上海市臨檢中心 分子診斷在無創(chuàng)產(chǎn)前篩查和個性化診療中的應用

呼吸道病原體分子檢測技術(shù)的進展與應用一、呼吸道感染與實驗室診斷二、常見分子檢測技術(shù)簡述三、呼吸道感染分子檢測技術(shù)進展四、呼吸道感染分子檢測新技術(shù)的臨床實踐林勇平lin_y_p@2019-2-26呼吸道感染???急性呼吸道感染是常見的臨床感染癥狀，尤其是嬰幼兒和老人呼吸道感染的病原體種類繁多多病原體混合感染一、呼吸道感染與實驗室診斷＜1歲、1～3歲、3～6歲和≥6歲組病毒陽性患兒中檢出2種以上病毒的比例分別為38.2％、36.4％、30.2％和15.2％?????不同年齡患者感染的病原體不同病原體感染具有季度和月度差異每年兒童大約被感染6-9次，青少年和成人大約2-4次呼吸道病原體的快速檢測可使醫(yī)生合理選擇治療方案，并減少抗生素的使用多項中心研究顯示，我國成人社區(qū)獲得性肺炎CAP患者中病毒檢出率為15%-34.9%呼吸道感染呼吸道感染的實驗室診斷?呼吸道感染，尤其在兒童中為常見的疾病，可導致輕微咽喉炎，或發(fā)展為重癥肺炎甚至導致死亡。?病原體的培養(yǎng)與鑒定?據(jù)2000年至2013年全球兒童死亡率分析顯示，肺炎位居5歲以下兒童死亡原因的前三位。?呼吸道病毒抗原的檢測?呼吸道病毒及肺炎支原體為常見的呼吸道感染病原。?快速

、準

確、全面檢出各種病原體，利于疾病及時診療。?呼吸道病原體血清抗體的檢測?病原體核酸的檢測（熒光定量PCR）LiL,Oza,S,HoganD,etal.Global,regional,andnationalcausesofchildmortalityin

2000-2013,withprojectionstoinformpost-2015priorities:anupdatedsystematicanalysis.TheLancet,2015;385,9965,371-379.?病原體培養(yǎng)與鑒定陽性可作為確診依據(jù)；是發(fā)現(xiàn)新病毒的重要技術(shù)手段特異性良好，成本低，對實驗室硬件要求低但耗時耗力，難以應用于臨床早期診斷和指導治療；一些病毒條件苛刻，難以培養(yǎng)?病原體抗原的檢測二、常見分子檢測技術(shù)簡述七項呼吸道病毒檢測試劑盒(免疫熒光法,

DFA)（腺病毒，呼吸道合胞病毒，甲型、乙型流感病毒，I、II、III型副流感病毒）?病原體血清抗體的檢測中和試驗、補體結(jié)合試驗和血凝-血凝抑制試驗等，敏感度、特異度較差；易出現(xiàn)假陽性和假陰性；血清特異性抗體檢測對早期診斷意義有限。九項呼吸道感染病原體IgM抗體檢測試劑盒(免疫熒光法,

IFA)（嗜肺軍團菌血清1型、肺炎支原體、Q熱立克次體、肺炎衣原體、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒1、2和3型）核酸擴增技術(shù)PolymeraseChainReaction(PCR)?Thermocycling

based–

PCR

(Polymerase

Chain

Reaction,

Roche

Diagnostics)?

Reverse

Transcription-PCR

("RT-PCR")?

Pre-Post

versusReal-Time

PCR?

Multiplex

PCR?

Nested

PCR?

On-Array-PCR?

