透射電子顯微鏡

透射電子顯微鏡

（TransmissionElectronMicroscopeTEM）

TEM具有和光鏡相似的結構系統(tǒng),由電子槍產生的電子射線作為光源,由電磁透鏡代替光鏡中用玻璃制成的聚光鏡、物鏡和目鏡

TEM鏡體結構相當復雜，鏡筒內部要求高真空狀態(tài)第一頁，共三十二頁。第二頁，共三十二頁。

第一節(jié)透射電鏡結構和工作原理

一、透射電鏡結構二、透射電鏡工作原理★

第二節(jié)透射電鏡樣品制備技術

一、超薄切片技術★二、特殊組織樣品制備第三頁，共三十二頁。第一節(jié)透射電鏡的結構和工作原理照明系統(tǒng)：電子槍、會聚透鏡鏡筒{成像系統(tǒng)：樣品室、物鏡、中間鏡、投影鏡觀察記錄系統(tǒng)：觀察室、底片室真空系統(tǒng)：機械泵、油擴散泵、真空管等輔助{電源系統(tǒng)：高壓電源、透鏡電源、調壓器等水冷系統(tǒng)：循環(huán)水泵等一、透射電鏡的基本結構第四頁，共三十二頁。

（一）電子束與電磁透鏡

＆電子束在真空中運動的速度與加速電壓有關（陽極）加速電壓越高，電子束的波長越短(根據光學阿貝公式原理，一臺儀器的成像最高分辨率，約為它使用信息傳遞媒介波長的一半。電鏡之所以能獲得很高的成像分辨率，是由于它的電子束波長遠較可見光的波長為短）＆電磁透鏡的焦距與磁場（線圈組成，當電流通過時產生磁場）強度有關,磁場越強，焦距越短，放大倍率越高二、透射電鏡的工作原理第五頁，共三十二頁。

（二）電鏡圖像形成

任何物質都是由原子組成的，當均勻的電子束穿過樣品時會受到樣品上信息的處理多數電子可從原子和原子之間的空隙穿過，極少部分電子與原子核和軌道電子發(fā)生碰撞而形成散射電子散射電子能力強的地方透過電子數目少

打在熒光屏上所發(fā)出的光弱，顯現為暗區(qū)

散射電子能力弱的地方透過電子數目多

打在熒光屏上所發(fā)出的光強

顯現為亮區(qū)樣品結構不同散射電子的能力不同，結果？第六頁，共三十二頁。

第二節(jié)透射電鏡樣品制備技術

一、常規(guī)樣品制備技術

超薄切片技術※負染技術

二、特殊樣品制備技術

電鏡酶細胞化學技術免疫電鏡技術電鏡原位雜交技術等

第七頁，共三十二頁。

普通光鏡切片厚度約5μm左右—石蠟切片透射電鏡切片厚度在50nm左右—超薄切片（100nm以下）

目前有關生物體的各種組織、細胞的形態(tài)結構知識大部分是超薄切片技術所提供

一、超薄切片制備技術第八頁，共三十二頁。

取材預固定后固定脫水浸透包埋修塊切片染色

超薄切片技術的基本操作程序第九頁，共三十二頁。

快

盡量保持其生活狀態(tài)，在1分鐘內固定

小1mm3的小塊

輕不要牽拉、鋸、擠壓組織

冷

4℃保存

（一）取材第十頁，共三十二頁。

1、固定目的

把在活體狀態(tài)時的結構盡可能完整保存下來

2、常用固定劑⑴戊二醛（glutaraldehyde）對糖原、糖蛋白、尤其是微管、內質網細胞基質有較好的固定作用

⑵四氧化鋨(osmiumtetroxide,OSO4)對含蛋白質、脂肪性物質有良好的固定作用特別對磷脂蛋白膜的結構有良好的保存作用

（二）固定第十一頁，共三十二頁。⑶高錳酸鉀(potassiumpermangauate)

