檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術及儀器

關于檢驗技術化學發(fā)光和熒光免疫技術及儀器1第1頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月2第一節(jié)化學發(fā)光免疫分析技術第二節(jié)電化學發(fā)光免疫分析第三節(jié)時間分辨熒光免疫分析法第四節(jié)熒光偏振免疫分析法第五節(jié)化學發(fā)光免疫分析的臨床應用內容概述:第2頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月3教學目標和要求

掌握化學發(fā)光免疫分析技術的基本原理、反應的底物和標記方法以及反應類型。

熟悉電化學發(fā)光免疫分析的基本原理和標記物，時間分辨熒光免疫分析法的基本原理及其標記物和螯合物。

了解熒光偏振免疫分析法的基本原理和技術特點，化學發(fā)光免疫分析的臨床應用

第3頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月4第一節(jié)化學發(fā)光免疫分析技術基本原理反應的底物標記方法反應類型相關儀器第4頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月5一、基本原理化學發(fā)光，是指伴隨化學反應過程所產生的發(fā)光的發(fā)射現(xiàn)象。某些物質在進行化學反應時，吸收了反應過程中所產生的化學能，使反應物分子形成電子激發(fā)態(tài)，當電子從激發(fā)態(tài)返回到穩(wěn)定的基態(tài)時，多余的能量就以光子的形式發(fā)射出來。這一現(xiàn)象稱為化學發(fā)光。A+BC*+D,C*C+h第5頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月6(一)產生化學發(fā)光反應的條件和過程化學發(fā)光與熒光的區(qū)別:化學能光能化學發(fā)光反應的條件:反應必須提供足夠的激發(fā)能焓變(△H)介于170～300kj·mol-1之間，才能在可見光范圍觀察到化學發(fā)光現(xiàn)象吸收了化學能后處于激發(fā)態(tài)的分子或原子，必須以光子形式將能量釋放出來，或者將能量轉移到另一種物質的分子上并使該分子激發(fā)，當被激發(fā)的分子回到基態(tài)時，也以光子的形式釋放能量第6頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月7(二)化學發(fā)光效率化學發(fā)光反應的發(fā)光效率(φCl)又稱為化學發(fā)光總能量的產生率φCl取決于生成激發(fā)態(tài)產物分子的化學激發(fā)效率(φCE)和激發(fā)態(tài)產物分子的發(fā)射效率(φEM)。一般化學發(fā)光反應，φCl值約為10-6

第7頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月8(三)強度與反應物質濃度之間的關系反應物的濃度反應速度化學發(fā)光反應所發(fā)出的光的強度第8頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月9(四)化學發(fā)光的反應類型直接化學發(fā)光間接化學發(fā)光1．直接化學發(fā)光化學反應釋放的化學能激發(fā)的是反應產物分子A+BC*+D,C*C+h第9頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月102．間接化學發(fā)光(敏化的化學發(fā)光)在化學反應中，激發(fā)能傳遞到另一個未參加化學反應的分子上，使該分子達到電子激發(fā)態(tài)，再由激發(fā)態(tài)分子返回到基態(tài)時發(fā)光；或反應首先生成一種高能量的中間體，此中間體再將能量轉移給另一個未參加化學反應的分子，使該分子達到電子激發(fā)態(tài)，再由激發(fā)態(tài)分子躍遷回到基態(tài)時發(fā)光的過程。A+BC*+D,C*+FF*+E,F*F+h第10頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月11二、反應的底物(發(fā)光劑或發(fā)光底物)在化學發(fā)光反應中，參與能量轉移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物發(fā)光免疫技術中常用的化學發(fā)光底物:１．氨基苯二酰肼類主要有魯米諾(3-氨基苯二甲酰肼，luminol)和異魯米諾(5-氨基苯二甲酰肼，isolumino1)及其衍生物。2．瞇唑類化合物較常用的是2，4，6-三苯基咪唑，即洛粉堿(lophine)。3．吖啶酯類典型代表是N，N-二甲基二吖啶硝酸酯，即光澤精(1ucigenin)。4．苯酚類化合物其中主要有鄰苯三酚，即焦性沒食子酸。5．芳香草酸酯類主要有雙-(2，4，6，-三氯苯基)-草酸酯(TCPO)和雙-(2，4-二硝基苯基)-草酸酯(DNPO)。6．(金剛烷)-1，2-二氧乙烷及其衍生物