Digital

PCR–

LCR

(Ligase

Chain

Reaction,

Abbott

Laboratories)-MLPA

(Multiplex

Ligation-dependent

probe

amplification)??Isothermal

techniques–

NASBA

(Nucleic

Acid

Squence

BasedAmplification–

RCA

(RollingCircleAmplification)–

RPA

(Recombinase

Polymerase

Amplification)–

SDA

(Strand

Displacement

Amplification)–

LAMP

(Loop-mediated

isothermal

amplification)Signal

Amplification–

bDNA

(BranchedDNA,

Bayer?Siemens)實時熒光定量PCR（RFQ-PCR）水解探針技術(shù)TaqMan5`-3`Exonuclease熒光標記探針實時熒光定量PCR（real-timefluorenscencequantitative

PCR)是指在

擴增周期每個時間點（通常是每個循環(huán)結(jié)束后），通過檢測熒光強度對PCR過程中產(chǎn)物量進行實時監(jiān)測，并根據(jù)標準曲線算出PCR的初始模板量。ThresholdfluorescencelevelThresholdcyclesforeach

sample一代測序(Sanger法)一代測序(Sanger法)高通量基因測序技術(shù)高通量基因測序技術(shù)ADNA123456WashIonSpheres10min.(5min.hands-on)一次性對幾百萬到百億條DNA分子進行并行測序，又稱為下一代測序技術(shù)，其使得可對一個樣品的DNA序列進行深入、細致、全貌的分析，所以又被稱為深度測序。BCDEAssembleemPCRrxn30min.(30min.hands-on)CompatibleLibraryPrepAgitateinUltraTurrax5

min.(1min.hands-on)TemplatePrepSequencinDistributeintoPCRtubesandcycle3

hours.(20min.hands-on)NextGenerationSequencing（NGS）High-throughputSequencingDeepSequencingBreakemulsion55min.(30min.hands-on)Enrichment50min.(25min.hands-on)CompatibleFASTQDTotalProcessingTime~5.5hours*Hands-OnTime~110min.NGS:一次性對多個靶向進行檢測，操作復雜，步驟繁多宏基因組學宏基因組學的應用?宏基因組學(Metagenomics)是將環(huán)境中全部微生物的遺傳信息看作一個整體,研究微生物與自然環(huán)境或生物體之間的關系。宏基因組學挖掘新的活性物質(zhì)分析特定環(huán)境中的微生物群落?研究對象是特定環(huán)境下所有生物遺傳物質(zhì)的總和，它包含了可培養(yǎng)的和不可培養(yǎng)的微生物的基因總和。發(fā)現(xiàn)新的病原體解釋未知病因?熱點：細菌和病毒宏基因組學宏基因?qū)W分析方法的比較宏基因組學分析技術(shù)的比較傳統(tǒng)方法基于NGS的方法樣品的處理無需建立文庫，兩端加測序接頭文庫擴增樣品的處理PCR擴增遺傳物質(zhì)的分離與富集構(gòu)建文庫遺傳物質(zhì)的分離與富集構(gòu)建測序文庫宏基因組學文庫的篩選高通量測序低通量并行測序高通量序列分析生物信息學分析Sanger測序高通量測序病原微生物常規(guī)檢測技術(shù)的瓶頸大量的微生物不能被單獨純培養(yǎng)，無法進行分離研究。培養(yǎng)方法往往只針對某種微生物，無法同時對所有微生物完成檢測三、呼吸道病原體感染分子檢測技術(shù)進展（多重病原體感染快速分子檢測）四大瓶頸PCR法必須基于基因序列，對于未知序列的微生物無法檢測。微生物的相互作用復雜，需作為整體研究商業(yè)化的自動化核酸檢測產(chǎn)品?

“十三五”科技規(guī)劃體外診斷產(chǎn)品明確提出要“突破微流控芯片、單分子檢測、自動化核酸檢測等關鍵技術(shù)，開發(fā)全自動核酸檢測系統(tǒng)，…”?

