枯草芽孢桿菌的分離純化

枯草芽孢桿菌的分離純化枯草芽孢桿菌的分離純化目錄菌種簡介分離步驟生理生化鑒定發(fā)酵條件的優(yōu)化脂肽類抗生素的提取——酸沉淀法脂肽類抗生素的HPLC定量檢測討論枯草芽孢桿菌的分離純化菌種簡介

無莢膜，周生鞭毛，革蘭氏陽性菌，有芽孢，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，需氧菌?？衫玫鞍踪|(zhì)、多種糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中。枯草芽孢桿菌的分離純化

枯草芽孢桿菌在自然生長和發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生的脂肽類抗生素具有很強的抗真菌、病毒、腫瘤、支原體活性，在防治植物病害上具有廣闊的應(yīng)用前景?？莶菅挎邨U菌的分離純化分離原理芽孢桿菌能產(chǎn)生芽孢，在沸水中加熱不會失去生理活性，但是不能產(chǎn)生芽孢的細菌會失去活性，因而得到芽孢菌屬，經(jīng)過進一步的分離及生理生化鑒定得到枯草芽孢桿菌?？莶菅挎邨U菌的分離純化分離步驟（1）土樣的采集：取土壤表層5-10cm下的肥土100g左右，把采得的土壤放入紙袋帶回實驗室分離。枯草芽孢桿菌的分離純化（2）平板的制備：溶化三角瓶中的牛肉湯蛋白胨培養(yǎng)基，以每皿20ml左右倒6個平板?？莶菅挎邨U菌的分離純化（3）稀釋分離法：稱取土壤5g放入含有45ml水的三角瓶中，搖動片刻，然后將此瓶用小火加熱至懸濁液沸騰，維持15min。而后靜止5min，吸取上層液0.1ml加入到含有4.5ml無菌水的試管中，制成1:100濃度的懸液，然后吸取土壤懸濁液0.2ml滴加到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，用涂布棒均勻涂布，并將培養(yǎng)基倒置于37℃恒溫培養(yǎng)1-2天?？莶菅挎邨U菌的分離純化（4）挑菌及純化：從上述分離的平板上分別挑取單菌落中部分菌體，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上劃線純化。（菌體應(yīng)呈桿狀，具芽孢，寬度一致；菌落顏色、形狀、質(zhì)地、透明度等均一致）枯草芽孢桿菌的分離純化生理生化鑒定一過氧化氫酶測定將測試菌種接種于肉湯瓊脂斜面上，培養(yǎng)1—2天。取一載玻片，在上面加一滴3—10%的過氧化氫，挑取一環(huán)菌苔，在過氧化氫溶液中涂抹，若有氣泡（氧氣）出現(xiàn)為陽性，無氣泡者為陰性。枯草芽孢桿菌的分離純化二需氧性試驗原理：不同種類的芽孢桿菌對氧氣的需求性常有差異，因此本實驗可作為鑒定芽孢桿菌的一個較重要指標。操作步驟：菌液穿刺接種到上述培養(yǎng)基中，一般于培養(yǎng)3—7天觀察結(jié)果。若芽孢桿菌在瓊脂柱表面生長為好氧菌，沿著穿刺線上生長者為厭氧菌或兼性厭氧菌枯草芽孢桿菌的分離純化三、乙酰甲基甲醇實驗原理：有些芽孢桿菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸，并將產(chǎn)生的酸進一步轉(zhuǎn)化為中性化合物，如乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在堿性環(huán)境中可被氧氣成二乙酰，后者與蛋白胨中精氨酸所含的胍基起作用，生成紅色化合物，即表示試驗陽性。若在培養(yǎng)基中加入少量肌酸以補充胍基，可加速反應(yīng)。培養(yǎng)基：蛋白胨5g，葡萄糖5g，NaCl5g，蒸餾水1000ml。調(diào)節(jié)PH6.5，每管分裝4—5ml，0.06MPa（8lbf/in2）30min滅菌步驟：將芽孢桿菌測試菌接種于上述培養(yǎng)液中，一般于30攝氏度培養(yǎng)4天，取培養(yǎng)液（約2ml）和等量的40%NAOH相混合，加少量肌酸（約0.5—1mg），充分振蕩，2—5min后如培養(yǎng)液呈紅色，即為試驗陽性?？莶菅挎邨U菌的分離純化四淀粉水解原理：許多芽孢桿菌產(chǎn)生淀粉酶，能將培養(yǎng)基中的淀粉水解，淀粉水解后，遇碘不再變藍色。培養(yǎng)基：在肉湯瓊脂中添加0.2%的可溶性淀粉，分裝于三角瓶。0.1MPa(15lbf/in2)20min滅菌備用。步驟：將培養(yǎng)基做成平板，凝固后取菌種點種于平板上（每皿點種2點），一般于30攝氏度培養(yǎng)2—4天，形成菌落后，在平板上滴加碘液，以鋪滿菌落為度，平板呈藍色，而菌落周圍如有無色透明圈出現(xiàn)，說明淀粉被水解，透明圈的大小，可表明水解能力的大小。枯草芽孢桿菌的分離純化經(jīng)生理生化鑒定，確定是芽孢桿菌屬純種后，從中選擇一株轉(zhuǎn)接于牛肉膏蛋白胨斜面上，置37℃培養(yǎng)1-2天后備用枯草芽孢桿菌的分離純化發(fā)酵條件的優(yōu)化將純化的菌種轉(zhuǎn)接至LB平板上,37℃培養(yǎng)24h,用接種環(huán)取活化菌種,接種于100mlLB液體培養(yǎng)基,30℃、200r/min培養(yǎng)24h作為種子菌?？莶菅挎邨U菌的分離純化發(fā)酵過程中采用單因素試驗方法,考察不同培養(yǎng)溫度(26、28、30、32、34、36℃)、培養(yǎng)時間(26、32、38、44、50、80h)、接種量(1%、2%、3%、5%、10%)、初始pH值(5、6、7、8、9)、培養(yǎng)基(Landy培養(yǎng)基、Landy修飾培養(yǎng)基Ⅰ、Landy修飾培養(yǎng)基Ⅱ、LB培養(yǎng)基、無機鹽培養(yǎng)基)對脂肽類抗生素產(chǎn)量的影響?？莶菅挎邨U菌的分離純化結(jié)果表明,最佳培養(yǎng)條件為Landy培養(yǎng)基,初始pH7·0,接種量3%,發(fā)酵培養(yǎng)溫度30℃,發(fā)酵時間38h?？莶菅挎邨U菌的分離純化脂肽類抗生素的提取——酸沉淀法培養(yǎng)結(jié)束后,7000r/min離心10min,取上清，加HCl調(diào)節(jié)pH為5·0、4·5、4·0、3·5、3·0、2·5、2·0,7000r/min離心10min,收集沉淀。將沉淀在60℃的烘箱中干燥18h,稱重即為脂肽類抗生素粗提物的干重。比較不同pH條件下沉淀的干重,以確定完全沉淀脂肽類抗生素所需的最佳pH值?？莶菅挎邨U菌的分離純化脂肽類抗生素的HPLC定量檢測將脂肽類抗生素粗提物過SephadexLH-20層析柱，每管收集液分別經(jīng)真空干燥后,加入0·2ml乙醇溶解。對每管乙醇溶液進行平板抑菌試驗,試驗真菌為油菜菌核病菌,將具有抑菌活性的收集液合并在一起,用離心濃縮儀濃縮至完全干燥,即為脂肽類抗生素的干重。枯草芽孢桿菌的分離純化討論

枯草芽孢桿菌脂肽類抗生素在防治植物病害上