分鐘5%伊紅死細(xì)胞體積大，著黑色，無折光性；活細(xì)胞大小正常，未著色，折光性強(qiáng)，較透亮；微量淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)HLA血清學(xué)分型試驗(yàn)質(zhì)量控制HLA抗原抗體最好選用單克隆抗血清抗體效價(jià)適宜存在劑量效應(yīng)淋巴細(xì)胞要求活性和純度高濃度為2～4×106/mL病理狀態(tài)下HLA可能會(huì)表達(dá)異常孵育溫度和時(shí)間嚴(yán)格掌握孵育時(shí)間最適溫度為20-25℃其他補(bǔ)體染液應(yīng)進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)；用甲醛固定設(shè)置陽性和陰性對(duì)照HLA血清學(xué)分型試驗(yàn)原理PCR—序列特異引物法編碼HLA的基因具有高度的多態(tài)性，每一個(gè)基因座位上有眾多的復(fù)等位基因，而每一個(gè)等位基因都有其各自的DNA序列，因此可用相應(yīng)的序列特異性引物（sequencespecificprimers，SSP）進(jìn)行擴(kuò)增。通過控制PCR反應(yīng)條件，特異性引物僅擴(kuò)增與其相應(yīng)的等位基因，而不擴(kuò)增其他的等位基因。檢測材料PCR—序列特異引物法——以B27檢測為例

1、血樣：0.2mlEDTA抗凝血

2、紅細(xì)胞裂解液

3、白細(xì)胞裂解液

4、PCR混合液PCRbufferHLA-B27SSPTaqdNTPinternalpositivereferenceprimersetc操作流程一、DNA的提取1、取1ml紅細(xì)胞裂解液入血樣管中混勻，裂解紅細(xì)胞;2、離心4000rpm2min;3、重復(fù)步驟1-2兩次，最后用棉簽吸干管壁液體；4、取50ul白細(xì)胞裂解液入上述白細(xì)胞管中混勻；5、將白細(xì)胞管于60℃水浴消化20min；6、取出白細(xì)胞管再于100℃，3-5min，滅活蛋白酶K；7、離心10000rpm2min。上清即為富含DNA的PCR模板。PCR—序列特異引物法——以B27檢測為例操作流程PCR擴(kuò)增1、吸2ul模板DNA入裝有PCR混合液的小管中；2、將小管置于PCR儀內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增。（需80min）

×12×2394oC2min

94oC12sec

65oC1min94oC12sec61oC50sec72oC30sec

37oC10sec

HLA-B27擴(kuò)增程序PCR—序列特異引物法——以B27檢測為例擴(kuò)增產(chǎn)物電泳PCR—序列特異引物法——以B27檢測為例擴(kuò)增產(chǎn)物電泳制膠使用電泳緩沖液在制膠器上配制1.0%的瓊脂糖凝膠?；鞓?μL載樣緩沖液、2μL核酸熒光染料，10μLPCR產(chǎn)物混勻。點(diǎn)樣將上步混好的樣10μL加到凝膠孔中。電泳90V電壓下電泳10~20min。PCR—序列特異引物法——以B27檢測為例結(jié)果觀察HLA-B27(+)標(biāo)本電泳結(jié)果觀察

PCR—序列特異引物法——以B27檢測為例試劑操作：提取DNA最后一步，乙醇要揮發(fā)干凈防止PCR污染質(zhì)量控制PCR—序列特異引物法——以B27檢測為例方法學(xué)評(píng)價(jià)方法評(píng)價(jià)PCR-SSP該方法操作簡單、快速，耗時(shí)較短，結(jié)果判斷簡便，但可能出現(xiàn)漏孔或假性條帶現(xiàn)象，為實(shí)驗(yàn)室最常用方法之一。PCR-SSOP操作較復(fù)雜，耗時(shí)較長，結(jié)果較準(zhǔn)確，部分探針易出現(xiàn)干擾。目前被Luminex檢測技術(shù)所替代。Luminex檢測技術(shù)靈敏度高，操作簡便，快速，結(jié)果較準(zhǔn)確，是目前實(shí)驗(yàn)室中最常用的方法之一。PCR-SBT能夠直接檢測基因的核苷酸序列，屬于高分辨方法，結(jié)果準(zhǔn)確性最高，但需要特殊的儀器設(shè)備，耗時(shí)較長，成本較高?；蛐酒夹g(shù)具有超高速、高通量、低成本和高效益等優(yōu)點(diǎn)，但分型可能存在一定的偏差。PCR—序列特異引物法——以B27檢測為例白細(xì)胞抗原系統(tǒng)檢測的臨床應(yīng)用在移植醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用造血干細(xì)胞移植HLA相合同胞（ＭＲＤ）ＨＬＡ相合非血緣（MUD）單倍體臍體器官移植HLA－AHLA-BHLA-DR白細(xì)胞抗原系統(tǒng)檢測的臨床應(yīng)用在輸血醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用HLA與非溶血性輸血反應(yīng)

(1)臨床輸血中發(fā)熱性非溶血性輸血反應(yīng)多數(shù)是由于HLA抗體破壞白細(xì)胞后釋放出熱源物質(zhì)引起；

(2)表現(xiàn)為頭暈、面紅、惡心、寒戰(zhàn)，體溫可高達(dá)39℃以上，嚴(yán)重者可并發(fā)肺部綜合征，呼吸困難；

(3)采用白細(xì)胞濾器過濾后的血液輸注，非溶血性輸血反應(yīng)明顯減少。白細(xì)胞抗原系統(tǒng)檢測的臨床應(yīng)用在輸血醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用HLA與血小板輸注

(1)30％的HLA抗體陽性者對(duì)隨機(jī)獻(xiàn)血者的血小板輸注無效；

(2)在血小板輸注中HLA抗體的產(chǎn)生很少由血小板引起，多數(shù)由血小板血液中的白細(xì)胞引起；

(3)輸血小板進(jìn)行治療時(shí)，最好測定HLA-A、B抗原，防止由于患者產(chǎn)生針對(duì)血小板膜HLA抗原的抗體。白細(xì)胞抗原系統(tǒng)檢測的臨床應(yīng)用在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用HLA與親子鑒定

(1)由于HLA復(fù)合體的高度多態(tài)性，在無關(guān)個(gè)體間HLA表型全相同的機(jī)率極低，故HLA復(fù)合體被看作是伴隨個(gè)體終生的特異性遺傳標(biāo)記；

(2)借助HLA基因型和（或）表型檢測，可用于法醫(yī)上的個(gè)體識(shí)別，使HLA分型成為鑒定親子關(guān)系的重要手段。白細(xì)胞抗原系統(tǒng)檢測的臨床應(yīng)用想一想1、HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ類分子位于哪些細(xì)胞的表面？2、簡述淋巴細(xì)胞毒交叉配合試驗(yàn)的原理？3、請(qǐng)簡述PCR—SSP法的原理4、簡述HLA與非溶血輸血反應(yīng)的關(guān)系？想一想1．由HLA抗原與HLA抗體引起的輸血不良反應(yīng)是（

）。A．過敏性輸血反應(yīng)B．溶血性輸血反應(yīng)

C．輸血相關(guān)性循環(huán)超負(fù)荷D．輸血相關(guān)性急性肺損傷2．有關(guān)微量淋巴毒試驗(yàn)的特性描述錯(cuò)誤的是