目前世界上已經(jīng)商業(yè)化的從樣本處理、核酸提取至擴增檢測為一體的自動化分析儀–BioFire–Cepheid

geneXpert,InfinityHologic)

TigersandPantherFilmArray?北京市食藥局9月5日發(fā)布的《聚合酶鏈反應（PCR）檢驗實驗室檢查要點指南（2016版）》在第二條“檢查要點”中明確提出–GenProbe（–原則上PCR檢驗實驗室應當設置以下區(qū)域：試劑儲存和準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)。若使用實時熒光定量PCR儀且不需要進行后續(xù)產(chǎn)物分析工作，擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)可合并。若使用樣本處理、核酸提取及擴增檢測為一體的自動化分析儀，則標本制備區(qū)、擴增區(qū)、擴增產(chǎn)物分析區(qū)可合并。–羅氏

cobasLiat–Alere

q–博暉創(chuàng)新HPV檢測芯片2019-2-15商業(yè)化的自動化核酸檢測產(chǎn)品提高檢測效率一般分子實驗室流程美國Cephied

（賽沛）最近被美國丹納赫以40億美元收購美國BioFire2013年被法國生物梅里埃以50億5h美元收購床旁化的分子檢測平臺美國Alereq1.5h羅氏cobasLiat一體化核酸檢測技術(shù)FilmArray呼吸道病原檢測平臺BioFire的產(chǎn)品有多層結(jié)構(gòu)和微型PCR反應器1.5小時內(nèi)完成核酸制備、擴增、檢測步驟，操作簡便，減少污染機會博暉的微流控芯片一次成型，生產(chǎn)工藝簡單，成本遠低于其它非微流控器件賽沛采用傳統(tǒng)的閥門結(jié)構(gòu)核酸提取和制備核酸擴增產(chǎn)物檢測FilmArray

的原理擴增曲線適合定量分析

熔解曲線適合定性分析非特異性產(chǎn)物的熔解溫度不同于待測產(chǎn)物樣本裂解、提純、擴增、檢測一步到位！操作簡單的測試條準備工作只需要2分鐘手工操作溶解緩沖液。3.

將樣本緩沖液加入到樣本制備管中。將FilmArray測試條安放于儀器內(nèi)。樣本裂解、提純、擴增、檢測一步到位！自動化結(jié)果分析?????所有靶標都重復測試3次三次測試中，2個以上陽性才會判讀為陽性熔解曲線峰值必須處于正確溫度區(qū)間重復測試的熔解曲線峰值必須高度一致內(nèi)控必須正確(RNAprocessandPCR2)65分鐘運行時間8.

FilmArray儀器測試每個小孔中產(chǎn)物的熔解曲線，以判斷是否存在待測產(chǎn)物。Bordetellapertussis上呼吸道感染(RP)測試條自動判讀結(jié)果病毒(17種):?FilmArray軟件處理數(shù)據(jù)，對于數(shù)據(jù)中每個結(jié)果信息都進行判讀，從而生成明了易讀的檢測報告。腺病毒副流感病毒1型副流感病毒2型副流感病毒3型副流感病毒4型呼吸道合胞病毒冠狀病毒229E冠狀病毒HKU1冠狀病毒OC43冠狀病毒NL63人類偏肺病毒人鼻病毒/腸病毒甲型流感病毒甲型流感病毒H1亞型甲型流感病毒H1-2009亞型甲型流感病毒H3亞型乙型流感病毒細菌(3種):百日咳桿菌肺炎衣原體肺炎支原體胃腸道疾病(GI)測試條血流感染(BCID)測試條細菌(7種):彎曲菌屬原生動物(4種):隱孢子蟲革蘭陽性細菌(8種):腸球菌屬產(chǎn)單核細胞李斯特菌葡萄球菌屬金黃色葡萄球菌鏈球菌屬B族無乳鏈球菌A族釀膿鏈球菌肺炎鏈球菌革蘭陰性細菌(11種):鮑曼不動桿菌腸桿菌科細菌陰溝腸桿菌復合群大腸埃希菌產(chǎn)酸克雷伯菌肺炎克雷伯菌變形桿菌真菌(5種):白假絲酵母光滑假絲酵母克柔假絲酵母近平滑假絲酵母熱帶假絲酵母難辨梭菌(毒素A/B)類志賀鄰單胞菌沙門菌屬環(huán)孢子蟲溶組織內(nèi)阿米巴蘭伯氏賈第鞭毛蟲弧菌屬霍亂弧菌病毒(5種):F組腺病毒40/41星狀病毒諾沃克病毒GI/GIIA群輪狀病毒札幌病毒小腸結(jié)腸炎耶爾森菌粘質(zhì)沙雷菌致瀉大腸埃希菌/志賀菌(6種):腸道聚集性的大腸埃希菌腸道致病性的大腸埃希菌腸道毒性的大腸埃希菌大腸埃希菌O157產(chǎn)類志賀毒素的大腸埃希菌志賀菌、腸侵性的大腸埃希菌流感嗜血桿菌腦膜炎奈瑟菌銅綠假單胞菌耐藥基因(3種):mecAVan