第11頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月12第12頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月13三、標記方法化學標記生物標記化學標記:用于化學發(fā)光(酶)免疫測定直接用發(fā)光物質(如魯米諾、吖啶酯類等)標記抗體或抗原以催化劑(如HRP、GOD等)和／或協(xié)同因子(如ATP、NAD等)標記抗體或抗原按照標記物的應用:第13頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月14按照被標記物的結構或性質:對小分子物質(如甾體激素、藥物等)的標記對大分子抗原、抗體的標記(如蛋白質、核酸等)以及對某些配基和載體的標記第14頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月15按照標記反應的過程和形成結合物的結構特點:直接偶聯(lián)間接偶聯(lián)通過偶聯(lián)反應，使標記物分子中的反應基團直接連接在被標記分子的反應基團上。在標記物與被標記物之間插入一條鏈或一個基團，使兩種物質通過這種引入的“橋”連結成結合物碳二亞胺縮合法、過碘酸鹽氧化法、重氮鹽偶聯(lián)法和混合酸酐法琥珀酰亞胺活化法、O-(羧甲基)羥胺法、異硫氰酸酯衍生物和戊二醛法第15頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月16第16頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月17常用的標記方法1．碳二亞胺（EDC）縮合法此法可用于蛋白質分子中的游離羧基或游離氨基的標記。常用的縮合劑有l(wèi)-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)和二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)直接偶聯(lián)第17頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月18

2．重氮鹽偶聯(lián)法(又稱重氮化法)此法簡易、成本低、重復性好，但不適用于脂肪伯胺基發(fā)光劑，因其生成的重氮鹽不穩(wěn)定，即使在０℃也會生成氮氣。此外，ABEI等伯胺基位于側鏈者也不適用此法。芳香伯胺直接偶聯(lián)第18頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月193．過碘酸鹽氧化法標記物可用發(fā)光劑或催化劑，適用于芳香伯胺或脂肪伯胺發(fā)光劑，標記方法穩(wěn)定標記物不易脫落，但此法不適用于無糖基的蛋白質和含有糖基但氧化后會影響免疫學活性的蛋白質。直接偶聯(lián)第19頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月204．戊二醛法

間接偶聯(lián)芳香伯胺基氨基由于戊二醛在溶液中以單體和聚合體形式存在，后者占多數(shù)，所以在標記反應中雙方分子間構成較大的距離，減少了在抗原抗體反應時的空間位阻；但因偶聯(lián)不易定量控制且缺乏特異性等而未得到廣泛應用雙功能偶聯(lián)劑第20頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月215．琥珀酸酐法(環(huán)內酸酐法)間接偶聯(lián)此法沒有雙功能交聯(lián)劑的不良反應，能實現(xiàn)標記物和蛋白質分子間的單向定量縮合，標記效率高，已有商品化試劑供應。第21頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月226．異硫氰酸酯衍生物法此法標記溫和、穩(wěn)定，獲得的標記物不易脫落，且不損失蛋白質等的生物活性發(fā)光標記物標記物間接偶聯(lián)第22頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月237．O-(羧甲基)羥胺法O--羧甲基衍生物8．混合酸酐法第23頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月24四、反應類型化學發(fā)光免疫分析化學發(fā)光酶免疫分析微粒子化學發(fā)光免疫分析根據(jù)發(fā)光免疫分析中發(fā)光反應的不同體系和標記方法不同第24頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月251.化學發(fā)光免疫分析(chemiluminescenceimmunoassay，CLIA)用化學發(fā)光劑直接標記抗原或抗體,免疫反應后生成標記的免疫復合物,通過啟動發(fā)光試劑(NaOH-H2O2)作用于AE而發(fā)光，發(fā)光強度依賴于免疫反應物中化學發(fā)光劑的濃度。原理:常用化學發(fā)光劑:吖啶酯(acridiniumester，AE)類化合物反應特點:CLIA檢測小分子抗原采用競爭法；大分子抗原則采用夾心法。與大分子的結合不會減小所產生的光量，從而增加靈敏度。強烈的直接發(fā)光在1s內完成，為快速的閃爍發(fā)光。應用:第25頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月261)直接化學發(fā)光使用吖啶酯(AE)作為標記物，無需附加催化劑。AE氧化直接發(fā)光，氧化反應在430nm處快速發(fā)光并在1s內達到峰值。發(fā)光強度是I125在1min內發(fā)光強度的十萬倍，因此系統(tǒng)該具有高速度、產光強等特點。