對磷脂蛋白類有特別良好的固定作用

尤其對神經髓脂質的保護更為顯著⑷甲醛（formaldehyde）

對酶活性的保存卻優(yōu)于戊二醛

在電鏡細胞化學中常采用第十二頁，共三十二頁。

3固定方式

⑴組織塊浸泡固定取數塊1mm3的組織塊迅速浸泡于固定液中

⑵體內原位固定

適用于動物實驗，將動物麻醉解剖，暴露所需的組織或器官，立即用預冷的戊二醛滴到上面直到組織適度變硬，再取數塊組織固定

⑶灌流固定

多用于腦、腎贓、視網膜和睪丸等組織將固定液經血液循環(huán)灌流到動物體內,把活細胞在原位及時固定第十三頁，共三十二頁。

指將樣品內所含的游離水分完全清除的過程(常用的脫水劑為乙醇和丙酮)

50%乙醇10～15分鐘4℃70%乙醇10～15分鐘4℃80%乙醇10～15分鐘4℃

90%乙醇10～15分鐘4℃

100%乙醇3次，每次10分鐘，室溫（三）脫水

第十四頁，共三十二頁。

經脫水處理的樣品，即可用包埋劑進行浸透

浸透利用包埋劑逐步取代樣品中的脫水劑使細胞內外所有空隙都被包埋劑填充包埋浸透好的樣品塊放入灌滿包埋劑的膠囊或適當的模具中經過紫外線照射或加溫聚合，即可制成包埋塊包埋劑環(huán)氧樹脂618、Epon812LowiscrylK4M低溫樹酯包埋劑（四）浸透與包埋

第十五頁，共三十二頁。

（半薄切片的意義：

1、選取超薄切片的部位

超薄切片的面積一般要小于0.5mm2，要經過半薄切片選取有意義的部位（對腎臟、胰腺、腦、肌組織等更重要）

2、對同一部位進行光、電鏡對比觀察

通過半薄切片可以在較大范圍內了解組織結構、病變部位和病理性質，有利于更確切的認識超薄切片中的結構及其相互關系。五、半薄切片第十六頁，共三十二頁。熱膨脹推進式切片機利用金屬桿加熱產生的

微小長度變化提供進給

機械推進式切片機用微動螺旋和微動杠桿

來提供微小進給

超薄切片機(Ultrotome)六、超薄切片第十七頁，共三十二頁?！舭惭b包埋塊、安裝玻璃刀、調整包埋塊和刀的距離、調節(jié)水槽高度與燈光的位置、調節(jié)水槽液面、選擇切片速度及進給厚度、片子切出后，漂浮在水槽的液面上，經展片后撈到載網上

◆判斷切片厚度：一般利用切片表面反射的光和從切片下面反射光發(fā)生干涉所產生的干涉色為依據不同厚度的切片在顯微鏡下呈現不同的干涉色灰色40-50nm

銀灰色50-70nm金黃色70-90nm紫色90nm以上切片操作第十八頁，共三十二頁。

電鏡圖像反差是由于電子束經過樣品時電子散射程度不同產生的

散射的電子數越多，圖像越？散射的電子數越少，圖像越？◆重金屬化合物有較強的電子散射能力,所以經過重金屬染色的樣品呈現較強反差

七、電子染色第十九頁，共三十二頁。常用的染色劑有醋酸鈾和枸櫞酸鉛◆醋酸鈾（Uranylacetate）能與細胞內多種成分結合，尤其對核酸核蛋白等有較強的結合能力◆枸櫞酸鉛(leadcitrate)能提高細胞膜系統(tǒng)及其脂類的反差

第二十頁，共三十二頁。

(一)骨組織樣品制備方法（二）培養(yǎng)細胞樣品制備方法（三）血細胞樣品制備方法（四）石蠟包埋樣品轉制方法二、幾種特殊組織的樣品制備方法第二十一頁，共三十二頁。