A/BKPC腦炎

/

腦膜炎測試條WHO與FIND共同支持研發(fā)出XpertMTB/RIF細菌(6種):大腸埃希菌流感嗜血桿菌病毒(7種):巨細胞病毒腸病毒工作流程?

直接檢測痰或痰沉淀?

操作簡單，僅需1個步驟的準備工作?

獲得結(jié)果的時間

110min?

不需要生物安全柜?

內(nèi)設質(zhì)控產(chǎn)單核細胞李斯特菌腦膜炎奈瑟菌無乳鏈球菌單純皰疹病毒1型單純皰疹病毒2

型人皰疹病毒6型肺炎鏈球菌副腸孤病毒屬水痘帶狀皰疹病毒性能?

對結(jié)核分枝桿菌特異性敏感性與培養(yǎng)相似?

通過rpoB

基因檢測利福平耐藥真菌(1種):新型隱球菌neoformans/gattii產(chǎn)品和系統(tǒng)設計?

GeneXpert

系統(tǒng)的獨立檢測模塊GeneXpert?

測試模塊的可擴增性?

對非結(jié)核實驗室專業(yè)人員也僅需要1天的培訓GeneXpertMTB/RIF

檢測GeneXpert模塊??兩小時內(nèi)能同時檢測結(jié)核分枝桿菌及其對利福平耐藥性對于診斷結(jié)核病，包括合并HIV感染的結(jié)核病，比涂片鏡檢更加敏感.其敏感度和固體培養(yǎng)接近柱塞桿馬達主板??不會檢測非結(jié)核分枝桿菌

(NTM)，不像涂片鏡檢使用可以檢測多種疾病的GeneXpert平臺,

可以在低級別的實驗室及衛(wèi)生保健中心應用I-CORE試劑盒裝載倉室閥驅(qū)動馬達超聲變幅器Cepheid公司基于Xpress快速診斷技術(shù)，Xpert

XpressFlu和Xpert

XpressFlu/RSV的兩個分子診斷產(chǎn)品，

2017年通過FDA批準，可在30分鐘內(nèi)獲得診斷結(jié)果。操作程序一覽1混合2加入4檢測3插入Filmarray在兒童呼吸道感染（RTI）患者病原體檢測的應用實踐研究目的四、呼吸道感染分子檢測新技術(shù)的臨床實踐?

分析兒童呼吸道感染患者中感染病原體的種類、病原體混合感染的狀況。?

探討在同一患者上呼吸道與下呼吸道中病原體的檢出情況及相互關系。呼吸道感染患兒病原體的檢出情況研究方法病例：2016年2月至10月；在廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院兒科，年齡小于14歲、被診斷為呼吸道感染患者共55例。?對55

NPS

RV進行

種呼吸道病原檢測，檢出率最高為份18，其余根據(jù)檢出率從高到低依次為MP、RSV、ADV、PIV3、NL63、IFA、IFB、PIV1、PIV4、BP。??混合感染在兒童呼吸道病原感染中占53.7%。樣本：共從55例患者中采集得55份鼻咽拭子（NPS），其中30例患者在采集鼻咽拭子時，同時采集肺泡灌洗液（BALF）。MP在2歲以上兒童中檢出率高于2歲以下兒童(P<0.05)；RSV在2歲以下兒童中檢出率高于2歲以上兒童(P<0.05)。方法：以Filmarray及實驗室自建熒光定量PCR方法共同檢測NPS及BALF中的18種呼吸道病原體，結(jié)果不相符的樣本以巢式PCR方法進行檢測。2歲以下兒童較2歲以上兒童更易感染呼吸道病原，混合感染在各年齡段檢出率未見統(tǒng)計學差異。?da