2)AE有甲基，增加了試劑的穩(wěn)定性，使試劑的穩(wěn)定性好，有效期更長。

3)AE作為化學發(fā)光標記物，對溫度及pH等外界環(huán)境的變化不敏感，故其具有很高的精密度。

4)AE相對分子質量水常小(MW：481)，使其對結合反應的空間位阻作用減少，增加擴散率，提高了靈敏度，可達l0-15mol·L-1。

5)AE是以共價鍵結合抗體而不影響抗體結合抗原的反應，故不影響發(fā)光。

6)AE加堿后，發(fā)光是在一暗盒中進行，其光量值與濃度有著良好的線性關系，且本底較低。吖啶酯的特點第26頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月272．化學發(fā)光酶免疫分析(chemiluminescentenzymeimmnunoassay，CLEIA)采用參與發(fā)光效應的酶作為標記物標記抗體或抗原，免疫反應后形成酶標記抗原抗體復合物，利用魯米諾作為發(fā)光底物在酶和啟動發(fā)光試劑(NaOH-H2O2)的催化下，產生發(fā)光反應，發(fā)光強度依賴于酶免疫反應物中酶的濃度。原理:

底物產物發(fā)光Ag+Ab*Ag-Ab**第27頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月28常用標記物:辣根過氧化物酶(HRP)或ALP反應特點:①標記物常標記抗體；②標記物作為發(fā)光反應的催化劑，本身不發(fā)光。第28頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月293．微粒子化學發(fā)光免疫分析(microparticlechemiluminescenceimmunoassay，MLIA)以順磁性微粒作為載體包被抗體，利用磁性微粒能被磁場吸引，在磁力的作用下發(fā)生力學移動的特性，迅速捕捉到被測抗原。加入堿性磷酸酶標記的第二抗體，形成磁性微粒包被抗體-抗原-酶標記抗體復合物經(jīng)洗滌去掉未結合的抗體后，加入ALP的發(fā)光底物AMPDD，AMPDD被復合物上ALP催化發(fā)光,發(fā)射光所釋放的光子能量被光量子閱讀系統(tǒng)記錄，通過計算機處理系統(tǒng)將光能量強度在標準曲線上轉換為待測抗原的濃度。原理:第29頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月30

AMPDD一側的芳香基團上的磷酸酯被水解，失去一個磷酸基而生成一個中等穩(wěn)定的中間體AMPPD(半衰期2～30min)，此中間體通過內部電子轉移而裂解為一分子的金剛烷酮和一分子激發(fā)態(tài)的間氧苯甲酸甲酯陰離子，當回到基態(tài)時發(fā)出波長為470nm的光)第30頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月31常用標記物:ALP反應特點:①可采用競爭法和夾心法,多采用雙抗體夾心法②采用磁性微粒作為固相載體，以堿性磷酸酶作為標記物，固相載體的應用擴大了測定的范圍,檢測水平可茯Pg·mL-1，重復性好。

第31頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月32五、相關儀器介紹ADVIACENTAUR全自動免疫分析儀第32頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月33(一)ADVIACENTAUR檢測原理利用化學發(fā)光和磁性微粒子分離技術相結合的測定方法，用高敏感性的吖啶酯作為化學發(fā)光標記物，以極細的磁性顆粒(PMP)作為固相載體，提供最大的包被面積。1．液相吖啶酯(AE)。2．固相氧化鐵(Fe2O3)。包被面積大,減少了擴散時間,增加了捕獲效率第33頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月34