1.將新鮮骨組織鋸成2—3mm厚的骨片，立即投入固定液中24小時（4℃）。

2.漂洗后投入脫鈣液中在室溫或4℃下進行脫鈣（正常密質骨脫鈣時間一般為3-4周，松質骨為7-10天，4℃脫鈣時間應適當延長）3.脫鈣后再將樣品修成1mm3大小，然后充分浸泡，再按常規(guī)方法進入后固定、脫水、浸透包埋、半薄、超薄切片和電子染色。(一)骨組織樣品制備方法第二十二頁，共三十二頁。脫鈣液配制乙二胺四乙酸二鈉40-50g雙蒸餾水500ml0.2mol/LNaOH350ml雙蒸餾水加至1000ml第二十三頁，共三十二頁。1、將培養(yǎng)瓶內的培養(yǎng)液倒掉，加入預冷的2.5%戊二醛固定2、用橡皮刮子將全部細胞從管壁上輕輕刮下，收集在離心管內離心（2000轉/分）15-20分鐘3、棄上清，將沉淀的細胞團塊取出，用棉花紙包裹起來，然后進行漂洗等后面的程序二、

培養(yǎng)細胞樣品制備方法第二十四頁，共三十二頁。

負染色技術主要用于細菌、病毒、噬菌體等微生物大分子結構、亞細胞碎片以及分離的細胞器等研究工作

又稱陰性染色，指通過重金屬鹽在樣品四周的堆積而加強樣品外周的電子密度，使樣品顯示負反差，襯托出樣品的形態(tài)和大小三、負染色技術((Negative）

第二十五頁，共三十二頁。

當把有些重金屬的鹽溶液與生物材料的懸浮液混合以后，重金屬的鹽類不是被樣品成分所吸收，而是沉淀到樣品四周如果樣品具有高低不平表面結構，染液還能穿透進表面的凹陷部分。這樣在重金屬元素沉淀的地方，散射電子的能力增強，因而樣品四周表現為暗區(qū)，而在有樣品的地方散射電子能力弱，因而表現為亮區(qū)。這樣便能把樣品的外形與表面結構清楚地襯托出來目前，對其染色原理還不十分清楚，有密度反差原理和異常反差原理二種觀點。

（一）負染技術的原理第二十六頁，共三十二頁。1.染色液目前最常用的為磷鎢酸（Phosohotungstate）配制成2-4%磷鎢酸水溶液磷鎢酸的密度約為4，而生物標本的密度為1外周染料密度與標本密度相差4倍直徑很小的物體可被清晰地顯現出來

2.染色方法負染色所用的樣品全部取自懸浮液將帶有樣品的懸液，滴于有支持膜的銅網上，靜止數分鐘后滴上染液數秒鐘到2分鐘，隨后進行電鏡觀察（二）負染樣品的制備第二十七頁，共三十二頁。

第三章重點

電子槍發(fā)射電子經會聚透鏡會聚成電子束投射在樣品上，電子直接穿透樣品產生透射電子，透射電子帶有樣品信息，經成像系統(tǒng)放大投射到觀察室的熒光屏上，熒光屏將電子影象轉化為可見光影象以供使用者觀察透過的電子多熒光屏亮，反之熒光屏暗，熒光屏的亮、暗程度與樣品微細結構一一對應，最終產生具有一定反差的黑白影像一、透射電鏡工作原理第二十八頁，共三十二頁。

LM

TEM照明源光線電子分辨率0.2μm0.1nm放大1000×150萬×透鏡玻璃磁透鏡應用顯微水平亞顯微水平

二、光鏡和電鏡比較比較第二十九頁，共三十二頁。

快盡量保持其生活狀態(tài)，在1分鐘內固定

小1mm3的小塊

輕不要牽拉、鋸、擠壓組織

冷4℃保存取材→固定→脫水→浸透→包埋→切片→染色

三、取材要領四、超薄切片程序第三十頁，共三十二頁。又稱陰性染色，指通過重金屬鹽在樣品四周的堆積而加強樣品外周的電子密度，使樣品顯示負反差，襯托出樣品的形態(tài)和大小.