Silva,E.R

etal.Severe

lowerrespiratorytractinfection

in

infantsandtoddlersfrom

a

non-affluentpopulation:viraletiologyandco-detectionasriskfactors.BMCInfect.Dis.

2013,13,

41;Principi,N.;Esposito,S.

Mycoplasma

pneumoniae

and

Chlamydia

pneumoniae

cause

lowerrespiratorytractdiseaseinpaediatricpatients.Curr.Opin.Infect.Dis.

2002,

15

(3),295–300.PathogensinNPSfromchildrenwithRTIdetectedbyFilmarrayDetectionratesfor11pathogensin

childrenagedlessthan2

yearsandthoseagedover2

yearsUnder2yearsold

2to6yearsold(n=26)

(n=20)22(84.6%)

14(70.0%)7to14yearsoldTotal(n=9)5(55.6%)3(60.0%)2(22.2%)4(44.5%)0(0.0%)2(22.2%)0(0.0%)0(0.0%)0(0.0%)0(0.0%)0(0.0%)0(0.0%)0(0.0%)0(0.0%)0(0.0%)(n=55)Pathogenpositive41(64.5%)Co-infectedcasesRV11(50.0%)12(46.2%)2(7.7%)7(26.9%)2(7.7%)5(19.2%)3(11.5%)3(11.5%)2(7.7%)1(3.8%)1(3.8%)1(3.8%)1(3.8%)1(3.8%)8(57.1%)7(35.0%)10(50.0%)0(0.0%)3(15.0%)1(5.0%)2(10.0%)0(0.0%)0(0.0%)0(0.0%)0(0.0%)0(0.0%)0(0.0%)0(0.0%)22(53.7%)21(38.2%)16(29.1%)7(12.7%)7(12.7%)6(10.9%)5(9.1%)3(5.5%)2(3.6%)1(1.8%)1(1.8%)1(1.8%)1(1.8%)1(1.8%)MP*RSV*ADVPIV3NL63IFAH1N1H3N2IFBPIV1PIV4BP*Havingsignificantdifferencebetweengroupsofunder2yearsoldandgroupof2to6or7

to14

yearsoldby

thechi-quaretest(P<0.05).Pathogensdetectedin

multi-analyte-positive

NPSsamplesby

Filmarray呼吸道感染患兒上、下呼吸道標本的病原體檢測結(jié)果Analyte1Analyte2Analyte3Analyte4No.

ofcases(%)RVRVRVRVRVRVRVRVRVRVMPMPMPRSVMP5(22.7)1(4.5)3(13.6)1(4.5)1(4.5)1(4.5)1(4.5)1(4.5)1(4.5)1(4.5)2(9.1)2(9.1)1(4.5)1(4.5)MPPIV3ADVRSVRSVPIV3PIV3PIV3PIV4NL63ADVNL63NL63PIV330NPS

BALF

23樣本的檢測結(jié)果，

例例患者的及（

76.6%）患者NPS病原可覆蓋BALF中檢出的病原PIV3，其中16例（53.3%

）患者NPS與BALF中病原完NL63PIV1全一致，表明在上、下呼吸道標本中檢出的病原體具有較高的一致性。BPIFA(H1N1)Clinical

characteristicsof

55childrenhavingNPSdetectedby

FilmarrayPathogensin

NPSandBALFdetectedbyFilmarrayPatient

In

NPSInBALFPatientIn

NPSInBALFNo.(%)detectedby

FilmarrayCharacteristicsP

valueSI(n=19)32.6±35.818(94.7)18(94.7)6(31.6)CI(n=22)35.8±31.722(100.0)21(95.5)3(13.6)1RV,PIV3RV,NL63RV,MPMPRV,PIV3RV,