(二)ADVIACENTAUR的反應類型

1．雙抗體夾心法第34頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月352．競爭法包括AE標記抗原法和AE標記抗體法。第35頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月363．捕獲法

常用來檢測樣本中的特異性抗體，又稱為抗體捕獲法。試劑中使用了一種抗人免疫球蛋白的抗體?？贵w捕獲法通常使用兩次溫育和洗滌，第一次溫育和洗滌是為了除去樣品中過多的干擾物質；第二次溫育和洗滌是為了檢測樣品中的抗體。第36頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月37第二節(jié)電化學發(fā)光免疫分析電化學發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)是對電極施加一定電壓進行的電化學反應，反應的產物之間或體系中某種組分發(fā)生化學發(fā)光，用普通化學手段測量發(fā)光光譜及強度從而對物質進行痕量分析的一種方法。電化學發(fā)光免疫分析(electrochemiluminescenceimmunoassay，ECLIA)是將ECL和免疫反應(抗原抗體反應)融為一體的標記免疫分析技術,是一種在電極表面由電化學引發(fā)的特異性化學發(fā)光反應.第37頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月38一、基本原理第38頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月39技術特點1．ECLIA為非核素方法，可避免核素的放射性污染2．為均相免疫測定技術，檢測中不需要分離結合相和游離相，操作簡便3．磁性微珠包被技術的應用使檢測的靈敏度更高、線性范圍更寬、反應時間更短。4．標記物Ru

穩(wěn)定性好，室溫下半衰期大于1年，所標記的蛋白活性在2～4℃也可保持1年：以上。5．標記物可進行化學修飾，以形成易于和蛋自、半抗原及核酸等分子結合的活性NHS酯或磷酰胺基團，可用于各種分析物的檢測。6．標記物相對分子質量小，在一個抗體分子上可同時標記許多標記物分子而不影響抗體的免疫學活性，也可用于核酸的標記而不影響探針的雜交活性。7．標記物的再循環(huán)利用使發(fā)光反應的時間更長、發(fā)光強度更高，更易于測定。8．儀器的沒計使操作較為簡便，更易于實現(xiàn)自動化。第39頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月40二、標記物釕的衍生物，分子結構簡單、穩(wěn)定、相對分子質量小、水溶性強、空間位阻小等特點，可與待測物質進行全量反應．使得ECLIA的測定具有高效性與穩(wěn)定性且沒有噪聲干擾。三聯(lián)吡啶釕第40頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月41第三節(jié)時間分辨熒光免疫分析法一、基本原理抗原抗體反應熒光物質標記

時間分辨技術++原理：第41頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月42用三價稀土離子及其螯合劑作為示蹤物(代替熒光物質、放射核素或酶)，通過雙功能基團的螯合劑與蛋白質、多肽、激素、抗體、核酸探針或生物活性細胞以共軛雙鍵結合進行標記，待反應體系(如抗原抗體免疫反應、生物素親和素反應、核酸探針雜交反應、靶細胞與效應細胞的殺傷反應等)發(fā)生后，三價稀土離子螫合物可以在紫外光激發(fā)下，發(fā)出強度高(波長為613nm左右)、持續(xù)時間長(10～l000μs)的熒光，利用延緩測量時間，待樣品中蛋白質等背景熒光完全淬滅后，再測量三價稀土離子螯合物的特異熒光，根據(jù)熒光強度和相對熒光強度的比值，判斷反應體系中分析物的濃度，達到定量分析的目的第42頁，課件共47頁，創(chuàng)作于2023年2月43時間分辨技術消除背景熒光:

在檢測樣品中，含有各種蛋白質和其他化合物，這些物質在較大波長范圍內都可產生自發(fā)熒光,壽命短.

鑭系離子熒光壽命很長（10us～1.0ms），比背景熒光長3～4個數(shù)量級。所以應用熒光的時間分辨技術在背景熒光已經(jīng)降到