NL63RV,MPMP161718192021222324252627282930NegativeMP,ADVRV,ADVRV,MP,PIV3NL63,MPRV,

PIV4RV,NL63,PIV3MP,ADVRV,

RSVMPNegativeMP2Meanage(month)FeverP>0.05P>0.05P>0.05P>0.05P>0.05P>0.05P>0.05P>0.053RV4RV,MPMPCough5MPMPNasalobstructionRhinorrhoea6RSVRSVRV7(36.8)3(13.6)7RSVRSVRV8RVRVMPDyspnea10(52.6)13(68.4)16(84.2)8(36.4)9RVRVRV,

RSV,MPMP,NL63RV,ADVRSV,BPADV,MPMPShortnessofbreathDiagnosedaspneumonia9(40.9)101112131415RV,ADVNegativeNegativeNegativeNegativeNegativeRV,ADVNegativeNegativeNegativeNegativeNegative21(95.5)RVRSVSeverepneumoniaPleuraleffusionComplication6(31.6)2(10.5)0(0.0)4(18.2)3(13.6)1(4.5)P>0.05P>0.05P>0.05ADVNegativeNegativePIV3SI:single-pathogeninfections

，

CI:co-infections.SampleswithinconsistentresultsdetectedbyFilmarray,real-time

PCRandverificationbynestedPCRNo.SampletypeByFilmarrayByreal-timePCRVerificationbynestedPCR1NPSNPSNPSNPSNPSNPSNPSNPSNPSNPSNPSBALFBALFBALFNegativeNegativeRV,RSV,PIV3RSV,PIV3RV,MPH3N2,IFBIFBH3N2,IFBIFB?

85例呼吸道樣本（55份NPS和30份BALF）經(jīng)FilmArray與熒光定量PCR檢測，71例（83.5%）樣本的結(jié)果一致；14例樣本的結(jié)果不一致。23RV,RSVPIV3RV,RSVPIV3MP45MP6RVNegativeRVNegativeRV?14例結(jié)果不一致的樣本以巢式PCR方法檢測，2例標本結(jié)果與Film

Array一致，使Film

Array與PCR結(jié)果一致率達85.9%。7RV,ADVRV,PIV4ADV,MPRV,ADVRSV8RVRV9MPMP1011121314RVRVNegativeNegativeRVRSVRSVRSVRV,ADVRV,RSV,MPRVRV,RSVRV,RSV宏基組學生物信息學分析流程兒童重癥肺炎宏基因組學病原體檢測的實踐?

標本下機數(shù)據(jù)：總Reads與人類基因組比對比對軟件（基于Linux平臺）BWABowtie1.

9份BALF標本采集自重癥肺炎患兒,

其中病例9和病例10取自同一患兒，時間相隔一周。2.

1份BALF標本取自骨髓移植術(shù)后發(fā)生GVHD反應的患兒。去除宿主reads，得到非人源reads集合適用于將段序列比對至核酸序列數(shù)據(jù)庫?

技術(shù)路線重癥肺炎患兒BALF標本與病原基因組數(shù)比對

序列組裝（基于Linux平臺）VelvetSoapDenovo提取核酸常規(guī)分離培養(yǎng)與鑒定病原序列組裝MEGA

5.0GATK基因功能、SNP、進化、同源性分析等宏基因組分析多重PCR檢測（SISPA+

16S

rRNA

+

ITS）10例BALF標本宏基因組學分析結(jié)果數(shù)據(jù)分析病毒A病例病毒細菌真菌無其他臨床診斷病毒B病毒C12腺病毒-7腺病毒-7惡臭假單胞正常菌群肺炎支原體

重癥肺炎熱帶假絲酵母無無重癥肺炎重癥肺炎比對腺病毒-7、副流感病毒345大腸桿菌無無無組裝副流感嗜血桿菌、鼻疽諾卡氏菌人偏肺病毒無無重癥